密度调控型天然深共熔溶剂结合超声辅助提取紫薯多糖的工艺优化

《Ultrasonics Sonochemistry》：Optimization of ultrasound-assisted extraction of purple yam polysaccharides using density-regulated natural deep eutectic solvents

　　

本研究开发并优化了一种基于密度调控型天然深共熔溶剂（NADES）的超声辅助提取策略，用于紫薯多糖（PYP）的提取与回收。通过单因素实验结合Plackett-Burman筛选和Box-Behnken设计，对氯化胆碱-柠檬酸基NADES体系进行了优化。确定的最佳提取条件为：NADES摩尔比1:3、含水量10%、液固比20 mL/g、超声时间40 min、功率480 W、温度40 °C。随后采用50%（v/v）乙醇沉淀12 h回收多糖。在此条件下，粗PYP得率达59.6 ± 0.6 mg/g，PYP回收率为29.14 ± 0.4 mg/g，显著优于常规方法。分子动力学模拟揭示了ChCl-CA基NADES体系的提取机制，并证实NADES与PYP之间存在强静电相互作用，相互作用能为–23.53 kcal/mol（?1.0204 eV）。体外抗氧化实验表明，NADES提取的PYP具有显著的抗氧化能力，对DPPH、ABTS和羟自由基的清除率分别为68.56%、66.22%和61.06%。总体而言，本研究建立了一种高效、环保的PYP分离策略，为紫薯多糖的进一步开发和实际利用提供了理论基础和技术参考。

研究背景：紫薯（Dioscorea alata L.）为薯蓣科植物，广泛分布于中国南方，兼具食用与药用价值，富含花青素、多糖及薯蓣皂苷等多种生物活性成分。紫薯多糖（PYP）作为其重要的生物活性组分之一，因天然来源、高安全性和显著生物活性而成为功能食品与医药领域的研究热点。然而，目前紫薯资源在食品加工产业中的利用仍主要停留在初级加工阶段，深加工与高值化应用有限。植物多糖的提取方法一直是限制其高值化利用的关键因素。常规提取方法包括热水提取、酶辅助提取和微波辅助提取等，存在提取时间长、得率低、活性成分可能降解、环境负担额外增加、产物选择性和纯度低等缺陷。超声凭借空化效应、机械效应和热效应的协同作用，在效率、选择性和产物活性保护方面展现出显著优势。深共熔溶剂（DES），尤其是天然深共熔溶剂（NADES），因低毒性、可生物降解、结构可调及优良增溶能力，已成为替代传统溶剂体系回收植物源多糖的研究热点。尽管超声辅助NADES提取已广泛应用于强化传质和优化提取条件，但选择性差、纯度低以及提取与纯化脱节等问题仍未解决。NADES的理化性质可通过调节氢键供体（HBD）和氢键受体（HBA）的种类及摩尔比来调控，包括极性、黏度和密度，这为靶向植物化学物和大分子的提取及后续分离提供了新机遇。特别是密度调控可能通过改变NADES体系的理化环境及其与提取组分的相互作用来影响相分离行为，从而为提取与后续分离的整合提供潜在基础。与传统以最大化提取率为目标的NADES提取策略相比，密度调控型NADES体系可能通过同时提高提取选择性、简化下游纯化和增强目标化合物回收效率，提供更可持续的方法。然而，密度调控型NADES体系用于PYP选择性提取与分离的研究尚鲜有报道。研究团队长期致力于紫薯功能食品开发，已从化学组成入手提取分离紫薯皂苷成分并发表相关论文，目前已完成中试生产试验。为进一步拓展紫薯资源的高值化利用，本研究聚焦于开发绿色高效的PYP提取策略。研究设计并筛选了一系列NADES体系，随后采用Plackett-Burman设计（PBD）和Box-Behnken设计（BBD）进行超声辅助提取优化。与以往主要关注提取率优化的研究不同，本研究创新性地开发了适用于PYP提取的密度调控型NADES体系，探索了NADES理化性质调控特别是密度控制对促进选择性相分离和便于多糖回收的作用。采用核磁共振（NMR）波谱和分子动力学模拟研究了NADES与PYP之间的分子相互作用。此外，系统评价了不同提取策略所得PYP的结构特征和体外生物活性。本研究为通过密度调控型NADES体系整合提取与分离过程提供了新视角，并为PYP及其他富含多糖的农业资源的高值化利用提供了潜在的可扩展策略。目前工作限于实验室规模提取，未来研究将聚焦中试规模优化和经济可行性评估以促进工业应用。

