《Translational Oncology》：HAUS5 defines a mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase-dependent epithelial–mesenchymal plasticity program and therapeutic vulnerability to Belinostat in clear cell renal cell carcinoma
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肾细胞癌（RCC）是肾脏最常见的恶性肿瘤，位居美国诊断频率最高的十大癌症之列。预计到2026年，美国将新增80,450例RCC病例和15,160例RCC相关死亡。值得注意的是，约三分之一的RCC病例在晚期才被诊断，此时对当前标准治疗干预的反应仍不理想。透明细胞
肾细胞癌（RCC）是肾脏最常见的恶性肿瘤，位居美国诊断频率最高的十大癌症之列。预计到2026年，美国将新增80,450例RCC病例和15,160例RCC相关死亡。值得注意的是，约三分之一的RCC病例在晚期才被诊断，此时对当前标准治疗干预的反应仍不理想。透明细胞肾细胞癌（ccRCC）是主要的组织学亚型，占所有RCC病例的75–85%。目前，ccRCC领域仍缺乏准确的早期诊断标志物和可靠的预后评估指标。HAUS5，也称为Dgt5或KIAA0841，是HAUS家族的成员，定位于间期中心体和有丝分裂纺锤体微管。多项研究表明，HAUS5的异常表达导致有丝分裂指数升高、异常纺锤体比例显著增加和中心体碎裂，从而促进肿瘤发生。此外，HAUS5的失调与多种恶性肿瘤的发生和进展相关，如乳腺癌和肝细胞癌。上皮–间质转化（EMT）是肿瘤侵袭和转移的关键驱动因素，在此期间上皮细胞失去极性和黏附，E-cadherin下调，vimentin和N-cadherin上调，并获得侵袭性间质特征。MAPK通路是细胞内信号转导的核心，介导细胞外刺激，ERK1/2为其核心效应器。ERK1/2磷酸化转录因子（如Snail、Twist），触发这些EMT变化。因此，ERK驱动的EMT促进转移并赋予放疗和化疗耐药性。靶向该通路以逆转EMT是改善癌症治疗的有前景策略。组蛋白去乙酰化酶（HDACs）是肿瘤细胞增殖、存活和表型可塑性的重要表观遗传调节因子。先前在肾癌中的研究表明，HDAC抑制可抑制肿瘤细胞生长和存活并调节EMT相关的细胞可塑性。特别是HDAC1和HDAC2与肾癌细胞生长和存活有关，而抑制I类HDACs已被报道干扰EMT相关和转移相关过程。此外，对透明细胞肾细胞癌中HDAC家族成员的系统分析表明，几种HDAC亚型（包括HDAC8、HDAC10和HDAC11）具有潜在的预后和生物学相关性。Belinostat是一种泛HDAC抑制剂，作用于锌依赖性HDACs，已在多种恶性肿瘤中显示出抗肿瘤活性。Belinostat靶向的主要HDAC类别及其与肾癌和EMT的报道相关性已总结。然而，HAUS5表达是否与ccRCC中对Belinostat的差异反应性相关仍不清楚。在本研究中，研究人员精确评估了HAUS5在ccRCC中的表达水平及其预后意义。随后，开展了体外和体内实验以验证HAUS5在ccRCC中的作用。此外，进一步研究了HAUS5在ccRCC进展中的潜在作用及其潜在机制。Belinostat是一种基于异羟肟酸的泛HDAC抑制剂，靶向I、II和IV类中的锌依赖性HDACs，而III类sirtuins是NAD?依赖性的，不被视为Belinostat的经典靶点。报道的抑制效力因个体HDAC亚型和实验测定系统而异。
