《Theriogenology》：Equine trophoblastic vesicles: ultrastructural and histologic features, extracellular vesicle production, and hormone secretion
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马滋养层囊泡（TRV）可在培养第10天或第14天马孕体碎片后自发形成。马TRV具有与完整马孕体滋养层细胞相似的超微结构特征。马TRV以时间依赖方式产生前列腺素E（PGE）和雌二醇-17β（E2）。马TRV产生小型细胞外囊泡（EV）。
马滋养层囊泡（TRV）可在培养第10天或第14天马孕体碎片后自发形成。马TRV具有与完整马孕体滋养层细胞相似的超微结构特征。马TRV以时间依赖方式产生前列腺素E（PGE）和雌二醇-17β（E2）。马TRV产生小型细胞外囊泡（EV）。
研究背景：马产业中早期胚胎死亡造成的经济损失巨大，理解滋养层细胞与母体妊娠识别（MRP）相关的功能机制有助于缓解这一问题。MRP涉及胚胎滋养层与子宫内膜之间的通讯，最终维持孕酮的持续产生以维持妊娠。马胚胎在早期发育阶段即开始分泌雌二醇-17β和前列腺素（PG）。前列腺素在马早期妊娠建立中发挥重要作用，既包括促黄体溶解的前列腺素F2α（PGF），也包括促黄体功能的前列腺素E（PGE）。然而，尽管已有大量研究，马滋养层细胞在妊娠识别中的功能机制仍未被完全阐明。细胞外囊泡（EV）作为一种新兴的胚胎-母体通讯机制，是纳米级球形结构，通过转移蛋白质、脂质、miRNA和mRNA等生物活性物质介导细胞间通讯。EV已在多种物种的血清、精液、子宫内膜组织、子宫肌层细胞、输卵管组织和胚胎中被分离获得，并在滋养层-子宫内膜界面的细胞间通讯中发挥重要作用。在马中，近期研究表明妊娠与非妊娠母马子宫液中EV的转录组和蛋白质组货物存在差异，但迄今尚无研究显示马胚胎产生EV。马胚胎在排卵后第5-6天通过输卵管子宫连接处进入子宫，至第8天直径约800 μm，第10天达4 mm，第14天达15-17 mm，此时胚胎体及其膜被称为孕体。这种显著的生长和高代谢需求使得完整马孕体的长期体外培养在技术上具有挑战性。替代方法是使用孕体碎片，其可自发形成类器官样结构即滋养层囊泡（TRV）。Ball建立了将体内来源孕体分割为小碎片并培养以产生TRV的方案。TRV可能具有在体外模拟滋养层细胞功能的潜力。当TRV被注入间情期非妊娠母马子宫时，可延长56%处理母马的黄体期，并分泌与完整孕体相似的多肽。TRV的全面表征尚未完成，而这对于确定TRV是否可作为研究马滋养层细胞功能和妊娠识别的有用体外模型至关重要。研究人员假设TRV将：产生EV，具有与完整孕体滋养层细胞相似的超微结构特征，以及相似的功能特性包括以时间依赖方式分泌雌二醇-17β和PG。研究目标是表征TRV的结构、超微结构和功能特征，并将其与马孕体进行比较。
研究人员开展了以下研究：使用10匹轻种母马，随机分配至排卵后第10天（D10）或第14天（D14）采样。通过直肠触诊和超声监测发情，使用deslorelin诱导排卵，人工授精后收集孕体。D10收集6个孕体，D14收集6个孕体。收集后去除孕体胶囊，将孕体切成1-2 mm碎片，每6-7个碎片转移至培养液中，在37°C、5% CO2、6% O2和89% N2的湿润环境中培养以生成TRV。每12小时更换培养基，最长4天，过滤后保存于-80°C。TRV通过光镜和电镜进行表征，包括苏木精染色、油红O染色检测脂质、透射电镜（TEM）和扫描电镜（SEM）观察超微结构。新鲜D10和D14孕体也进行TEM处理以与TRV比较。部分D14 TRV在培养48和60小时后进行冷冻保存，解冻后评估存活率。功能表征包括：使用酶免疫分析试剂盒检测 conditioned culture media（CCM）中PGE和雌二醇-17β浓度；使用ExoQuick-TC试剂盒从TRV CCM中分离EV；Bradford法测定EV蛋白浓度；SDS-PAGE和免疫印迹检测EV标志物（Tsg101、Hsp70、Hsp90）以及内质网蛋白钙网蛋白和线粒体蛋白细胞色素C；TEM负染观察EV形态。统计分析使用R软件，激素数据经对数转换后采用线性混合效应模型分析。