关键技术方法：研究人员以紫薯（Dioscorea alata L.，早熟品种）块茎为原料，于2024年8月采自江西省赣州市安远县三山镇，经齐齐哈尔医学院药学院Lina Guo教授植物学鉴定，单批次原料确保无批间差异。以氯化胆碱（ChCl）和甜菜碱为HBA，1,3-丙二醇、1,2-丙二醇、尿素、乳酸、柠檬酸、苹果酸、甲基脲、甘油、草酸和丙二酸为HBD构建25种NADES体系。采用KJ-11030AL槽式超声装置（40 kHz，额定功率600 W，60–600 W可调）进行超声辅助提取。通过单因素实验、PBD筛选和四因素三水平BBD优化提取工艺。采用密度计测定溶液密度，酚-硫酸法于490 nm测定多糖含量。通过Sevage法脱蛋白、H2O2脱色、透析和冻干获得纯化多糖，采用FT-IR、热分析、扫描电镜（SEM）和NMR进行结构表征。采用量子力学方法构建NADES分子模型，以半乳糖（Gal）为目标化合物进行密度泛函理论（DFT）计算。通过一级动力学模型拟合提取过程，并测定DPPH、ABTS和羟自由基清除活性评价抗氧化能力。

研究结果：

3.1 NADES筛选：通过密度调控改变NADES微环境以提高PYP分离选择性。ChCl和甜菜碱为HBA与多种HBD组合构建25种NADES体系。以酸性成分为HBD合成的NADES密度普遍较高，归因于极性官能团强化分子间氢键形成更紧密排列。NADES-17虽提取效率高但产物纯度低导致回收率差，可能因共提取大量蛋白杂质。NADES-9回收率最高达42.20 ± 0.6 mg/g，归因于特定溶剂组合优化了氢键能力和静电相互作用，提高靶向多糖选择性提取。选定ChCl:CA摩尔比1:3为最优NADES组成。

3.2 单因素与密度调控优化：NADES摩尔比方面，PYP得率和回收率随摩尔比增大呈先升后降趋势，HBD:HBA为1:3时达最大值得率45.87 ± 0.7 mg/g、回收率15.31 ± 0.1 mg/g，超过1:4后HBD比例持续增加显著提高体系动力黏度，阻碍传质和分子扩散。含水量方面，10%含水量时得率43.72 ± 0.9 mg/g、回收率15.74 ± 0.1 mg/g达最大，超过后逐渐下降，50%时尤为明显，归因于溶剂理化性质（黏度、极性）及与目标化合物氢键相互作用显著改变。液固比方面，20 mL/g时得率和回收率峰值，增加溶剂体积通过增大渗透压梯度促进目标分子溶解并强化超声空化效应，但超过后过度稀释降低单位体积有效超声能量密度。超声时间方面，20–40 min内得率递增，40 min时达最大49.91 ± 0.7 mg/g、回收率24.74 ± 0.1 mg/g，超过后逐渐下降，可能因长时间强空化和剪切力导致多糖热降解或结构破坏。超声功率方面，随功率增加得率上升，420 W时达最大54.24 ± 0.7 mg/g、回收率25.45 ± 0.1 mg/g，增至480 W后下降，低功率空化不足致细胞壁破碎不充分和传质差，过高功率强化机械剪切并在空化泡崩溃时产生极端局部温度和压力，裂解糖苷键破坏活性结构。超声温度方面，随温度升高得率先升后降，40 °C时达最大58.46 ± 0.8 mg/g、回收率24.07 ± 0.1 mg/g，适度升温增强分子布朗运动降低溶剂黏度促进多糖扩散，热效应与超声空化协同促进细胞壁破碎和传质，超过40 °C过度热负荷致糖苷键水解。乙醇浓度方面，10%–60%（v/v）范围内PYP得率与乙醇浓度正相关，60%–100%范围内下降，乙醇浓度达峰值后目标多糖大部分已沉淀，过高浓度诱导醇溶性蛋白或低分子量片段等杂质共沉淀。乙醇沉淀时间方面，1–12 h内得率增加，24 h后开始下降。单因素优化确定最佳条件为ChCl:CA摩尔比1:3、含水量10%、液固比20 mL/g、420 W、40 °C超声40 min、60%（v/v）乙醇沉淀12 h。密度调控方面，ChCl:CA摩尔比从1:1增至1:6使NADES密度从1.15升至1.33 g·cm?3，归因于CA比例增高强化分子间氢键和紧密分子堆积；增加含水量、温度或乙醇浓度均降低NADES密度，水添加破坏氢键网络增大分子间距，高温加速分子运动扩大溶剂体积，乙醇密度较低稀释NADES基质削弱共熔相互作用。PYP沉淀回收率和分配比随NADES密度升高呈先升后降趋势，中等密度时氢键和溶剂化环境有利于PYP聚集和相分离，超过最优密度后PYP稳定于液相抑制聚集沉淀。NADES可调密度是超声辅助提取和乙醇诱导沉淀过程中PYP相分离的关键驱动因素。