研究背景：肾细胞癌（RCC）是肾脏最常见的恶性肿瘤，位居美国诊断频率最高的十大癌症之列，预计到2026年美国将新增80,450例RCC病例和15,160例RCC相关死亡。约三分之一的RCC病例在晚期才被诊断，对当前标准治疗的反应仍不理想。透明细胞肾细胞癌（ccRCC）是主要组织学亚型，占所有RCC病例的75–85%，目前仍缺乏准确的早期诊断标志物和可靠的预后评估指标。HAUS5（Dgt5/KIAA0841）是HAUS家族成员，定位于间期中心体和有丝分裂纺锤体微管，其异常表达导致有丝分裂指数升高、异常纺锤体比例增加和中心体碎裂，促进肿瘤发生，并与乳腺癌和肝细胞癌等恶性肿瘤相关。上皮–间质转化（EMT）是肿瘤侵袭和转移的关键驱动因素，MAPK通路以ERK1/2为核心效应器，ERK1/2磷酸化转录因子（如Snail、Twist）触发EMT变化，靶向该通路逆转EMT是改善癌症治疗的有前景策略。组蛋白去乙酰化酶（HDACs）是肿瘤细胞增殖、存活和表型可塑性的重要表观遗传调节因子，Belinostat是一种泛HDAC抑制剂，作用于锌依赖性HDACs，已在多种恶性肿瘤中显示抗肿瘤活性，但HAUS5表达是否与ccRCC中对Belinostat的差异反应性相关尚不清楚。因此，研究人员开展本研究以评估HAUS5在ccRCC中的表达及预后意义，并通过体外和体内实验验证其作用及潜在机制。
研究人员开展的研究及结论：本研究证明HAUS5在ccRCC组织中显著上调，与不良临床病理特征和预后密切相关。功能实验表明HAUS5促进ccRCC细胞的恶性表型，包括增殖、迁移、侵袭和异种移植瘤生长。机制上，HAUS5至少部分通过激活MAPK/ERK信号通路和诱导EMT促进ccRCC进展。此外，研究发现HAUS5表达与免疫微环境（尤其是巨噬细胞相关重塑）之间存在潜在关系。药物敏感性预测和实验验证进一步表明HAUS5高表达ccRCC细胞可能对Belinostat具有治疗脆弱性。总之，这些结果确定HAUS5为ccRCC中的潜在致癌调节因子和治疗靶点。重要意义：本研究揭示了HAUS5在ccRCC中的生物学功能，提示HAUS5可作为有前景的预后生物标志物和治疗靶点。
关键技术方法（不超过250字）：研究人员从TCGA数据库获取ccRCC基因表达谱和临床元数据，进行泛癌和ccRCC队列的配对与非配对肿瘤–正常比较分析、Kaplan–Meier生存分析、ROC曲线、Cox回归和列线图绘制；使用GSE159115单细胞RNA测序数据集（19,006个细胞）进行Seurat质控、归一化、聚类和UMAP可视化，并进行配体–受体分析推断细胞间信号传导；筛选HAUS5相关基因进行GO富集分析和GSEA；采用CCK-8、EdU染色、集落形成、伤口愈合和Transwell实验评估细胞功能；使用THP-1来源巨噬细胞进行吞噬、极化和募集实验；建立BALB/c裸鼠皮下异种移植模型（shHAUS5和shNC）；进行药物敏感性相关分析和分子对接（HAUS5结构PDB ID: 7SQK）。临床样本来源：烟台毓璜顶医院12例ccRCC患者配对肿瘤与癌旁组织（qRT-PCR），其中5对用于Western blot，3对代表性IHC图像。
研究结果：
HAUS5在ccRCC中呈肿瘤特异性上调且具有临床相关性：TCGA泛癌分析显示HAUS5在多种恶性肿瘤中上调，ccRCC中尤为明显；非配对和配对样本分析均证实HAUS5在肿瘤组织中显著高于正常肾组织。GSE159115单细胞RNA测序分析（19,006个细胞）无监督聚类鉴定出8个主要细胞群体，HAUS5主要在 epithelial cells 中检测到，肿瘤来源上皮细胞HAUS5信号强于正常上皮细胞，提示HAUS5上调主要与恶性上皮区室相关。高HAUS5表达与晚期病理分期、异常血红蛋白状态和死亡事件相关；Kaplan–Meier分析显示高HAUS5表达患者总生存期显著较差；ROC曲线表明HAUS5具有区分ccRCC与正常肾组织的诊断潜力；单因素Cox回归支持HAUS5的预后相关性，并构建整合HAUS5表达与临床病理变量的列线图估算1、3、5年生存概率。这些结果表明HAUS5在ccRCC中上调并与疾病进展和不良临床结局密切相关。
