《Theriogenology》：Estradiol regulates trophoblast gene networks involved in adhesion, proliferation, immunomodulation, angiogenesis, and epigenetic regulators via estrogen receptor-dependent mechanisms in the pig.
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雌二醇（E2）是早期孕体信号传导和滋养层功能的重要调节因子，在包括猪在内的多种胎盘哺乳动物围植入期分泌。然而，在猪中，孕体来源的E2被认为是母体妊娠识别的主要信号。研究人员前期研究已确立E2是猪滋养层信号传导和功能的重要调节因子，但其生物学效应主要通过两个核雌
雌二醇（E2）是早期孕体信号传导和滋养层功能的重要调节因子，在包括猪在内的多种胎盘哺乳动物围植入期分泌。然而，在猪中，孕体来源的E2被认为是母体妊娠识别的主要信号。研究人员前期研究已确立E2是猪滋养层信号传导和功能的重要调节因子，但其生物学效应主要通过两个核雌激素受体——雌激素受体1（ESR1）和雌激素受体2（ESR2）介导，二者作为配体激活的转录因子调控下游基因表达。此外，E2还可通过膜相关G蛋白偶联雌激素受体1（GPER1）激活细胞内信号级联，包括丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路。研究人员前期证明ESR1和ESR2在猪滋养层中的表达受E2动态调控，且E2通过ESR1/ESR2调控类固醇和前列腺素合成相关基因的表达，并通过MAPK、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）及雷帕霉素机制性靶蛋白（mTOR）信号通路刺激滋养层增殖和黏附。然而，ESR信号调控猪滋养层功能的基因网络尚待全面阐明。E2还参与表观遗传调控，包括通过DNA甲基转移酶调节DNA甲基化。DNA甲基化在不改变DNA序列的情况下调节基因表达，在组织特异性基因调控中发挥重要作用。从头DNA甲基转移酶3α（DNMT3A）和3β（DNMT3B）与动态发育过程尤为相关，而DNA甲基转移酶1（DNMT1）主要与维持性甲基化相关。然而，E2是否调控猪滋养层中这些表观遗传调节因子的表达尚不清楚。因此，本研究旨在：（1）检测妊娠相关基因，包括整合素亚基αV（ITGAV）、黏蛋白4细胞表面相关（MUC4）、信号转导和转录激活因子3（STAT3）及S100钙结合蛋白A9（S100A9），以及DNA甲基化相关基因（DNMT1、DNMT3A和DNMT3B）的表达谱；（2）表征E2分泌第二峰期间E2应答基因网络，重点关注滋养层细胞黏附、侵袭调控、增殖、细胞因子介导的通讯及血管生成；（3）确定这些反应是否依赖ESR信号；（4）评估E2是否调控DNMT家族成员的基因表达，作为E2信号与猪早期妊娠滋养层表观遗传调控之间的潜在联系。
研究背景：猪早期妊娠涉及孕体与子宫内膜之间精密调控的相互作用，这对植入和胎盘发育至关重要。孕体包括胚胎盘或胚胎及胚外组织，包括滋养层、下胚层来源的胚外内胚层以及后期发育阶段的胚外中胚层。植入和胎盘发育依赖于调控黏附、迁移、侵袭、增殖、免疫调节和血管生成的基因网络的协调调控。雌二醇（E2）是早期孕体信号传导和滋养层功能的重要调节因子，在包括人类、猪、牛、马和羊等多种胎盘哺乳动物的围植入期分泌。然而，在猪中，孕体来源的E2被认为是母体妊娠识别的主要信号，其分泌呈双相模式，第一次增加在母体妊娠识别期（第11–12天），第二次增加与植入相关（第15–30天）。这种双相分泌对妊娠的建立和维持至关重要。研究人员前期研究已确立E2是猪滋养层信号传导和功能的重要调节因子，其生物学效应主要通过两个核雌激素受体ESR1和ESR2介导，二者作为配体激活的转录因子调控下游基因表达。此外，E2还可通过膜相关GPER1激活细胞内信号级联，包括MAPK通路。研究人员前期证明ESR1和ESR2在猪早期妊娠滋养层中的表达受E2动态调控并增加。此外，E2通过ESR1/ESR2调控类固醇和前列腺素合成及早期妊娠建立相关基因的表达，并通过MAPK、PI3K/AKT和mTOR信号通路刺激滋养层增殖和黏附。然而，ESR信号调控猪滋养层功能的基因网络尚待全面阐明。E2还参与表观遗传调控，包括通过DNA甲基转移酶调节DNA甲基化。从头DNA甲基转移酶DNMT3A和DNMT3B与动态发育过程尤为相关，而DNMT1主要与维持性甲基化相关。然而，E2是否调控猪滋养层中这些表观遗传调节因子的表达尚不清楚。因此，本研究旨在检测妊娠相关基因和DNA甲基化相关基因的表达谱，表征E2分泌第二峰期间E2应答基因网络，确定这些反应是否依赖ESR信号，并评估E2是否调控DNMT家族成员的基因表达。