3.3 PBD和BBD结果与分析：PBD实验结果表明模型统计显著（F=74.45，p=0.0023<0.05），决定系数R2为0.9950，回归方程解释99.5%的PYP得率变异。摩尔比（X1）、含水量（X2）、乙醇浓度（X4）和超声功率（X5）对PYP得率有显著影响（p<0.05），显著性顺序为超声功率>乙醇浓度>含水量>摩尔比。BBD采用29个实验运行，PYP得率范围为37.8–60.1 mg/g，简化二次模型预测值与实验值吻合良好。方差分析显示模型总体F值92.11，回归模型统计显著，失拟项不显著（0.1350，P>0.05），模型稳健且预测能力强。X1、X4和X1X5高度显著（P<0.0001），X5及X1X2、X1X4、X2X5、X4X5显著（0.0001X4X5>X2X5>X1X2，与方差分析一致。模型优化确定最佳工艺参数为X1=2.753、X2=9.932、X4=48.539、X5=473.552，响应面法最优乙醇浓度50%略低于单因素筛选的60%，因单因素仅改变乙醇浓度而固定其他参数为局部最优，响应面法考虑乙醇浓度与其他关键参数交互作用确定全局最优。验证实验中，按实际优化条件（NADES摩尔比1:3、含水量10%、超声功率480 W、乙醇浓度50%）三次独立重复实验平均PYP得率59.6 ± 0.6 mg/g，与理论预测60.324 mg/g接近，相对偏差1.21%，证实优化提取工艺的稳健性和模型高预测精度。

3.4 PYP结构表征：FT-IR表征显示PYP在3402.09 cm?1处有多糖特征宽峰（O-H伸缩振动），1593.43和1401.41 cm?1为羧酸根离子不对称和对称伸缩振动（提示酸性多糖组分），1152.33和1016.48 cm?1表明糖单元主要以吡喃糖形式存在。NADES-9在3411.28 cm?1处O-H伸缩振动峰较ChCl和CA更宽且向低波数移动，表明强分子间氢键网络形成，为NADES成功构建的直接证据；1729.78 cm?1处羧酸羰基（C=O）伸缩振动峰较纯柠檬酸略向低波数移动，表明CA羧基作为HBA参与NADES结构。FT-IR结果表明PYP特征官能团在提取后基本保留。热分析显示五种提取方法所得多糖TG曲线分三阶段：50–150 °C失重5%–18%归因于自由水蒸发，MAE失重最高18%；200–400 °C快速失重表明多糖骨架（糖苷键）加速热裂解，TPP失重最大73%，依次为UAE 72%、HRE 67%、UAE-NADES 65%、MAE 62%；400–600 °C UAE-NADES法样品残留量最高、热稳定性最优。SEM观察显示UAE-NADES样品呈纤维-颗粒交织网络形态，归因于NADES中HBD/HBA竞争性破坏纤维素天然氢键网络及超声空化剪切力进一步解构细胞壁的协同作用；HRE样品主要呈纤维状伴珠状突起；UAE样品呈不规则片状聚集体表面较光滑孔隙有限；MAE样品呈明显蜂窝状海绵状网络多孔形态；TPP样品呈层状与不规则块状交织形态均匀性差。NMR分析显示1H NMR谱信号主要集中在3.0–5.5 ppm区域，5.39 ppm处信号归属α-糖苷键端基质子，3.18–4.64 ppm为其他糖环质子（H-2至H-6），4.63 ppm为D2O残余溶剂峰，1.0–2.0和6.5–8.0 ppm区域无显著信号表明蛋白和酚类杂质含量低。13C NMR谱90–110 ppm为端基碳区域，104.32、99.55和77.60 ppm处有显著峰，100 ppm以下信号进一步证实α-糖苷键为主，60–80 ppm归属吡喃环C-2至C-6碳，38.66 ppm附近信号提示末端–CH2–和–CH3基团存在，表明呈支链而非简单线性结构。