HAUS5在体外促进ccRCC细胞恶性表型：免疫组化显示ccRCC肿瘤组织HAUS5阳性强于癌旁正常肾组织（3对代表性病例）；qRT-PCR分析12对临床样本显示ccRCC组织中HAUS5 mRNA显著升高；Western blot分析5对样本证实肿瘤组织中HAUS5蛋白丰度增加；多种ccRCC细胞系HAUS5表达高于正常肾小管上皮细胞系HK-2。基于内源性HAUS5表达水平，在ACHN细胞中评估3个独立HAUS5敲低构建体，在769P细胞中评估3个HAUS5过表达构建体，Western blot证实shHAUS5–1和shHAUS5–2在ACHN中、OE-HAUS5–2和OE-HAUS5–3在769P中有效调控HAUS5。关键功能实验显示一致的表型变化：HAUS5过表达增强、HAUS5敲低抑制ccRCC细胞增殖、迁移和侵袭。这些结果表明HAUS5在体外促进ccRCC细胞的侵袭性行为。
HAUS5沉默抑制异种移植瘤生长并改变体内EMT相关标志物表达：建立裸鼠皮下异种移植模型，与shNC组相比，HAUS5敲低显著抑制异种移植瘤生长，shHAUS5组切除肿瘤更小、肿瘤重量减少；肿瘤生长曲线显示HAUS5敲低减缓肿瘤体积扩张，小鼠体重两组间相当。免疫组化分析显示HAUS5沉默细胞来源肿瘤中HAUS5和Ki67表达降低，HAUS5敲低增加E-cadherin表达并降低N-cadherin、Snail和Vimentin表达。这些结果表明HAUS5敲低抑制体内ccRCC肿瘤生长，伴随增殖活性降低和EMT相关标志物表达逆转。
HAUS5与ccRCC中MAPK/ERK信号激活和EMT调控相关：对HAUS5相关基因进行富集和相关性分析，GO富集分析显示这些基因主要富集于细胞黏附、凋亡信号调控、白细胞增殖和MAPK级联调控相关生物学过程；泛癌通路相关性分析显示HAUS5表达与ccRCC中MAPK信号通路显著相关；HAUS5表达与关键MAPK/ERK通路组分和EMT相关标志物相关，提示HAUS5、MAPK/ERK激活和EMT表型之间的潜在联系。在ACHN细胞中使用四种平行条件（shNC、shNC+EGF、shHAUS5、shHAUS5+EGF）进行救援实验，Western blot显示HAUS5敲低降低ERK1/2磷酸化并诱导EMT相关蛋白相应变化，而EGF处理部分恢复HAUS5缺失细胞中ERK激活和EMT相关蛋白表达；功能实验一致显示HAUS5敲低抑制细胞增殖、集落形成、迁移和侵袭，EGF处理部分逆转这些抑制作用。这些发现支持MAPK/ERK信号参与HAUS5介导的ccRCC细胞EMT和恶性表型。
HAUS5调控ccRCC微环境中巨噬细胞募集、吞噬和M2样极化：GSEA显示高HAUS5表达与白细胞激活负调控通路富集相关，提示HAUS5可能参与ccRCC免疫微环境重塑。细胞–细胞通讯分析进一步表明HAUS5阳性上皮细胞与巨噬细胞之间的潜在相互作用，特别是HAUS5阳性肿瘤上皮细胞似乎通过MIF-CD74/CXCR4轴与巨噬细胞通讯。为验证MIF作为潜在可溶性介质，ELISA评估条件培养基中MIF分泌，HAUS5过表达显著增加769P细胞MIF分泌，HAUS5敲低减少ACHN细胞MIF分泌。使用OE-NC、OE-HAUS5和MIF抑制剂ISO-1处理的OE-HAUS5细胞条件培养基作用于THP-1来源巨噬细胞，HAUS5过表达降低巨噬细胞吞噬活性和募集同时促进M2样极化；ISO-1处理部分逆转这些巨噬细胞表型，表现为吞噬和募集增加、M2样极化减少。这些发现提供功能证据表明MIF信号参与HAUS5介导的ccRCC巨噬细胞行为调控。