主要技术方法：研究人员从商业屠宰母猪采集孕体，按妊娠阶段分组（预植入期第10–12天n=5、附着/植入起始期第14–16天n=6、植入期第17–19天n=4、早期胎盘形成期第20–25天n=5），采用实时RT-PCR定量基因表达。从妊娠第15天母猪（n=8）分离原代滋养层细胞（细胞纯度约98%），分别进行E2剂量效应实验（10、100、1000 nM处理24 h）和ESR拮抗剂ICI 182,780（1 μM）共处理实验。利用Ingenuity Pathway Analysis（IPA）鉴定E2调控基因相关的信号通路、上游调控因子和生物学功能。
研究结果：
3.1 猪孕体和滋养层中妊娠相关基因及DNA甲基化相关基因的表达谱（实验1）：研究人员表征了参与滋养层增殖、黏附和侵袭的基因（ITGAV、MUC4、STAT3、S100A9）及DNA甲基化相关基因（DNMT1、DNMT3A、DNMT3B）的表达谱。ITGAV在第20–25天（早期胎盘形成期）显著上调；MUC4在第17–19天（植入期）显著升高；STAT3在植入期（第14–19天）和早期胎盘形成期（第20–25天）显著高于预植入期；S100A9在第10–25天逐渐升高，第20–25天显著高于第10–12天。DNMT3A在第14–16天显著低于第10–12天和第20–25天；DNMT3B在第14–16天显著高于第10–12天和第17–25天；DNMT1在各阶段无显著变化。
3.2 E2通过ESR1/ESR2调控猪滋养层细胞中妊娠相关基因和DNA甲基化相关基因（实验2和3）：E2调控滋养层增殖、黏附、侵袭和细胞因子介导通讯相关基因的表达。所有测试浓度的E2均显著增加BGN、IGF1、MUC4、TNF和WNT5A mRNA表达；10和100 nM E2显著增加MMP2和S100A9表达；100和1000 nM E2增加ITGAV、STAT3和TGFB1表达；10 nM E2增加LIF表达，100 nM增加IFNG表达，1000 nM增加MMP9表达；10和1000 nM E2显著降低SPP1 mRNA表达；E2对HIF1A和HSP90AB1无显著影响。ICI消除了E2对所有测试基因的刺激效应（除TGFB1外）。E2还调控血管生成相关基因：所有浓度E2显著增加ANGPT2、CCN2、FGF2和RCAN1表达；10和1000 nM E2增加KDR表达；100和1000 nM E2增加FLT1表达；E2对VEGFA无显著影响。ICI消除了E2对上述基因的刺激效应（除KDR外）。在DNA甲基化相关基因方面，E2和ICI均不影响DNMT1表达；100 nM E2显著增加DNMT3A表达；所有浓度E2增加DNMT3B表达；ICI共处理消除了E2对DNMT3A和DNMT3B的刺激效应。
3.3 猪滋养层中E2调控基因相关通路和调控因子（实验4）：IPA基于E2应答基因表达数据预测了59条经典通路的激活或抑制。比较妊娠第12天和第15天的基因表达谱，鉴定出17条预测激活或抑制的经典通路，且E2处理分析与第12–15天比较之间的通路激活或抑制方向一致。IPA疾病和生物学功能分析鉴定出174个预测激活或抑制的术语，选定预测激活的功能涉及胚胎细胞黏附、细胞迁移、细胞骨架组织、祖细胞分化、上皮细胞系增殖、干细胞凋亡、血管长出、炎症反应、趋化性、类固醇和脂肪酸代谢、前列腺素合成、分子转运、MAPKKK级联、PKB信号、DNA结合和转录及Ca
2+释放。上游调控因子分析鉴定出222个分子，包括microRNA和转录因子，预测的上游调控因子包括E2、PTGS2、TGFB家族成员（TGFB1、TGFB2、TGFB3）、IFNG、IL1B、TNF和HIF1A，提示E2信号与前列腺素、细胞因子、TGFβ和缺氧相关通路之间的联系。IPA还鉴定出miR-155-5p、miR-124-3p和miR-21-5p为E2应答基因的预测上游调控因子。