研究结果：（1） progesterone blood concentration：所有母马血清孕酮浓度均高于12 nmol/L，范围12.8-35.9 nmol/L，证实所有采样点黄体功能正常。（2）Embryo and TRV culture：共收集6个D10和6个D14孕体。D10胚胎均完整回收，D14胚胎多数塌陷。切割后D10和D14 TRV在前48-60小时呈指数增长，随后静止，部分TRV改变细胞形态形成细胞单层。48小时平均产生82和134个囊泡。（3）TRV cell characterization：TRV为球形，具有1-3层细胞结构。D14 TRV细胞更细长，D10 TRV小囊泡中细胞高圆、大囊泡中细胞细长。D14 TRV含大脂滴（油红O证实）。D10 TRV有更多核分裂象，D14 TRV更多细胞退行性变化且常与附着孕体碎片相关。细胞极性化，具顶端微绒毛和顶端紧密连接。D14 TRV有多个桥粒连接和增加的细胞间隙。D10 TRV有发达的小内质网、多个线粒体、小脂滴、多聚核糖体和粗面内质网。D14 TRV有多个大脂滴、增加的粗面内质网和线粒体。所有TRV均可见多囊体。SEM显示D10 TRV表面呈卵石样，微绒毛丰富。（4）Conceptus ultrastructural characterization：D10和D14孕体经光镜和TEM观察。内细胞团（ICM）由2-3层细胞组成，基底层为细长细胞（内胚层），类似多层TRV的基底细胞。D10滋养层细胞有发达的滑面内质网、多聚核糖体、粗面内质网、顶端微绒毛、脂滴、过氧化物酶体和顶端紧密连接。D14孕体滋养层细胞可见多囊体、大脂滴和丰富线粒体，与D14 TRV细胞相似。（5）Cryopreservation and viability of TRV：80个D14 TRV冷冻保存、解冻后评估存活率，总体解冻后存活率为10%。解冻后24小时培养，附着于先前冷冻TRV的孕体组织碎片发育出新TRV。（6）Functional characterization of TRV：Hormone production：TRV分泌E2，水平随时间显著变化（p<0.001），随TRV数量增加而增加（p<0.001），D10与D14间差异显著，时间与胚胎天数交互作用高度显著（p<0.001）。D10 TRV的E2分泌随时间增加（约每小时3.5%），D14 TRV的E2分泌随时间下降（约每小时2.0%），时间趋势分析显示发育阶段间分泌动态相反（p<0.0001）。TRV分泌PGE，受时间（p<0.001）和时间与组别交互作用（p<0.001）显著影响。PGE产生与TRV数量无关（p=0.723）。D10 TRV的PGE分泌随时间增加（约每小时1.4%），D14 TRV显著下降（约每小时2.6%），时间斜率差异高度显著（p<0.0001）。D10 TRV基线PGE浓度倾向高于D14 TRV，但未达统计学显著（p=0.087）。EV isolation：新鲜非条件TRV培养基经相同EV分离流程处理作为阴性对照，免疫印迹未检测到EV相关标志物Hsp70、Hsp90或Tsg101。TRV CCM中分离的EV富集制剂平均蛋白浓度D10为0.12 mg/dL，D14为0.65 mg/dL。钙网蛋白和细胞色素C在CCM中强检测，而在EV富集制剂中仅极弱检测，支持EV富集和细胞污染物显著去除。EV相关标志物Hsp90和Tsg101在EV制剂中富集，尤其D14。Hsp70也在EV富集制剂中检测到，尤其D14，但CCM中也有极低检测。TEM确认存在膜结合囊泡，直径主要为20-50 nm。
讨论部分总结：理解马MRP期间滋养层生理和细胞间通讯需要评估早期马孕体分泌的因子和激素。然而，体内来源马孕体的直接培养因快速生长、大尺寸、高代谢和浮力特性而效率低且技术挑战大。TRV可能代表研究滋养层细胞功能的 promising 体外模型替代方案。本研究成功从D10和D14马孕体碎片生成TRV，48小时平均产生82和134个囊泡，高产率大幅增加单个孕体的实验单位数量，并有助于减少生殖研究中动物使用。研究发现与先前报道一致。Ball报道从D12-16马孕体碎片形成TRV并分泌与完整孕体相似分子特征的蛋白质。Hehnke对D10孕体进行酶解离并培养胚胎细胞，初始产生单层随后形成囊泡。本研究也观察到部分TRV在培养72-96小时后转变为单层。TRV的许多特征与完整马孕体滋养层 closely 相似。TRV显示1-3层细胞层，由细长或圆形细胞组成。Ball描述TRV具有内胚层和内层及外层含脂外胚层。与之一致，油红O染色观察到TRV中丰富的细胞内脂滴。定性超微结构评估显示D10和D14 TRV间轻微差异。D10 TRV有比例更多的滑面内质网和小脂滴，为类固醇生成细胞特征。D14 TRV含更大脂滴和更显著粗面内质网。