Belinostat拮抗ccRCC细胞中HAUS5驱动的恶性表型：为鉴定HAUS5高表达ccRCC的潜在治疗药物，进行药物敏感性相关性分析，Belinostat与HAUS5表达强相关且预测敏感性良好；分子对接分析显示Belinostat与HAUS5蛋白模型获得有利对接构象。药物敏感性实验显示HAUS5过表达增加769P细胞对Belinostat敏感性，HAUS5敲低降低ACHN细胞对Belinostat敏感性。qRT-PCR分析显示Belinostat抵消HAUS5过表达诱导的EMT相关标志物变化，表现为E-cadherin表达增加、N-cadherin、Vimentin和Snail表达降低。与分子变化一致，Belinostat处理减弱HAUS5过表达驱动的细胞增殖、迁移和侵袭增加。这些结果表明Belinostat抑制HAUS5高表达ccRCC细胞的恶性表型并可能部分逆转HAUS5诱导的EMT。
讨论部分总结：本研究证明HAUS5在ccRCC组织中显著上调，与不良临床病理特征和预后密切相关。功能实验表明HAUS5促进ccRCC细胞恶性表型，包括增殖、迁移、侵袭和异种移植瘤生长。机制上，HAUS5至少部分通过激活MAPK/ERK信号通路和诱导EMT促进ccRCC进展。此外，研究发现HAUS5表达与免疫微环境（尤其是巨噬细胞相关重塑）之间存在潜在关系。药物敏感性预测和实验验证进一步表明HAUS5高表达ccRCC细胞可能对Belinostat具有治疗脆弱性。HAUS家族由进化上保守的蛋白复合物组成，参与微管成核、纺锤体组装和有丝分裂进程调控；微管动力学对准确染色体分离和正常细胞分裂至关重要，微管组织破坏可诱导染色体不稳定、异常有丝分裂和恶性转化。既往研究主要关注HAUS家族成员在中心体功能和微管组织中的作用，但HAUS5在ccRCC中的临床意义和生物学功能尚未完全明确。本研究发现HAUS5在ccRCC组织中高表达，HAUS5表达升高预测不利生存结局，提示HAUS5可能不仅反映异常增殖活性，还可能积极参与ccRCC进展。单细胞RNA测序分析进一步细化HAUS5在ccRCC微环境中的细胞定位，HAUS5表达主要富集于肿瘤来源上皮细胞，恶性上皮细胞中表达水平高于正常肾上皮细胞，支持HAUS5上调主要与肿瘤细胞区室相关而非所有细胞类型的非特异性变化。值得注意的是，细胞–细胞通讯分析鉴定MIF–CD74/CXCR4为HAUS5高表达肿瘤上皮细胞与巨噬细胞之间的突出信号通路；MIF是一种多功能细胞因子，已被报道在多种恶性肿瘤中促进肿瘤免疫逃逸、免疫耐受、巨噬细胞募集和炎症重塑；与预测一致，使用ISO-1药理学抑制MIF部分逆转HAUS5过表达对巨噬细胞吞噬、M2样极化和募集的影响，这些发现为MIF信号参与HAUS5介导的ccRCC巨噬细胞重塑提供功能支持。为探索HAUS5促进ccRCC进展的分子基础，对HAUS5相关基因进行富集分析，结果显示HAUS5相关基因富集于MAPK信号和EMT调控相关生物学过程；MAPK/ERK通路是参与肿瘤细胞增殖、存活、迁移和侵袭的关键信号级联之一，ERK1/2持续激活可诱导支持肿瘤进展和转移潜能的转录程序；EMT是上皮肿瘤细胞失去上皮特征获得间质特征从而获得更强迁移和侵袭能力的另一重要生物学过程，在ccRCC中EMT与肿瘤侵袭性、转移、耐药和不良临床结局密切相关；因此HAUS5相关基因在MAPK/ERK和EMT通路中的富集为HAUS5的致癌效应提供合理的机制解释。既往研究表明微管动力学失调可通过影响细胞内信号转导、细胞骨架重塑和ERK1/2核转位影响EMT，这些发现与本研究结果一致，提示HAUS5可能连接微管相关调控与ccRCC中MAPK/ERK依赖性EMT激活。