《Trees, Forests and People》：Harnessing beneficial bacteria to enhance Norway spruce seedling health
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森林苗圃需要有效的常规杀菌剂替代方案，因为法规限制日益增加且抗杀菌剂病原体愈加普遍。由Botrytis cinerea引起的灰霉病是挪威云杉（Picea abies）幼苗的一种毁灭性病害，在苗圃生产和冬季贮藏典型的密集、潮湿条件下尤为严重。研究人员从挪威云杉根
森林苗圃需要有效的常规杀菌剂替代方案，因为法规限制日益增加且抗杀菌剂病原体愈加普遍。由Botrytis cinerea引起的灰霉病是挪威云杉（Picea abies）幼苗的一种毁灭性病害，在苗圃生产和冬季贮藏典型的密集、潮湿条件下尤为严重。研究人员从挪威云杉根系和森林苗圃环境中进行细菌生物勘探，以鉴定用于幼苗生产的候选生物防治剂和生物刺激剂。共筛选了203株细菌分离株对杀菌剂敏感和抗杀菌剂的B. cinerea分离株的抗真菌活性。基于种子处理，对病害表现出最佳保护效果的两株分离株通过16S rRNA基因测序鉴定为Pseudomonas sp.和Rouxiella sp.。在实验室试验中，这些分离株单独或组合的叶面处理延迟了B. cinerea接种后的病害发展。在室外条件下，无论是在实验田间站点还是在真实森林苗圃条件下，细菌处理均改善了幼苗生长和健康。这些结果表明，所测试的细菌具有作为森林苗圃病害综合治理中微生物工具的潜力。进一步的工作应优化施用时机、剂型、持久性以及对其他苗圃病原体的效力。
**研究背景与意义**
挪威云杉（Picea abies）是欧洲林业中最重要的树种之一，每年在斯堪的纳维亚森林苗圃中生产超过3亿株挪威云杉幼苗用于更新采伐迹地。为满足这一需求，幼苗在集约化条件下培育，而这种条件可能促进病害发生。在生产的早期阶段，种子播种在托盘中的密集、潮湿条件下，有利于病原体增殖。在冬季贮藏之前，幼苗可能暴露于防水布下的短日照处理，然后被包装在纸板箱等容器中，这些条件可进一步支持病原体生长和病害传播。最后，数月的低温冬季贮藏也有利于病原体增殖。
为减轻病害暴发和防止经济损失，森林苗圃一直依赖一系列化学杀菌剂。然而，根据欧盟和联合国可持续发展目标以及有害生物综合治理原则，随着多种活性成分被禁用，杀菌剂的使用正逐步受到限制。这给森林苗圃产业带来了重大挑战，因为可用的病害管理选项减少。因此，苗圃越来越依赖有限数量的杀菌剂，增加了病原体种群产生抗药性的风险。
由Botrytis属物种引起的灰霉病是森林苗圃中的常见病害，可在生产的各个阶段造成经济损失。Botrytis cinerea Pers.是一种可侵染广泛植物寄主的病原体。其在进入寄主后保持静止状态并作为分生孢子长期存活的能力使其难以防治。在挪威森林苗圃中已经鉴定出对多种杀菌剂具有抗性的Botrytis分离株，这凸显了开发对杀菌剂抗性菌株有效的新型植物保护产品的紧迫性。
近年来，利用植物相关微生物促进植物健康的可能性受到了广泛关注。有益微生物可以作为生物刺激剂，通过促进养分获取和生长来增强植物表现，和/或通过直接拮抗或激活植物防御机制来保护植物免受病原体侵害。利用这种有益的植物-微生物互作 offers为可持续植物保护提供了一条有前景的途径。植物促生细菌（PGPB）已从针叶树的种子内生菌和根际或土壤相关根际细菌中分离出来。Pseudomonas和Acinetobacter等属可以通过增强养分获取和产生促生长激素来发挥生物刺激剂功能。Pseudomonas、Acinetobacter和Burkholderia菌株也已被证明可以减少由Fusarium和Rhizoctonia引起的松树幼苗猝倒病，而Bacillus和Paenibacillus已被指示为针对蓝变真菌的有用生物防治剂。
本研究旨在鉴定与挪威云杉相关的有益细菌，这些细菌可作为森林苗圃中的生物刺激剂和/或生物防治剂。研究人员从云杉根系和森林苗圃环境中分离细菌菌株，并筛选这些分离株抑制真菌生长、活化养分以及在实验室中增强幼苗对杀菌剂抗性B. cinerea菌株抗性的能力。然后最有前景的候选菌株在室外进行评估，包括受控实验和真实苗圃条件，以评估其促进植物生长和防止真菌感染的能力。