3.5 不同提取方法PYP得率和生物活性比较：五种提取方法比较表明UAE法得率和回收率均低于其他方法，MAE法得率最高但回收率显著低于UAE-NADES法，归因于微波加热强烈均匀的细胞破碎效应有效促进胞内多糖溶出但增加杂质共提取。UAE-NADES法在得率和回收率方面均表现最优，优势 twofold：超声空化局部冲击和热效应破坏植物细胞壁加速PYP释放；NADES可设计氢键网络增强对多糖的溶解性和选择性同时预削弱细胞壁，与超声产生协同效应。UAE-NADES法可在更温和条件下（更短时间、更低温度）高效提取，显著降低对多糖的热和机械应力，更好保持天然构象和生物活性。抗氧化活性方面，UAE-NADES法提取PYP对三种自由基清除能力均强于其他四种方法且呈明显浓度依赖性，3.2 mg/mL时DPPH、ABTS和·OH清除率分别为68.56%、66.22%和61.06%。多糖抗氧化性受提取方法诱导的结构变化和温度调控，分子量、糖醛酸含量和多糖含量共同调节抗氧化活性，过度加热致多糖链部分降解降低分子量和给电子能力，UAE-NADES温和操作条件避免高温损伤保留高分子量和完整糖链构象，NADES中HBA和HBD通过协同相互作用稳定多糖结构进一步增强生物活性。

3.6 分子模拟：以半乳糖（Gal）为靶标多糖代表性片段进行DFT计算比较Gal与NADES和H2O体系的结合能。NADES-Gal结合能为–23.53 kcal/mol（?1.0204 eV），显著高于水-半乳糖复合物的–1.57 kcal/mol（?0.0680 eV），表明ChCl-CA与PYP之间形成更强更稳定的分子间相互作用网络。ESP分析显示纯NADES体系中ChCl季铵氮周围出现明确缺电子区域（深蓝色），酸组分羧基氧原子呈现显著富电子区域（红色），NADES与Gal结合后静电势面广泛重叠表明强静电相互作用形成稳定多氢键网络；水体系静电势分布更弥散，水与Gal相互作用虽仍形成氢键但接触面积和势重叠程度明显低于NADES体系。

3.7 提取动力学：UAE组约40 min接近提取平衡，Non-UAE组约需120 min。一级动力学模型对两种提取过程拟合良好（R2adj>0.98）。UAE组平衡提取得率Ye为61.55 mg/g，速率常数k为0.0904 min?1，半平衡时间t1/2为7.67 min，初始提取速率r0为5.56 mg/g/min；Non-UAE组对应值分别为49.54 mg/g、0.0214 min?1、32.38 min和1.06 mg/g/min。UAE过程k和r0值分别约为Non-UAE的4.2倍和5.3倍，t1/2降低约76%，表明超声显著加速PYP提取动力学。UAE组40 min后PYP得率略降，从40 min的59.6 ± 1.1 mg/g降至120 min的56.8 ± 2.8 mg/g，可能因长时间超声空化和剪切力诱导多糖链部分降解或解聚。Non-UAE组120 min后得率仅46.1 ± 1.9 mg/g，仍低于UAE组40 min得率。Non-UAE和UAE组表观活化能分别为24.89 kJ/mol（R2=0.9691）和19.82 kJ/mol（R2=0.9436），UAE较低表观活化能表明超声处理降低多糖提取过程能垒，促进紫薯细胞壁破坏和多糖释放。

