《Advanced Science》：Bacterial Geosmin Biosynthesis is Compartmentalized Inside a Two-Component Protein Shell
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萜类化合物（terpenoids）是存在于三个生命域中的结构多样化天然产物。土臭味素（geosmin）是一种挥发性的潮土味化合物，负责土壤的泥土气味，人类对其感知阈值低至几万亿分之一。对细菌土臭味素合成酶（GeoA）编码基因簇的生物信息学分析表明，许多基因簇与
萜类化合物（terpenoids）是存在于三个生命域中的结构多样化天然产物。土臭味素（geosmin）是一种挥发性的潮土味化合物，负责土壤的泥土气味，人类对其感知阈值低至几万亿分之一。对细菌土臭味素合成酶（GeoA）编码基因簇的生物信息学分析表明，许多基因簇与编码Family 2B encapsulin壳蛋白的基因共定位。本研究聚焦于模式黏细菌Myxococcus xanthus中编码encapsulin的土臭味素基因簇，研究表明两种壳蛋白形成一个双组分Family 2B encapsulin，以GeoA作为内化货物（cargo）。结构分析突出显示该壳含有特征性的外部环磷酸腺苷（cAMP）结合折叠结构域（CBDs），且混合壳可采用此前未观察到的闭合二重孔构象。研究表明GeoA货物装载由重复的短货物装载肽（CLPs）介导，且GeoA的包封为酶活性和稳定性提供益处。本研究拓展了已知参与特化代谢物生物合成的Family 2B encapsulin的简短列表，并为通过孔道状态调节实现货物蛋白调控的推测模式提供了见解。
**研究背景**
萜类化合物（terpenoids）是自然界中结构最多样化的天然产物家族之一，已鉴定超过80 000种化合物，广泛分布于三个生命域中。所有萜类化合物均衍生自两种五碳异戊二烯单元：异戊烯基焦磷酸（IPP）及其异构体二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）。通过聚异戊二烯基转移酶、萜类合成酶及后续修饰酶的作用，这些简单构建模块被转化为大量线性和环状骨架。尽管萜类化合物历史上主要从植物和真菌中分离，但基因组数据的扩展表明细菌编码大量含有聚异戊二烯基转移酶和萜类合成酶的天然产物生物合成基因簇（BGCs），具有巨大的萜类生产潜力。细菌产生的两种最普遍的萜类化合物是2-甲基异莰醇（2-MIB）和土臭味素（geosmin）。土臭味素生物合成自1965年分离以来已被广泛研究，其生物合成分析主要围绕GeoA酶展开，该酶催化十五碳法尼基焦磷酸（FPP）前体通过两步过程转化为土臭味素。GeoA由两个不同的萜类环化酶结构域组成，通过一条长的柔性连接区相连。然而，encapsulin壳对土臭味素生物合成的影响此前未在任何系统中被表征。
Encapsulin纳米区室是一类原核蛋白区室，广泛分布于细菌和古菌门中。一般而言，encapsulin是自组装、载货的蛋白壳，货物蛋白的性质决定特定功能。所有encapsulin壳蛋白共享HK97噬菌体样折叠，形成二十面体蛋白壳，直径约20至50 nm， triangulation数（T）为T=1（60亚基）、T=3（180亚基）或T=4（240亚基）。Encapsulin根据序列相似性和基因组邻域保守程度分为四个家族。Family 1研究最为深入，Family 2则根据壳蛋白中推定环核苷酸结合结构域（CBDs）的缺失或存在分为2A和2B两个亚类。近期研究表明Family 2B encapsulin可包封2-MIB合成酶2-MIBS，另一Family 2B encapsulin壳由两种不同的encapsulin原体形成，凸显了Family 2B系统的多样性和可变性。本研究利用Myxococcus xanthus系统，展示GeoA被内化于双组分Family 2B encapsulin壳中，拓展了Family 2B encapsulin在萜类生物合成中的作用。