**主要技术方法**
研究人员从三个来源收集细菌：挪威森林苗圃（Skogplanter ?stnorge AS）的室内表面和植物材料、挪威?s（59.67° N, 10.79° E）天然更新的挪威云杉幼苗根系及附着土壤、以及生长室中培育一年的苗圃植物。通过系列稀释涂布营养琼脂平板分离细菌，共获得203株分离株。采用体外拮抗实验筛选对杀菌剂敏感（58/19-96）和抗杀菌剂（FG48）B. cinerea菌株具有抗真菌活性的分离株。选择8株活性最强的分离株进行植物实验。通过16S rRNA基因测序（引物5F/11R）鉴定两株最佳分离株。评估了无机磷酸盐溶解能力（PVK培养基、钼蓝法）和低温（3°C）生长动力学。室外实验在NIBIO研究林（?s, Norway; 59.668° N, 10.716° E）和Innlandet森林苗圃（Gjes?sen, Norway; 60.659° N, 12.063° E）进行，使用挪威云杉种子（Svenneby 2, F19-017）播种于M95多孔容器中。统计分析使用R软件（version 4.5.1），包括单因素方差分析、Tukey事后检验、Kruskal-Wallis非参数检验、累积链接模型和向量广义线性模型等。
**研究结果**
**3.1. 细菌生物勘探**
从森林苗圃、天然更新挪威云杉幼苗和生长室培育的苗圃幼苗三个来源获得细菌分离株。共筛选203株分离株对杀菌剂敏感B. cinerea菌株58/19-96和抗杀菌剂菌株FG48的抗真菌活性。其中58株显示不同程度的抗真菌活性，8株体外活性最佳的分离株被选用于挪威云杉种子和幼苗的进一步测试。这包括来自森林苗圃的6株分离株（7-3d、7-4c、8-3g、8-5e、10-4a和10-5b）和来自生长室的2株分离株（NR16和NR24）。
**3.2. 种子细菌处理与对Botrytis的保护**
挪威云杉种子经细菌分离株处理未影响种子发芽率。然而，种子处理在萌发幼苗接种抗杀菌剂FG48 B. cinerea菌株后提供了不同程度的灰霉病保护。效果最佳的两株分离株10-4a和8-3g被选用于进一步研究。通过16S rRNA基因测序BLAST进行基因分型，鉴定为Pseudomonas sp.（10-4a）和Rouxiella sp.（8-3g），均属于Gammaproteobacterium纲。
**3.3. 幼苗叶面细菌处理——实验室**
两株最佳分离株（10-4a和8-3g）单独和组合评估作为叶面处理的效果，并与已知防御反应诱导剂MeJA和商业产品Serenade? ASO进行比较。处理后两周，单株细菌处理植株的茎长显著长于水处理植株。然而，根长或总株长无显著差异。接种后监测灰霉病进展30天。6天后，经10-4a和8-3g分离株单独或组合处理的幼苗健康植株比例显著高于所有其他处理（包括对照）。细菌处理植株在接种后19天前未观察到死亡率。至接种后30天，处理与对照之间的差异不再显著。然而，单独10-4a处理幼苗仍与MeJA、Serenade?或单独8-3g处理显著不同，且10-4a处理在所有处理中健康幼苗数最高。在平行实验中监测长达48天，10-4a对FG48菌株显示显著保护作用达42天。
**3.4. 细菌分离株磷酸盐溶解功能表征**
基于细菌处理对茎长生长的积极效应，进一步评估了两株分离株可能有助于植物生长促进的功能性状。两株分离株在PVK琼脂上生长3天后均在菌落周围产生清晰晕圈，表明具有磷酸三钙溶解能力。在PVK肉汤中定量磷酸盐溶解，发现两株分离株均释放无机磷酸盐，但其溶解能力和对培养基pH的影响显著不同。两株菌株的磷酸盐溶解均在孵育1天后达到峰值。分离株8-3g表现出强大的磷酸盐溶解能力，释放1000 mg L?1无机磷酸盐，伴随培养pH从7.00急剧下降至2.95。分离株10-4a效率较低，第1天溶解291 mg L?1无机磷酸盐，pH相应降至3.40。在随后的48小时内，无机磷酸盐浓度仅轻微波动，而pH逐渐下降并在第3天达到最低点。两株分离株中观察到的pH与无机磷酸盐浓度之间的 inverse关系表明磷酸盐溶解可能由有机酸产生驱动的酸化所介导。