3.8 NADES辅助提取与富集PYP机理：氢键介导细胞壁结构松散——植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素、果胶、木质素等组成复杂超分子网络，纤维素链间广泛分子内和分子间氢键形成致密堆积结构阻碍溶剂渗透限制多糖释放，NADES中HBA和HBD与细胞壁聚合物羟基等极性基团竞争减弱天然分子间相互作用促进细胞壁架构溶胀和松散，增强溶剂渗透和传质。酸介导细胞壁松散和非靶多糖潜在共提取——羧酸基NADES通常以季铵盐为HBA、羧酸组分为HBD，酸性成分为木质素解聚提供优异性能，可能源于酸性组分产生的质子环境与溶剂固有氢键网络协同促进木质素醚键断裂，酸性共熔溶剂减弱细胞壁组分间非共价相互作用并在特定条件下促进选定细胞壁组分溶解和结构松散。氢键介导糖分子复合物动态形成——NADES中HBD和HBA与纤维素羟基竞争性氢键有效破坏纤维素固有超分子氢键网络增加溶剂化，促进多糖分子溶解和稳定复合物形成。乙醇沉淀是基于溶剂环境调控和多糖溶解度调节的成熟分离富集技术，乙醇添加改变水-乙醇混合物溶剂性质降低多糖溶解性促进聚集沉淀。

3.9 实验室规模成本估算：基于原料紫薯、NADES组分、乙醇等实际消耗和采购价格估算直接材料成本。实验室规模下纯PYP提取加工成本约$0.89/g（含25 mL NADES合成及后续提取），仅含合成和提取过程直接原料成本，不含溶剂蒸发能耗和溶剂回收潜在成本。纯化后回收PYP组分多糖纯度为83%–92%，单次纯化成本$1.78/g，完整提取和纯化过程PYP总成本约$3.86/g，未含超声、加热、溶剂蒸发、离心或冻干能耗及人工、设备折旧、废水处理、溶剂回收、包装和放大过程潜在损失。

讨论部分总结：本研究开发了超声辅助密度导向NADES策略以提高PYP提取和回收。与传统DES辅助多糖提取通常关注提取温度、时间和氢键受体供体摩尔比等操作参数不同，本研究引入密度作为调控NADES体系的额外理化参数。NADES组成调控改变溶剂性质包括氢键相互作用、极性、黏度和传质行为，可能影响多糖溶解、提取和后续回收。密度调控NADES与超声结合为优化PYP提取和富集提供了理化基础。与几种基准提取体系相比，UAE-NADES表现出良好提取性能，提取时间更短且PYP得率更高。更重要的是，UAE-NADES与Non-NADES的溶剂匹配比较表明超声在相同NADES条件下显著加速PYP提取。UAE-NADES和Non-NADES条件下提取动力学均可用一级动力学模型充分描述。结构表征进一步揭示不同提取体系所得PYP组分的理化特性差异。以半乳糖为简化模型的DFT计算提供了ChCl:CA NADES与半乳糖之间可能相互作用的分子层面信息，结果与所提分子间相互作用机理一致。此外，UAE-NADES所得PYP较基准提取体系所得组分表现出增强的抗氧化活性。总体而言，本研究建立了基于密度调控NADES的超声辅助提取策略用于PYP提取和回收，结果为NADES选择从经验性溶剂筛选转向基于理化参数的植物多糖提取理性设计方法提供了有用基础。

研究结论翻译：本研究开发了一种超声辅助密度导向NADES策略以改进紫薯多糖（PYP）的提取和回收。与传统DES辅助多糖提取通常关注提取温度、时间和氢键受体与供体摩尔比等操作参数不同，本研究引入密度作为调控NADES体系的额外理化参数。NADES组成的调制改变了溶剂性质，包括氢键相互作用、极性、黏度和传质行为，这些可能影响多糖溶解、提取及后续回收。因此，密度调控NADES与超声的结合为优化PYP提取和富集提供了理化基础。与几种基准提取体系相比，UAE-NADES表现出良好的提取性能，提取时间更短且PYP得率更高。更重要的是，UAE-NADES与Non-NADES的溶剂匹配比较表明，在相同NADES条件下超声显著加速了PYP提取。UAE-NADES和Non-NADES条件下的提取动力学均可用一级动力学模型充分描述。结构表征进一步揭示了不同提取体系所得PYP组分的理化特性差异。以半乳糖为简化模型的密度泛函理论（DFT）计算提供了ChCl:CA NADES与半乳糖之间可能相互作用的分子层面信息，结果与所提出的分子间相互作用机理一致。此外，UAE-NADES所得PYP较基准提取体系所得组分表现出增强的抗氧化活性。总体而言，本研究建立了基于密度调控NADES的超声辅助提取策略用于PYP的提取和回收，结果为NADES选择从经验性溶剂筛选转向基于理化参数的植物多糖提取理性设计方法提供了有益基础。