幼年猫科动物睾丸组织冷冻保存中控速慢速冷冻作为一种有前景的策略

《Theriogenology》：Controlled-rate slow freezing as a promising strategy for juvenile feline testicular tissue preservation

　　

控速慢速冷冻和玻璃化冷冻在解冻/复温后均能维持组织的形态测量学指标。培养揭示了两种冷冻保存程序后的渐进性损伤。冷冻保存后培养显示玻璃化冷冻组织损伤更严重。慢速冷冻比玻璃化冷冻更好地保存了幼年猫睾丸组织。无液氮控速慢速冷冻对于猫科动物组织库建设具有前景。

论文解读文章

一、研究背景与目的

睾丸组织是未成熟生殖细胞（包括精原干细胞）的重要来源，其冷冻保存为无法获取成熟精子的个体（如青春期前个体、接受性腺毒性治疗的男性、以及因去势手术或意外死亡的动物）保留了恢复生殖潜力的可能性。然而，睾丸组织冷冻保存面临挑战，因为睾丸是一种复杂且异质的组织，包含不同发育阶段的生殖细胞以及对冷冻保护剂（CPAs）渗透性、含水量和敏感性各异的多种体细胞群体，这使得组织保存比分离细胞的冷冻保存更具难度。

在猫科动物中，睾丸组织保存也有助于基因组资源库建设和濒危物种遗传物质的保护。家猫因其与非家养猫科动物在系统发育和繁殖上的相似性，被广泛用作开发和优化可能适用于野生物种的繁殖技术的模型。该模型对幼年组织尤为重要，因为生育力保存依赖于维持未分化生殖细胞及其后续发育所需的支持性体细胞微环境。

玻璃化冷冻和慢速冷冻是睾丸组织冷冻保存的主要方法。玻璃化冷冻使用高浓度CPAs和超快速冷却，使生物样品和周围冷冻保护溶液进入玻璃态而不形成冰晶，但其有效性取决于冷却和升温速率、CPA组成和暴露时间以及组织碎片大小。尽管玻璃化冷冻快速且不需要可编程冷冻仪，但高浓度CPA可能导致渗透压和化学应激，损害细胞和组织完整性。相比之下，慢速冷冻在相对低浓度CPA存在下进行逐步冷却，允许渐进性细胞脱水同时限制细胞内冰晶形成，其有效性取决于冷却曲线和冰核形成的精确控制。值得注意的是，慢速冷冻包含不同方法：控速慢速冷冻（CSF）使用可编程热曲线，可以有意定义冷却速率、保持步骤和冰核形成；而非控速或被动慢速冷冻则依赖被动冷却装置或冷冻室的热特性获得近似冷却速率。这一区别在低温生物学上具有重要意义，因为可控冷冻允许在细胞外冰形成驱动细胞脱水的阶段修改冷却曲线，而手动植冰可以减少与自发过冷和冰核形成相关的变异性。

尽管从冷冻保存的猫睾丸组织中回收的精子已取得有希望的繁殖结果，但目前尚未建立标准化方案，最佳冷冻保存技术仍不明确。因此，本研究旨在比较玻璃化冷冻和控速慢速冷冻用于幼年家猫睾丸组织冷冻保存的效果，并通过组织形态计量学、组织形态学和免疫组织化学分析评估组织在复温或解冻后以及经过48小时体外培养后的恢复能力。