**3.5. 低温下最小和富集培养基中的长期生长动力学**
Pseudomonas sp. 10-4a和Rouxiella sp. 8-3g在3°C下使用最小培养基（M9）和富集培养基（BHI）监测四周的生长动力学。两株分离株均表现出耐冷性状，在两种培养基类型中于3°C下均显示稳定生长。在M9培养基中，两株分离株OD???从第7天至第21天逐渐增加，随后在第21天至第28天之间出现更强增长。至第28天，Pseudomonas sp. 10-4a和Rouxiella sp. 8-3g分别达到最大OD???值3.20和3.30。在BHI培养基中，两株分离株表现出不同的时间模式。Pseudomonas sp. 10-4a在第21天达到峰值OD??? 2.31，随后至第28天轻微下降至2.04。相反，Rouxiella sp. 8-3g在第14天达到峰值OD??? 1.42，随后细胞密度稳步下降，至第28天OD???为0.89。
**3.6. 幼苗叶面细菌处理——NIBIO室外**
发芽后约14周和26周的叶面细菌处理在室外一个生长季后显著增加了植株高度。相反，单独MeJA处理与的水对照相比导致生长显著降低。细菌和MeJA联合处理与对照无差异。有趣的是，MeJA和细菌处理单独均比对照增加了干根重，但联合处理时未观察到该效应。植株健康状态在处理间显著不同。细菌和MeJA联合处理显示健康植株比例最高（35%），其次是单独细菌处理（29%）和单独MeJA处理（27%）。水对照健康植株比例最低（19%）。
**3.7. 幼苗叶面细菌处理——森林苗圃室外**
在森林苗圃室外生长的植株在越冬后、细菌处理15个月后进行评估。对照植株与在幼苗阶段（发芽后14周和26周）接受两次细菌处理的植株之间株高无显著差异。然而，单独MeJA处理植株显著矮于细菌处理或MeJA与细菌联合处理植株。对于根干重，MeJA和细菌联合处理植株的根生物量显著高于对照。单独细菌处理和细菌与MeJA联合处理均对植株健康有显著积极效应，自然感染后健康植株比例显著高于对照（分别为90%和83% vs 对照63%）。为确定处理是否影响自然条件下获得的潜伏病原体感染，将越冬植株从盆中取出并在塑料盒中于有利于病害的条件下额外孵育6周。处理植株与对照植株之间未检测到病害发展的统计学显著差异。然而，对照组植株死亡率更高，10株中5株死亡，而每个处理组10株中仅1株死亡。
**讨论与结论**
有益微生物作为传统肥料和杀菌剂的可持续、环境友好替代品具有巨大潜力。本研究鉴定了两株对挪威云杉生长和健康具有积极效应的细菌分离株，鉴定为Pseudomonas和Rouxiella属成员。几种Pseudomonas物种以通过增强养分吸收、产生植物激素和刺激根系发育来促进植物生长而著称。这些细菌还产生多种抗菌物质，包括抗生素、裂解酶和挥发性有机化合物。同样，许多Rouxiella物种通过产生次生代谢物表现出抗真菌活性，尽管一些菌株也被报道为机会性植物病原体。在本研究中，两株表现最佳的细菌分离株均对挪威云杉生长和健康具有总体积极效应，凸显了其作为生物刺激剂和生物防治剂的潜力。功能表征表明磷酸盐溶解可能有助于观察到的生长促进效应。两株分离株均溶解磷酸三钙并释放无机磷酸盐，尽管其溶解能力显著不同。Pseudomonas sp. 10-4a在24小时后释放291 mg L?1无机磷酸盐，而Rouxiella sp. 8-3g释放1000 mg L?1。后一数值与高效细菌磷酸盐溶解菌的报道相当，包括Bacillus circulans、Pantoea sp.和Pseudomonas fluorescens菌株。对于两株分离株，无机磷酸盐释放与培养基强烈酸化相关，这与有机酸产生在细菌矿物磷酸盐溶解中的既定作用一致。有机酸可以质子化不溶性磷酸盐复合物，包括磷酸三钙，从而将可溶性正磷酸盐释放到周围培养基中。因此，本研究中观察到的培养基pH与无机磷酸盐浓度之间的 inverse关系表明酸化是磷酸盐溶解的主要驱动因素。两株分离株磷酸盐溶解能力的差异也可能表明其植物生长促进效应由部分不同的机制介导。尽管Rouxiella sp. 8-3g在PVK肉汤中显示最高的磷酸盐释放，但Pseudomonas sp. 10-4a在多项植物实验中显示出强大的生物刺激和生物保护效应。这表明磷酸盐溶解 alone不太可能解释观察到的植物反应。其他植物生长促进性状，如氮代谢、植物激素产生、铁载体产生、挥发性介导的生长刺激或抗菌活性，也可能有贡献。许多细菌生物刺激剂表现出多种功能性状，具有中等磷酸盐溶解能力的菌株仍可通过替代机制如氨、吲哚-3-乙酸、铁载体或氢氰酸产生来促进植物生长。