**关键技术方法**
研究人员通过生物信息学分析鉴定了与GeoA共定位的encapsulin基因簇，利用大肠杆菌异源表达和亲和纯化获得壳蛋白及货物蛋白，采用负染透射电子显微镜（TEM）和动态光散射（DLS）表征壳形态，通过单颗粒冷冻电镜（cryo-EM）解析壳蛋白高分辨率结构，运用AlphaFold结构预测分析CLP与壳的结合模式，并通过系列缺失和替换突变体结合SDS-PAGE凝胶密度定量评估货物装载效率。酶学表征采用EnzChek assay监测焦磷酸释放及GC-MS定量产物。研究未涉及特定样本队列来源。
**研究结果**
**土臭味素生物合成基因簇编码Family 2B encapsulin基因**：通过对Family 2B encapsulin基因组邻域的分析，研究人员发现许多含有推定萜类生物合成基因的系统，共观察到2425个系统编码聚异戊二烯基转移酶（PPT）或萜类环化酶（TC）或两者兼有，表明细菌萜类生物合成的包封是一种潜在广泛存在的策略。其中299个（12.3%）含有类似GeoA的TC。65%的GeoA操纵子编码两个不同的encapsulin基因，表明混合壳形成的可能性。系统发育分析显示91%的细菌GeoA同源物来源于放线菌门，其余主要编码于黏球菌门和蓝细菌门。放线菌倾向于编码无邻近encapsulin的geoA基因，而大多数黏球菌门和蓝细菌门将geoA与推定壳形成基因共编码。
**Family 2A和Family 2B encapsulin基因的可变组合与GeoA共定位**：M. xanthus中的geoA基因与两个推定Family 2B encapsulin编码基因（MxEnc1和MxEnc2）共编码。进一步分析还揭示了含有单个或两个Family 2A encapsulin的系统，以及geoA与Family 2A和2B壳基因共定位的情况。大多数Family 2A encapsulin与半胱氨酸脱硫酶货物关联而非萜类相关货物。在Family 2A系统中观察到推定GeoA型TC包封值得关注，因为大多数TC为Family 2B壳包封。Family 2B壳展现开放孔结构及通过CBDs实现孔尺寸调节的潜力。研究还观察到六个放线菌基因组编码含有geoA同源物及Family 2A和2B壳基因的系统。序列和AlphaFold分析显示所有GeoA含有不同长度的延伸C端及两个TC结构域之间的无序残基片段，两者均可能作为介导货物包封的CLPs。
**M. xanthus土臭味素基因簇编码以GeoA为货物的双组分Family 2B encapsulin**：Mx GeoA与已表征的Streptomyces coelicolor GeoA具有55%同一性（70%相似性）。负染TEM显示His-MxEnc1形成直径约27 nm的规则壳，与其它T=1 encapsulin壳一致，DLS确认了尺寸。壳外部可观察到突起，可能代表外部展示的CBDs。His-MxEnc2纯化和TEM分析未观察到壳形成。当MxGeoA与His-MxEnc1共表达时，MxGeoA与His-MxEnc1共纯化，TEM显示T=1 encapsulin壳，内部有更多电子致密点，可能代表包封的MxGeoA。当MxGeoA与His-MxEnc1和His-MxEnc2共表达时获得相同结果。为澄清壳组成，研究人员构建了表达MxEnc1和MxGeoA及His-MxEnc2的菌株，由于His-MxEnc2不能单独形成壳，任何亲和纯化的壳必须代表混合MxEnc1/His-MxEnc2壳。该菌株纯化再次显示encapsulin和GeoA货物条带共洗脱，TEM显示相同的T=1壳结构，强烈提示形成了载有GeoA的混合MxEnc1/His-MxEnc2壳。
**GeoA装载encapsulin的cryo-EM分析揭示整体壳结构和混合壳中开放与闭合孔状态**：对单组分载货壳（His-MxEnc1_GeoA）和双组分载货样品（MxEnc1_His-MxEnc2_GeoA）进行单颗粒cryo-EM分析，二十面体精修获得相似的共识cryo-EM图，全局分辨率分别为2.31和2.27 ?。壳各由60个原体以T=1二十面体对称性排列组成。外部CBDs以围绕所有二重对称轴的对称方式排列。内部三重对称轴处可见额外非原体密度，代表GeoA CLPs。二重轴处的孔大而延伸，尺寸约20×60 ?。五重和三重孔较小，分别约6和5 ?。Mx CBDs采用经典cAMP结合结构域折叠，但未观察到cAMP结合。对二重对称轴的掩蔽3D分类产生不同二重构象。MxEnc1-only壳显示两种类型，均为开放二重孔，CBDs分辨或未分辨。混合壳中还观察到第三类，即完全闭合的二重孔，无可分辨的外部CBDs。