二、主要关键技术方法

研究人员从17只青春期前和早期青春期的雄性家猫获取睾丸，作为选择性去势手术的副产品，立即在4°C下运输至实验室并在24小时内处理。仅纳入重量<1克的睾丸，对应青春期前和早期青春期动物。睾丸组织碎片通过使用1.5毫米直径活检穿孔器从1毫米厚的睾丸实质切片中获得。实验设计包括新鲜对照组（固定于收集后即刻或培养48小时后）、玻璃化冷冻组和慢速冷冻组。玻璃化冷冻采用含1.4M二甲基亚砜（DMSO）、1.4M甘油（GLY）、0.25M蔗糖和5%胎牛血清（FBS）的平衡液及含2.8M DMSO、2.8M GLY、0.5M蔗糖和10% FBS的玻璃化溶液，随后直接浸入液氮。慢速冷冻使用含1.5M DMSO、0.1M蔗糖和10 mg/mL牛血清白蛋白（BSA）的冷冻液，采用可编程冷冻仪（VIA Freeze Research, Cytiva）执行特定降温程序，包括4°C平衡30分钟、以-2°C/分钟降至-7°C并保持10分钟进行手动植冰、以-0.3°C/分钟降至-40°C、再以-2°C/分钟降至-100°C。组织碎片在琼脂糖基器官型培养系统中于35°C、5% CO?条件下培养48小时。固定后进行苏木精-伊红（H&E）染色及针对增殖标志物微小染色体维持蛋白7（MCM-7）、凋亡标志物活化半胱天冬酶-3（CASP3）、未分化生殖细胞标志物蛋白基因产物9.5（PGP9.5）和减数分裂生殖细胞标志物联会复合体蛋白3（SYCP3）的免疫组织化学分析。

三、研究结果

3.1 组织形态计量学评价

冷冻保存后，两种技术在复温/解冻后即刻均保持了整体组织分区分布。玻璃化冷冻组和慢速冷冻组的管状面积、纤维化面积和坏死面积与新鲜对照组相比均无显著差异。培养本身在很大程度上维持了组织结构，新鲜培养48小时组的管状和纤维化面积与新鲜对照组相当，但坏死面积略有增加。在培养的冷冻保存组中观察到更明显的变化：玻璃化冷冻48小时组和慢速冷冻48小时组的管状面积较各自非培养组显著下降，且均低于新鲜对照组和新鲜培养组。值得注意的是，玻璃化冷冻48小时组在所有实验组中管状面积最低，表明玻璃化冷冻后管状区室损失更大。管状面积的减少伴随坏死面积增加，两组坏死面积均显著高于冷冻保存后即刻以及新鲜对照组和新鲜培养组。纤维化面积相对于新鲜对照组也有所增加。

3.2 组织形态学评价

冷冻保存后即刻，玻璃化冷冻组正常曲细精管比例显著低于新鲜对照组和慢速冷冻组，表明复温后即刻已可检测到形态学损伤。而慢速冷冻组正常曲细精管比例与新鲜对照组相当。玻璃化冷冻组的减少主要与基膜改变频率较高有关，同时两种冷冻保存组的固缩核频率均高于新鲜对照组。培养后，玻璃化冷冻48小时组和慢速冷冻48小时组的正常曲细精管比例较各自非培养组进一步降低，且均低于新鲜对照组和新鲜培养组。这种减少主要与基膜改变有关。此外，玻璃化冷冻48小时组表现出比其他所有组更大的细胞脱落和最高的固缩核百分比。

3.3 免疫组织化学评价

冷冻保存后即刻，玻璃化冷冻组维持了CASP3和SYCP3阳性细胞密度与新鲜对照组相当，但MCM-7和PGP9.5阳性细胞密度降低。相比之下，慢速冷冻组保持了增殖细胞、精原细胞和减数分裂生殖细胞群体，且未增加凋亡活性。两种冷冻保存程序之间，玻璃化冷冻组的MCM-7阳性细胞密度低于慢速冷冻组。培养后，尽管新鲜培养组CASP3阳性细胞密度增加，但增殖细胞、精原细胞和减数分裂生殖细胞群体得以维持。冷冻保存后培养呈现类似模式：玻璃化冷冻48小时组和慢速冷冻48小时组的MCM-7和SYCP3阳性细胞密度与相应非培养组相当，但CASP3阳性细胞增加。然而，玻璃化冷冻48小时组的MCM-7阳性细胞密度低于慢速冷冻48小时组。一致的是，玻璃化冷冻48小时组PGP9.5阳性细胞密度最低，显著低于玻璃化冷冻后即刻和慢速冷冻48小时组，而慢速冷冻组从解冻后即刻到培养后未见显著下降。