讨论部分总结：本研究通过整合发育基因表达谱与IPA分析的生物学功能、经典通路和上游调控因子，全面展示了猪滋养层中E2驱动的ESR依赖性转录调控。研究结果表明，E2作为猪母体妊娠识别的主要胚胎信号，除对子宫内膜的作用外，还直接调控滋养层功能。第10–25天观察到的时间变化表明，ITGAV、MUC4、STAT3和S100A9等黏附、增殖和信号转导相关基因在早期妊娠中受动态调控，E2也调节其中多个基因的表达，表明E2可能参与其发育调控。猪具有真正的上皮绒毛膜胎盘，母体腔上皮在整个妊娠期间保持完整，导致非侵袭性胎盘形成，因此经典上与滋养层侵袭相关的基因在猪中主要在滋养层黏附、迁移、细胞外基质（ECM）重塑和附着背景下解读。E2调控的基因参与滋养层黏附、迁移、ECM重塑、侵袭和增殖等妊娠发育必需过程。MMP2和MMP9是ECM重塑的最佳特征调控因子之一。研究人员前期证明E2刺激猪滋养层黏附和增殖，SPP1和ITGAV是附着的关键调控因子，本研究结果表明E2调控这两个基因的表达。E2诱导的SPP1 mRNA表达降低可能反映了一种调节机制，即根据母体–孕体界面丰富的子宫内膜SPP1调整孕体来源的SPP1表达。LIF–STAT3信号在滋养层黏附和植入中也发挥重要作用，E2诱导的LIF和STAT3表达变化提示E2可能通过调节LIF–STAT3通路参与植入。在人绒毛外滋养层细胞中，HIF1A促进ITGAV/ITGB3整合素聚集，从而调控侵袭过程中滋养层行为。虽然猪胎盘形成是非侵袭性的，但缺氧信号可能参与滋养层黏附、迁移、ECM重塑和血管适应。比较分析提示E2与缺氧信号之间的相互作用。IPA还鉴定出与MAPK级联、PKB/AKT信号、STAT3通路、FAK信号和ECM组织相关的生物学功能和经典通路，这与研究人员前期证明MAPK、PI3K/AKT和mTOR通路参与E2调控的猪滋养层黏附和增殖的证据一致。IPA还鉴定出miR-155-5p、miR-124-3p和miR-21-5p为预测上游调控因子，这些microRNA调控细胞迁移、增殖和侵袭，且miR-155和miR-21在猪早期妊娠母体–孕体界面差异表达。这些microRNA由IPA预测而非本研究直接测量，其作为上游调控因子的作用尚需验证。成功妊娠建立和发育需要半同种异体孕体与母体免疫系统之间的协调免疫相互作用。E2依赖性调控IL1B2、IFNG、LIF和TNF提示孕体可能通过调节植入期间细胞因子表达影响母体免疫适应。与实验发现一致，IPA将E2调控基因与免疫反应和炎症相关通路关联，包括S100家族信号、IL-17信号、IL-8信号、IL-33信号、NF-κB信号和NOD1/2信号。上游调控因子分析预测了IL6、IL1B、TNF、IFNG和CX3CL1的参与。总之，这些发现提示E2可能参与早期妊娠中细胞因子介导的胚胎–母体通讯和免疫适应。胎盘高度血管化，其血管网络的建立对成功妊娠至关重要。本研究中E2增加ANGPT2、CCN2、FGF2、FLT1、KDR和RCAN1的表达，提示其参与植入期猪滋养层血管生成相关基因网络的调控。ICI消除了E2对大多数血管生成相关基因的转录应答，支持ESR依赖性调控。然而，E2诱导的KDR表达增加仅被部分消除，提示其他机制可能参与其调控。这些发现与IPA结果一致，后者将E2调控基因与血管相关通路关联，包括HIF1A信号、内皮型一氧化氮合酶（eNOS）信号和ECM组织，以及与血管生成、血管化、内皮细胞活化和血管长出相关的生物学功能。适当的胚胎发育需要精确的表观遗传调控，DNA甲基化是早期妊娠控制基因表达的关键机制之一。DNMT3A和DNMT3B在第10–25天之间的动态表达及DNMT1的稳定表达，与从头DNA甲基化在早期孕体发育中的潜在作用一致。本研究表明E2通过ESR调控DNMT3A和DNMT3B mRNA表达而不影响DNMT1表达，这与之前报道E2通过ESR依赖性机制调控人子宫内膜细胞系中DNMT3B表达及调节猪子宫内膜和黄体中DNA甲基化相关过程一致。IPA还鉴定出染色质相关通路，包括组蛋白修饰信号和HOTAIR调控通路。然而，本研究未预测DNA甲基化相关通路的激活，也未直接测量DNA甲基化水平。鉴于DNMT3A和DNMT3B在从头DNA甲基化中的既定作用，这些发现提示E2可能调控滋养层细胞中表观遗传机制的组分，但这些转录变化是否导致DNA甲基化改变尚待确定。
研究结论翻译：研究人员的发现表明，E2通过ESR依赖性机制调控早期植入期间与滋养层黏附、迁移、ECM重塑、侵袭控制、增殖、细胞因子介导通讯和血管生成相关的基因网络。这些结果支持E2信号在早期妊娠滋养层功能中的作用。DNMT3A和DNMT3B的选择性调控而对DNMT1无影响，提示E2信号与滋养层细胞表观遗传调控格局之间存在潜在联系，尤其是从头DNA甲基化机制。虽然未直接测量DNA甲基化，但DNMT表达与滋养层功能相关基因的同步调控提示E2可能影响表观遗传调控机制。需要进一步整合基因表达和DNA甲基化分析的研究来确定E2诱导的DNMT表达变化是否导致与滋养层功能相关的表观遗传修饰。