这是Family 2B encapsulin壳中首次观察到完全闭合的二重孔，首次证实Family 2B系统中闭合壳状态的存在。闭合壳状态仅在混合壳中观察到，提示MxEnc2是实现二重孔周围闭合构象所必需的。开放与闭合孔状态的主要区别在于跨越二重对称轴的结构化N-臂的缺失或存在。两个N-臂采用反平行构象，允许其Arg24残基与邻近原体E-loop中Glu253残基形成氢键相互作用，可能稳定闭合二重孔状态。
**GeoA货物装载由两个保守货物装载肽介导**：纯化GeoA装载的encapsulin壳后，约25%的内部三重结合位点被货物CLPs占据。MxGeoA序列和AlphaFold模型分析显示两段约30个氨基酸的潜在无序疏水残基：一个位于两个GeoA结构域交界处（CLP1），一个位于C端（CLP2）。这些片段中唯一保守的残基在CLP1和CLP2中几乎相同，序列为GPN/TGLGTSAAR。AlphaFold预测显示CLP1和CLP2均可在所需结合口袋中形成结合相互作用。缺失CLP1或CLP2均导致货物装载水平适度降低约30%。CLP1突变为ASSASSASAAR也导致类似降低。CLP1突变且CLP2完全缺失时装载水平降至野生型的约20%。同时缺失CLP1和CLP2导致表达差和不溶性蛋白。突变分析表明两个CLPs各自均可能在encapsulin结合和货物装载中发挥作用，保留任一肽段足以实现货物装载。最小肽段融合实验和体外装载实验进一步证实柔性、疏水性介导的结合是系统的特征，CLP与MxEnc壳内部的结合由CLP1和CLP2的多种结合模式介导。
**包封的GeoA与游离酶相比无酶活性抑制且土臭味素产物滴度提高**：体外EnzChek检测显示包封酶和游离酶之间催化行为相同。结合亲和力和稳态催化参数也保持一致（Km分别为9.55和9.32 μm，Kcat/Km分别为18535和19012 M?1 s?1）。这表明多孔encapsulin壳不施加空间位阻或阻碍分子通量，允许底物FPP不受限制地进入腔体空间。GC-MS终点分析显示，尽管初始动力学参数相同，EncGeoA的最终土臭味素产物滴度显著优于游离酶。研究人员认为这种增强的整体转化效率可能源于encapsulin壳提供的空间限制，壳可能引起一定程度的中体捕获，通过物理限制疏水性germacradienol中间体从酶活性位点向本体溶剂的扩散，encapsulin维持腔内中间体的高局部浓度，微环境限制略有利于动力学要求较高的二次环化和碎裂步骤，驱动生物合成朝向增加的土臭味素产生。
**GeoA包封保护不稳定的游离酶免受内部蛋白水解**：游离MxGeoA酶的纯化常规导致显著的蛋白片段化，可能由内部蛋白水解驱动。SDS-PAGE分析显示全长酶及两个片段条带（约40 kDa），对应两个GeoA酶结构域。MxGeoA两个催化结构域由长柔性连接区连接的组织方式导致长疏水片段溶剂暴露。两个MxGeoA结构域交界处约30个残基的无序暴露片段代表可能的蛋白水解切割位点。值得注意的是，将MxGeoA包装在encapsulin壳内完全中和了该降解途径。EncGeoA的纯化和延长孵育或储存未导致货物土臭味素合成酶降解。比较结构评估表明包封酶无可检测的蛋白水解切割，维持全长完整性。这可能是由于坚固的蛋白壳有效保护脆弱的内部货物免受外源蛋白酶影响，防止通常导致不稳定的不利本体溶剂相互作用。encapsulin系统的效用超越了动力学优势，作为结构支架为 notoriously 不稳定的萜类合成酶类提供长期稳定化。
**讨论与结论**
本研究证明双组分Family 2B Mx encapsulin系统实现了土臭味素合成酶GeoA的功能性隔离。这是encapsulin壳参与特化代谢物生物合成的第二个报道，表明细菌土臭味素形成可以且在许多土壤细菌中确实在蛋白壳内实现。Family 2B encapsulin壳在计算机分析中与多种不同货物关联，包括参与萜类生物合成的多种环化酶和聚异戊二烯基转移酶。GeoA样环化酶与Family 2A和2B系统均有关联，凸显了encapsulin/萜类生物合成系统的多样性。生化和结构分析显示两种encapsulin原体均被纳入壳中，可能以随机方式。壳含有特征性的大二重孔，可能提供FPP底物进入和土臭味素产物排出的必要通量点。与MxEnc1-only壳相比，混合组成encapsulin显示额外的二重孔状态，对应于完全闭合的孔。这是Family 2B encapsulin系统中闭合二重孔的首次示例。