四、讨论与结论

本研究表明，尽管玻璃化冷冻和控速慢速冷冻在复温/解冻后即刻均维持了整体组织分区分布，但后者更好地维持了曲细精管形态和生殖细胞群体。随后的短期培养证实了这一模式，显示慢速冷冻组织比玻璃化冷冻组织具有更强的维持结构和细胞完整性的能力。

讨论部分指出，大多数关于家猫睾丸组织冷冻保存的研究集中在玻璃化冷冻及其技术变量优化上，这可能反映了玻璃化冷冻快速、相对简单且成本效益高的实际优势。然而，即使在本研究采用的优化条件下，玻璃化冷冻所需的高CPA浓度仍会使异质性睾丸组织承受显著的化学和渗透压应激，且成功保存依赖于快速且精心控制的复温过程。慢速冷冻通过结合较低CPA浓度和逐渐冷却促进渐进性细胞脱水，同时限制细胞内冰晶形成。与先前一项在幼年猫样本中发现玻璃化冷冻倾向于更高细胞活力和曲细精管完整性的研究不同，本研究显示慢速冷冻提供了更好的保存效果。这些差异可能部分归因于不同的实验条件：先前研究使用了被动或渐进式冷却，而本研究采用了可编程多步曲线配合手动植冰和较慢的成核后冷却速率。在被动系统中，自发冰核形成可能在不同程度的过冷后发生，而可控植冰在定义温度启动细胞外冰形成，促进后续冷却过程中更渐进的细胞脱水。此外，CPA暴露也不同。本研究使用的冷冻程序改编自牛卵巢组织保存的方案，慢速冷冻后家猫睾丸碎片在解冻后即刻保持了管状、纤维化和坏死面积以及正常曲细精管比例与新鲜组织相当的水平，MCM-7、PGP9.5和SYCP3阳性细胞密度也得以维持，且未显著增加CASP3免疫反应性。这种有利的保存可能部分归因于手动植冰期间对细胞外冰形成的受控诱导，减少了过冷并促进了渐进性细胞脱水。

短期培养提供了单独从复温/解冻后即刻评估无法获得的额外信息。在新鲜组织中，培养增加了CASP3免疫反应性并导致坏死面积和基膜改变的适度增加，但主要组织区和生殖细胞群体得以维持。当培养在冷冻保存后进行时，出现了不同的模式：两种冷冻保存组的管状面积和正常曲细精管减少、坏死组织增加、渐进性基膜改变以及CASP3免疫反应性增强。然而，培养后损伤的程度在两种冷冻保存程序间存在差异：玻璃化冷冻48小时组显示出最低的管状面积、最大的细胞脱落和最高的固缩核发生率，以及最低的MCM-7和PGP9.5阳性细胞密度。相比之下，慢速冷冻组的精原细胞群体从解冻后即刻到培养后保持稳定，而增殖细胞在慢速冷冻48小时组中比玻璃化冷冻48小时组更丰富。CASP3免疫反应性在培养期间的增加在新鲜组织和冷冻保存组织中均有观察到，并伴有更大的坏死面积，表明外植体培养对细胞应激的贡献。然而，CASP3免疫反应性在玻璃化冷冻48小时组和慢速冷冻48小时组之间并无差异，也未与所有生殖细胞群体的均匀耗竭相关联。因此，玻璃化冷冻后较差的结果不能仅归因于凋亡的普遍增加，而可能反映了结构破坏和特定细胞群体选择性脆弱性的综合效应。精原细胞群体在慢速冷冻后得以维持而在玻璃化冷冻后未能维持这一点尤为重要，因为未分化精原细胞必须存活、自我更新并随后分化以支持精子发生的恢复。

研究结论部分翻译如下：本研究提供了关于玻璃化冷冻和控速慢速冷冻用于幼年猫睾丸组织冷冻保存的进一步比较证据。尽管两种程序在冷冻保存后即刻均维持了整体组织分区分布，但特定的结构和细胞改变在玻璃化冷冻后已经显现，并在后续培养中变得更加明显。慢速冷冻尤其有利于维持曲细精管完整性和生殖细胞群体，使其成为未来猫睾丸组织库建设和体外精子发生策略的有前景的基础。