因此，需要进一步的功能实验和代谢物谱分析来确定这些机制在分离株10-4a和8-3g中的相对贡献。在实验室中，用细菌分离株10-4a和8-3g处理挪威云杉种子或幼苗显著增加了茎长并减少了B. cinerea感染后的病害症状。植物生长促进和保护效应对分离株10-4a（Pseudomonas sp.）尤为强烈。尽管接种量高且孵育条件苛刻（如无光照），细菌处理延迟了病害发展并在接种后30天内产生最高比例的健康幼苗。这些结果表明分离株10-4a具有作为生物刺激剂和生物保护剂的潜力。有趣的是，分离株10-4a对杀菌剂抗性B. cinerea菌株FG48提供的保护优于商业产品Serenade? ASO，后者是含有Bacillus amyloliquefaciens菌株QST 713的成熟灰霉病生物防治剂。细菌分离株10-4a和8-3g优于MeJA的表现也值得注意。已知MeJA在针叶树中诱导强防御反应，尽管这些反应通常与生长成本相关。本研究中观察到的MeJA对植物抗性的相对负面效应可能是因为使用了非常年轻的、正在活跃生长并优先生长而非防御激活的幼苗。与实验室结果一致，细菌处理在室外实验中对植物生长和健康产生了最大的积极效应。在两个地点，与MeJA处理相比，细菌处理增强了幼苗地上部生长。有趣的是，Pseudomonas sp. 10-4a和Rouxiella sp. 8-3g均表现出耐冷性状，这可能有助于其在室外实验低温条件下的生物刺激和生物防治活性。这在越冬后分析幼苗的苗圃中可能尤其相关。对生物量的处理效应更具地点依赖性。由于旺盛的根系生长对于种植后森林立地幼苗建立很重要，这些差异可能对苗圃生产具有实际意义。在NIBIO，单独MeJA处理或两种细菌分离株处理的幼苗根干重最高，而在森林苗圃，联合细菌-MeJA处理幼苗的根生物量最大。相反的响应可能反映了养分状况的差异。NIBIO的幼苗接受最少施肥，而苗圃幼苗定期施肥。这表明细菌分离株的生长促进效应可能取决于养分可利用性。与细菌处理总体积极的效应相反，单独MeJA处理在室外和实验室中均导致最高比例的死亡植株。这种负面效应可能与室外初夏和秋季重复施用MeJA有关。在实验室条件下，幼苗非常小且正在活跃生长，这可能使其对MeJA诱导的防御激活特别敏感。这可能引发持续防御激活并可能损害幼苗平衡生长和防御的能力，从而降低其应对额外环境胁迫的能力。然而，当MeJA作为种子处理施用时，观察到相反效应，幼苗对B. cinerea的抗性增加。因此，MeJA的效应可能强烈取决于施用方法、时机和幼苗发育阶段。细菌和MeJA联合处理对植物健康有显著积极效应，表明细菌可能减轻MeJA的一些负面效应。细菌处理对根生物量和健康的地点特异性效应表明，温度、湿度和养分可利用性等环境因素可能影响细菌活性和植物响应性。此外，尽管在室外实验中具有积极效应，10-4a和8-3g可能不构成应用的最佳联合体。在实验室实验中，分离株单独和组合评估时，分离株10-4a比联合细菌处理促进更大的地上部生长并提供更好的B. cinerea保护。因此，未来研究应侧重于优化有益细菌的施用时机和剂型，以及了解菌株在不同环境条件下的持久性和定殖能力。此外，鉴于B. cinerea的高遗传变异性，未来工作应评估细菌对额外Botrytis菌株和其他常见苗圃病原体的性能。与先前细菌-真菌互作通常具有菌株特异性的报道一致，本研究中细菌效应在测试的两株B. cinerea菌株之间不同。多重杀菌剂抗性分离株被抑制，而杀菌剂敏感分离株未被抑制。这种差异可能是由于赋予杀菌剂抗性的突变相关的适合度成本、菌株特异性细菌-真菌互作或两者兼有。总之，这些发现强调了筛选候选生物防治剂针对多种病原体分离株的重要性。所测试细菌观察到的保护效应的机制仍有待阐明。细菌可能直接拮抗B. cinerea（如通过产生抗真菌代谢物或竞争资源），可能激活局部和诱导系统抗性，或可能结合两种机制。需要进一步的转录组和代谢组分析来阐明是否涉及诱导系统抗性以及细菌处理是否调节寄主代谢和防御信号传导。总之，研究结果凸显了挪威云杉相关细菌作为生物产品改善森林苗圃幼苗表现的潜力。所测试分离株在改善幼苗生长的同时抑制病害的能力表明，有益微生物可以 contribuir于植物营养和植物保护。随着减少林业中化学农药和肥料使用压力的增加，微生物生物刺激剂和生物保护剂可能成为综合苗圃管理策略的重要组成部分，支持生产健康、有韧性的幼苗以实现成功的森林建立。
