《Aquaculture, Fish and Fisheries》：Chronic Exposure to Chlorpyrifos Induces Blood Biomarkers, Somatic Indices and Organ Histopathology of Banded Gourami (Trichogaster fasciata)
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农药已成为农业作物生产以增产粮食的组成部分。然而，农药的过度使用最终进入水生生态系统，并对非靶标水生生物（包括鱼类）产生危害性影响。因此，本研究旨在揭示一种有机磷杀虫剂氯吡硫磷（CPF）对带状吻鲈（Trichogaster fasciata）一系列血液生物标志
农药已成为农业作物生产以增产粮食的组成部分。然而，农药的过度使用最终进入水生生态系统，并对非靶标水生生物（包括鱼类）产生危害性影响。因此，本研究旨在揭示一种有机磷杀虫剂氯吡硫磷（CPF）对带状吻鲈（Trichogaster fasciata）一系列血液生物标志物、体指数以及肝脏和肾脏组织病理学异常的慢性毒性。将鱼暴露于不同亚致死浓度（0、15、50、150和500 μg/L）的CPF中75天，并每隔15天取样一次。结果表明，葡萄糖、白细胞水平、平均红细胞体积和平均红细胞血红蛋白含量显著升高（p < 0.05），而血红蛋白、红细胞计数和红细胞压积随之降低。肝体指数呈升高趋势，而肾体指数呈相反趋势。肝脏中可见空泡化、脂肪变性、血窦扩张和出血，而肾脏组织病理学显示肾小管腔闭塞、小管间间隙增宽、空泡化、黑色素巨噬细胞中心和出血。总体而言，慢性CPF暴露引起浓度依赖性和时间依赖性改变，导致带状吻鲈贫血、肝毒性和肾毒性。然而，仍需更深入的研究以了解鱼类在分子水平上的变化，如氧化应激、基因表达、代谢组学分析等。该研究鼓励开展农药替代品研究以及跨学科行动，以保护水生环境及水生生物区系。
研究背景方面，在孟加拉国，持续增长的人口、耕地减少及随之而来的粮食安全需求促使农业集约化，高温、突发洪水、干旱、沿海带盐分入侵等农业气候条件进一步加重作物产量负担。农民种植多种高产作物品种以满足粮食需求，但多数品种易感病虫害，因此农药被大量使用以保护作物，政府还通过补贴鼓励农民使用农药以提高单位面积产量。孟加拉国使用多种化学类别的农药，目前有机磷类因作为有机氯农药的优良替代品而日益流行，后者因在水生环境中长期残留已于1993年被禁用。氯吡硫磷（CPF）是一种合成杀虫剂和杀螨剂，用于防治棉花、大豆、玉米、稻田、水果和蔬菜上的叶面害虫。CPF可通过喷雾漂移、地表径流、地下水淋溶和空瓶处置不当等途径进入周边水生生态系统，污染非靶标水生脊椎动物。CPF已在孟加拉国多处水体中被检出，最高残留浓度达37.3 μg/L。鱼类因能对环境外源物质作出反应且是人类良好食物来源而成为有用的实验模型，CPF通过抑制乙酰胆碱酯酶发挥作用。鱼类暴露于污染物会引起血液学指标变化，血液学参数已被用作诊断工具以监测鱼类健康状况及由CPF等污染物引起的急慢性病理变化；组织病理学则为观察污染物对不同动物各器官的影响提供了快速工具，肝脏和肾脏是确定潜在毒物作用的重要组织学检查器官。带状吻鲈分布于孟加拉国、印度、缅甸、尼泊尔和巴基斯坦，因其营养来源和观赏价值而受到消费者关注，但自然丰度因人为胁迫因素而下降。此前已有研究调查CPF对该鱼发育阶段的毒性、对成鱼死亡率和繁殖的毒性，以及对该鱼鳃组织结构的长期毒性影响；然而，关于CPF对该鱼血液生物学参数、体指数及肝脏和肾脏组织病理学潜在毒性影响的信息尚缺乏。为填补这一知识空白，研究人员旨在阐明慢性CPF暴露后对带状吻鲈血液和组织病理学生物标志物的影响。
研究人员开展了慢性毒性实验研究。简述其关键技术方法：将成年带状吻鲈（n = 150；平均体长7.97 cm；平均体重9.76 g）按每缸10尾、300 L去氯自来水分养于15个PVC缸中，设三个重复，经21天驯化后暴露于5个亚致死浓度CPF（0、15、50、150和500 μg/L）75天，亚致死浓度依据该鱼96 h半数致死浓度（LC50，833 μg/L）及环境相关浓度选定；每15天从各组取3尾鱼经MS222（100 mg/L）麻醉后自尾柄区采血1 mL并以2.7% EDTA抗凝，测定血糖、血红蛋白（Hb）、红细胞（RBC）和白细胞（WBC）计数，并据公式计算红细胞压积（PCV）、平均红细胞体积（MCV）和平均红细胞血红蛋白含量（MCH）；测定肝体指数（HSI）和肾体指数（KSI），肝脏和肾脏样品经10%缓冲福尔马林固定、梯度酒精脱水、苯透明、石蜡包埋，切片（5–6 μm）行苏木精–伊红染色后于数字显微镜下观察；数据采用RStudio以线性混合效应模型分析，经?idák校正进行事后检验，组织病理学改变按无（?）、轻度（+，<10%切片）、中度（++，10%–50%切片）和重度（+++，>50%切片）分级。实验鱼来自孟加拉国Mymensingh的beel Bara，在孟加拉农业大学（BAU）后院孵化场饲养至成鱼，实验方案经BAU动物护理委员会（ACC）批准。