Family 2B encapsulin中开放和闭合二重孔状态的确认推定支持先前假设的情景，即CBD配体结合将导致二重孔处的构象变化，提供控制底物进入腔体空间及最终货物酶活性的潜在途径。闭合二重孔由原体N-臂处的特定相互作用形成。GeoA CLPs的序列分析产生两个重复的疏水区域，实验显示冗余的壳结合能力。与Family 2B encapsulin共编码的GeoA同源物均在C端及结构域界面显示延伸的无序区域，表明这种冗余、异质性结合是保守特征。包封的GeoA是功能性酶，活性水平与游离蛋白相当。包封还增加了产物土臭味素的滴度，推定通过腔体空间中底物和中间体捕获过程。总之，研究结果凸显了新型双组分encapsulin壳在货物酶活性、稳定性及潜在配体介导的酶调控方面的多重功能。
**研究结论翻译**：本研究证明双组分Family 2B Mx encapsulin系统实现了土臭味素合成酶GeoA的功能性隔离。这是encapsulin壳参与特化代谢物生物合成的仅第二个报道，表明细菌土臭味素形成可以且在许多土壤细菌中确实在蛋白壳内实现。Family 2B encapsulin壳在计算机分析中已被证明与多种不同类型的货物关联，包括参与萜类生物合成的多种环化酶和聚异戊二烯基转移酶。值得注意的是，GeoA样环化酶被发现与Family 2A和2B系统均有关联，凸显了encapsulin/萜类生物合成系统的多样性。对完整encapsulin-货物系统的生化和结构分析表明，两种encapsulin原体均被纳入壳中，可能以随机方式，如其它双组分Family 2B encapsulin所观察到的。壳还含有特征性的大二重孔，可能提供FPP底物进入和土臭味素产物排出的必要通量点。值得注意的是，与MxEnc1-only壳相比，混合组成encapsulin显示额外的二重孔状态，对应于完全闭合的孔且外部CBDs未分辨。这是Family 2B encapsulin系统中闭合二重孔的首次示例。Family 2B encapsulin中开放和闭合二重孔状态的现已确认的存在推定支持先前假设的情景，即CBD配体结合将导致二重孔处的构象变化，提供控制底物进入腔体空间及最终货物酶活性的潜在途径，尽管这尚未被实验证实。闭合二重孔由原体N-臂处的特定相互作用形成，稳定闭合状态。Family 2B encapsulin的N-臂显示 substantial 长度和序列变异性，可能允许N-臂的改变的取向及随后不同系统中不同的动态二重孔状态。由于Family 2A encapsulin通常也具有近闭合的二重孔，萜类生物合成酶与Family 2A壳蛋白的共编码呈现了关于底物和产物通量的有趣未来研究方向。GeoA CLPs的序列分析产生了内部连接区和C端的两个重复疏水区域，实验显示冗余的壳结合能力。CLP cryo-EM密度的有限分辨率和观察到的变异性可能是多种异质性结合模式的结果，如其它Family 2B-萜类生物合成系统所观察到的。与Family 2B encapsulin共编码的GeoA同源物均在C端及结构域界面显示延伸的无序区域，表明这种冗余、异质性结合是保守特征并可能在此类系统中介导包封。此外，几乎所有不直接与encapsulin遗传关联的GeoA同源物也保留这些保守的无序CLP样区域。88.3%的编码这些GeoA酶的基因组含有至少一个、通常多个其它Family 2B基因。尽管未经证实，这开辟了GeoA同源物可能在特定条件下被包封入来自远距离遗传位点的Family 2B壳的可能性。土臭味素的独特生物合成途径已被广泛研究，GeoA生物合成酶在体内和体外均被分析。本研究表明包封的GeoA是功能性酶，活性水平与游离生物合成蛋白相当。包封还增加了产物土臭味素的滴度，推定通过腔体空间中底物和中间体捕获过程，导致这些化合物在酶活性位点附近局部浓度增加。这种效应已在其它encapsulin系统中观察到以实现最大储存或增加活性等系统目标。除蛋白保护益处外，货物包封因此提供多重优势，凸显encapsulin壳内的货物隔离可具有多种同时的系统特异性益处。研究观察开辟了若干关键未来研究方向，主要围绕CBDs在不同观察孔状态中的作用。鉴定MxEnc CBD的天然配体及结合对CBD取向和孔状态的效应也将是未来研究的关键途径。总之，研究结果凸显了新型双组分encapsulin壳在货物酶活性、稳定性及潜在配体介导的酶调控方面的多重功能。