多层TRV与完整孕体共享额外结构特征，包括类似内胚层的基底层细长细胞和内部腔体。值得注意的是，D14 TRV显示增加的基底外侧细胞间隙，可能反映类似早期胚胎囊胚腔扩张的液体积累机制。据研究人员所知，本研究首次提供马TRV的详细超微结构表征。功能上，TRV向培养基分泌PGE和雌二醇-17β。D10 TRV激素产生初始高，随后急剧下降并随时间缓慢增加。这种双相模式可能反映细胞对培养条件的适应以及从孕体组织碎片向建立TRV的转变。前12小时高激素浓度可能源于最初置于培养的代谢活跃孕体组织，随后下降可能反映TRV形成过程中的组织重塑和适应。此后激素浓度增加可能与TRV生长和代谢活跃滋养层细胞数量增加有关。相反，D14 TRV激素分泌初始高然后随时间下降。D10和D14 TRV间激素分泌模式差异可能反映不同胚胎阶段来源TRV间代谢活性或对培养条件敏感性的差异。D10 TRV显示更少死细胞、更多核分裂象和与早期类固醇生成一致的超微结构特征如小脂滴，而D14 TRV显示增加细胞碎片和大脂滴。然而，由于未评估活力，无法确定激素产生下降是否源于活力降低、次优培养条件或D10与D14 TRV间代谢活性差异。未来研究应在整个培养期间纳入活力评估。Hehnke报道D10孕体来源TRV产生雌二醇，并证明激素输出随处理强度变化，强调类固醇生成功能对培养条件的敏感性。其研究还在TRV条件培养基中检测到其他几种类固醇，趋势为雌二醇-17β>雌酮>孕酮>雄烯二酮>睾酮。本研究中雌二醇-17β浓度依赖TRV数量，而PGE浓度不依赖，可能反映底物限制或前列腺素合成功能丧失。总之，这些观察表明TRV保留滋养层类固醇生成功能的关键方面，因此可作为研究马孕体激素信号的有用模型。重要的是，本研究首次提供马TRV分泌EV的证据，得到TEM金标准和EV富集制剂中EV相关标志物Hsp70、Hsp90和Tsg101检测的支持，尤其D14 TRV来源者。EV制剂中有非囊泡细胞成分钙网蛋白和细胞色素C的痕迹，但与相同总蛋白浓度评估的CCM中这些蛋白的显著检测形成鲜明对比。尽管如此，未来研究中持续监测和改善EV纯度将很重要。迄今尚无研究确认完整马孕体或滋养层分泌EV。在其他家畜物种中，EV已成为母体妊娠识别的关键介质，通过促进生物活性货物转移。牛胚胎来源EV富集干扰素-τ（IFN-τ），在绵羊中子宫内膜EV含刺激滋养外胚层分泌IFN-τ的mRNA。本实验条件下TRV产生EV，可能与早期妊娠中EV介导信号相关。需要进一步研究确定早期马胚胎滋养层或孕体是否能够释放、摄取或交换EV，因为糖蛋白胶囊已被证明是小纳米颗粒摄取的屏障。EV研究不仅为阐明马MRP机制而且为基于EV的通讯提供了有希望的途径。冷冻保存代表建立体外模型的实用优势。本研究中TRV解冻后存活率仅10%，与Hehnke报道的冷冻保存和168小时培养后11%存活率一致。有趣的是，研究人员观察到解冻后附着于囊泡的孕体碎片形成新TRV。一些类器官和TRV系统通过冷冻保存组织碎片而非完全形成的囊泡实现更好存活，因为固体组织可能允许更有效的冷冻保护剂渗透和去除。相反，TRV是充满液体的结构，可能影响冷冻保护剂平衡并导致细胞毒性。未来改进冷冻保存方案聚焦于孕体碎片冷冻而非TRV冷冻可能增强TRV的长期适用性。尽管有这些进展，本研究有许多局限性。首先，TRV来源EV货物的功能验证尚未进行，未来研究应表征EV分子内容（如miRNA、蛋白质）并评估其对马子宫内膜细胞的体外效应。其次，培养条件未完全复制子宫内膜生理环境，优化培养基组成或其他培养条件可能更好地支持TRV活力和功能，尤其D14 TRV。第三，分割孕体时未将内细胞团与其余孕体分离，TRV的具体细胞谱系尚未完全表征。最后，使用TRV作为研究马孕体模型的主要限制是缺乏黏蛋白胶囊。胶囊在透明带下方形成，是保护和支撑早期孕体存活及妊娠识别的关键结构。值得注意的是，体外生产胚胎在移植到子宫前也不形成胶囊。已显示将TRV移植到母马后，胶囊囊泡发育。TRV和子宫内膜组织共培养可能是胶囊形成所需的。在当前模型中，TRV不被胶囊包围，因此使用该模型解释滋养层-子宫内膜EV通讯应谨慎。TRV模型尤其随着培养条件随时间改善，可能在其他生理、药理、病理或毒理研究中具有效用。研究结论翻译：总之，TRV与完整马孕体共享关键形态学、超微结构和功能特征，并显示出作为研究母马滋养层功能机制的有价值替代体外模型的前景。D10与D14来源TRV谱的明显差异表明较早发育阶段可能更适合模拟关键滋养层功能如激素分泌。进一步研究应探索改善培养条件、TRV细胞的免疫表型和转录组谱以阐明细胞谱系组成，以及EV内容物以加深对其类固醇生成和细胞信使功能的理解。