研究结果显示，暴露于500 μg/L CPF的所有鱼在首次取样前死亡，150 μg/L处理组在暴露45天后出现完全死亡，表明基于急性毒性试验确定的亚致死浓度长期暴露可能导致死亡。血液学方面，血糖水平随CPF浓度升高显著增加，第15和30天在50和150 μg/L时显著高于对照，15 μg/L则在第45天起显著升高；RBC计数在所有处理中均显著降低，15和50 μg/L分别需75天和45天产生显著降低；Hb和PCV在所有CPF浓度和所有取样日显著降低；WBC计数在第15和30天于50和150 μg/L显著升高，第45天起所有浓度均显著升高；MCV和MCH随CPF浓度略升，第60和75天在15和50 μg/L显著升高。HSI与KSI方面，HSI随CPF浓度升高在第15天起于15、50和150 μg/L显著增加，而KSI在50和150 μg/L整个暴露期显著降低，CPF暴露未使KSI随时间产生显著变化。肝脏组织病理学方面，对照组肝细胞形态规则、核居中、胞质均匀，CPF处理鱼呈浓度和时间依赖的轻至重度病变，包括空泡化、脂肪变性、血窦扩张、黑色素巨噬细胞聚集和出血；15 μg/L在60和75天多为轻度，50 μg/L在45天起呈中度至重度，75天时出现重度空泡化和出血，150 μg/L在15天起多为轻至中度。肾脏组织病理学方面，对照组肾小球和肾小管正常、Bowman囊清晰，CPF暴露后出现肾小管腔闭塞、小管间间隙增宽、空泡化、黑色素巨噬细胞中心和出血，且随时间和剂量增加而加重；肾小管腔闭塞在50 μg/L第60天起和150 μg/L第15天起显著增加，小管间间隙增宽在50和150 μg/L分别于第45天和第30天起显著，空泡化在50 μg/L第60天后、150 μg/L第15天起出现，黑色素巨噬细胞中心在50和150 μg/L第15天后增加，出血在50 μg/L第30天起和150 μg/L第15天起出现。
讨论部分总结：血液学方面，血糖升高与多种鱼类接触有机磷农药的报道一致，慢性应激下鱼类通过糖皮质激素和儿茶酚胺作用分解糖原以维持稳态和渗透调节所需能量，产生高血糖状态；RBC减少与CPF诱导的皮质醇升高引起红细胞生成抑制、红细胞破坏增加和寿命缩短有关；Hb降低可能归因于稳态紊乱及肾脏和脾脏等造血器官受损；WBC增多可能源于非特异性免疫诱导及针对免疫抑制产生抗体的防御；PCV降低可能与Hb合成受扰有关，MCV和MCH升高可能源于鳃损伤、渗透调节受损、血液稀释、红细胞生成抑制及大细胞性正色素性贫血。HSI与KSI方面，HSI升高可能与CPF暴露致血浆E2水平升高使卵黄蛋白原合成增加有关，也与肝脏宏观和微观病变导致器官重量增加相符；KSI降低可能源于毒物未完全从器官清除而干扰正常代谢，并与肾小管腔闭塞和空泡化等组织病理损伤相关，此类结构改变限制肾脏滤过效率和渗透调节能力。肝脏组织病理学方面，CPF诱导的毒性可能通过产生氧化应激、扰乱代谢和引起细胞损伤而损害肝脏，导致组织病理病变。肾脏组织病理学方面，CPF诱导活性氧（ROS）产生增加导致氧化应激，通过组织病理改变和细胞损伤损害肾脏；肾小管腔闭塞和小管间间隙增宽是肾毒性征象，由肾小管上皮变性、滤过和重吸收过程受损引起；肾小管空泡化提示细胞变性和毒物蓄积所致代谢失衡；黑色素巨噬细胞中心增多表明毒性应激下免疫和解毒机制激活；出血趋势提示血管损伤和肾血管通透性增加；肾脏对农药的保留相对高于其他器官直至毒物被排出。150和500 μg/L浓度均低于该鱼96 h LC50，表明长期暴露可在急性试验视为亚致死的浓度下致死，这种延迟死亡可能反映CPF的累积毒性，连续暴露可引起进行性乙酰胆碱酯酶抑制并伴肝肾功能损伤直至鱼无法维持稳态，提示急性LC50值可能低估CPF长期暴露对鱼类的风险，推导安全环境浓度时应考虑慢性毒性数据，未来慢性研究应在50和150 μg/L之间增设浓度以更好界定剂量–反应关系和慢性致死阈值。结论部分翻译：该研究评估了长期暴露于CPF对带状吻鲈血液生物标志物、体指数及肝脏和肾脏组织病理学的影响。本研究揭示，慢性暴露于15和50 μg/L CPF对带状吻鲈的血液生物标志物、体指数及肝脏和肾脏组织病理学改变具有严重影响，而150 μg/L在第45天后及500 μg/L在整个暴露期无可用数据。研究结果强调，长期暴露于CPF诱导浓度和时间依赖性应激，导致带状吻鲈贫血、肝毒性和肾毒性。这些结果有助于政策制定者评估环境风险，并采取环境可持续的农药施用方法及保护其他水生物种。然而，仍需在分子水平上开展更多毒性评估，因此建议未来研究慢性CPF暴露后对鱼类高级生物标志物如氧化应激反应和基因表达分析的影响，并纳入50至150 μg/L之间的浓度。