在实验模型中，HAUS5敲低显著降低ERK1/2磷酸化并逆转EMT相关标志物表达，表现为E-cadherin增加和N-cadherin、Vimentin、Snail降低，这些分子变化伴随ccRCC细胞增殖、迁移和侵袭减少；此外EGF介导的MAPK/ERK信号激活部分挽救HAUS5沉默引起的抑制作用，这些救援实验进一步支持MAPK/ERK信号参与HAUS5介导的EMT和恶性进展的观点；然而由于EGF仅部分逆转HAUS5敲低效应，HAUS5可能还通过其他信号通路调控ccRCC进展，需进一步研究。除对肿瘤细胞的直接作用外，HAUS5还可能影响ccRCC免疫微环境，结果显示HAUS5表达与免疫相关通路（包括白细胞激活负调控）相关；使用条件培养基的功能实验进一步提示HAUS5改变巨噬细胞行为，HAUS5过表达降低巨噬细胞募集和吞噬活性同时增加CD206阳性M2样巨噬细胞比例；这些发现提示HAUS5可能通过削弱巨噬细胞吞噬功能和促进M2样极化帮助建立免疫抑制微环境；由于M2样肿瘤相关巨噬细胞通常与免疫抑制、血管生成、基质重塑和肿瘤进展相关，HAUS5相关巨噬细胞表型可能促进ccRCC侵袭性；然而连接HAUS5高表达肿瘤细胞和巨噬细胞功能变化的具体可溶性介质仍有待鉴定。Belinostat是组蛋白去乙酰化酶抑制剂，获美国食品药品监督管理局批准用于治疗复发或难治性外周T细胞淋巴瘤，近年来Belinostat在实体瘤中的潜在治疗效果日益受到关注；本研究中药物敏感性分析鉴定Belinostat为与HAUS5表达相关的候选化合物，分子对接进一步提示Belinostat与HAUS5之间的潜在相互作用；功能上HAUS5过表达增加Belinostat敏感性而HAUS5敲低降低Belinostat敏感性，此外Belinostat减弱HAUS5诱导的EMT相关标志物变化并抑制HAUS5驱动的增殖、迁移和侵袭；这些结果提示Belinostat可能在HAUS5高表达ccRCC中具有治疗相关性，然而HAUS5与Belinostat反应之间的确切关系仍有待阐明；Belinostat可能减弱ccRCC细胞中HAUS5相关恶性表型。尽管本研究提供生物信息学和实验证据表明HAUS5通过MAPK/ERK-EMT轴促进ccRCC进展并可能与Belinostat敏感性相关，但应承认若干局限性：首先，本研究的体内验证仅限于HAUS5敲低异种移植模型，尽管体外使用了敲低和过表达方法，但未包括HAUS5过表达异种移植模型，因此当前体内发现主要支持HAUS5耗竭的肿瘤抑制后果而非为HAUS5的促肿瘤作用提供完整的双向因果证据，未来纳入HAUS5过表达异种移植模型的研究将有必要进一步确立这一因果关系；其次，裸鼠异种移植模型不能完全再现人类ccRCC的复杂免疫微环境，特别是免疫缺陷小鼠在评估肿瘤–免疫相互作用方面有限，未来使用免疫 competent 或人源化小鼠模型可能更好地阐明HAUS5在免疫微环境重塑中的作用；第三，尽管数据提示HAUS5与巨噬细胞募集、吞噬和M2样极化相关，但负责这些效应的下游介质仍不清楚，虽然发现支持MIF信号参与HAUS5相关巨噬细胞重塑，但MIF抑制后的部分逆转提示其他可溶性介质也可能参与该过程；最后，尽管HAUS5表达与Belinostat差异敏感性相关，但这种关系的分子基础仍不清楚，分子对接分析为探索性的，仅为Belinostat与HAUS5之间可能的结构关系提供计算支持，需要进一步的生化和体内研究阐明HAUS5高表达ccRCC中Belinostat反应性的机制。
研究结论翻译：总之，本研究确定HAUS5为ccRCC中的促肿瘤因子。HAUS5在ccRCC组织和肿瘤上皮细胞中高表达，预测不良临床结局，并通过MAPK/ERK相关EMT激活促进恶性表型。HAUS5还可能通过调控巨噬细胞行为参与免疫微环境重塑。此外，HAUS5高表达ccRCC细胞可能对Belinostat治疗显示潜在脆弱性。这些发现为HAUS5在ccRCC中的生物学功能提供新见解，并提示HAUS5可作为有前景的预后生物标志物和治疗靶点。
