《Allergy》：An Extended Transcriptomic Landscape of Human Skin Mast Cells: Unveiling Lineage-Specific Noncoding RNA Dynamics in FcεRI Activation
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背景 肥大细胞（MCs）在过敏性和炎症性反应中至关重要，包括皮肤疾病。然而，静息和受刺激皮肤MCs的转录景观以及长非编码RNA（lncRNAs）的作用仍未充分表征。目的 定义来自人包皮（n=5培养物）和乳房皮肤（n=2培养物）的原代肥大细胞中FcεRI诱导的基
背景 肥大细胞（MCs）在过敏性和炎症性反应中至关重要，包括皮肤疾病。然而，静息和受刺激皮肤MCs的转录景观以及长非编码RNA（lncRNAs）的作用仍未充分表征。目的 定义来自人包皮（n=5培养物）和乳房皮肤（n=2培养物）的原代肥大细胞中FcεRI诱导的基因和启动子调控，评估组织来源效应，鉴定新型lncRNAs，并评估MALAT1功能。方法 皮肤来源MCs通过FcεRI聚集刺激，并进行低量单链基因表达帽分析（LQ-ssCAGE）测序。MALAT1敲低通过反义寡核苷酸实现。功能评估包括流式细胞术、caspase-3活性、细胞因子分泌组研究和组胺释放实验。结果 FcεRI交联诱导了显著变化，超过5000个基因和6400个启动子受到差异调控，还包括许多新型MC富集lncRNAs，例如CATG00000075668、CATG00000072979和CATG00000048788。选定细胞因子属于最强响应者之列，其模式在分泌组水平上大部分得到重现（例如GM-CSF、IL-5、TNF、LIF）。细胞表面受体如NTRK同样被增强。乳房和包皮MCs之间 noted 适度差异，主要影响细胞因子和类胰蛋白酶同工酶。MALAT1仅影响少数基因的转录，但 contribute 于FcεRI触发的组胺释放。结论 FcεRI聚集在皮肤MCs中触发广泛的转录重编程，也包括新型MC选择性lncRNAs。皮肤来源对FcεRI反应性贡献适度，而MALAT1微调MC功能。该研究表明lncRNAs可在原代组织MCs中成功操纵，以进一步确定这类新型生物分子的功能。
研究背景：肥大细胞（MCs）是组织驻留的哨兵细胞，在抵御病原体入侵和清除毒素方面发挥关键作用，但失控时也可引发或维持过敏性和炎症性疾病。皮肤中荨麻疹、特应性皮炎、接触性皮炎、银屑病、痒疹、玫瑰痤疮和MC活化综合征均与MC异常活性相关。过敏性疾病的流行病学模式与年龄和性别相关，并常遵循“特应性进程”概念。由于皮肤MCs（skMCs）在解剖和发育上独特的组织环境中运作，组织来源和供体固有因素（如年龄和性别）可能影响其转录程序。MCs可通过IgE非依赖途径活化，但本研究聚焦于IgE/FcεRI依赖的活化途径，因为它是过敏性MC活化的经典和临床核心途径。FcεRI刺激后MCs除脱颗粒外，还开始合成细胞因子并发生表型和功能变化，但这些调节在许多组织MCs中仍不明确。长非编码RNA（lncRNAs）是日益被认识为炎症和免疫反应调节因子的调控RNA分子，FANTOM联盟发现MCs拥有特别丰富的lncRNA库。MALAT1是一种核滞留的几乎普遍表达的lncRNA，MCs是其最高表达者之一。研究人员假设FcεRI活化在原代人skMCs中诱导协调的启动子水平转录重塑（包括非编码RNA），因此结合启动子分辨的LQ-ssCAGE转录组学与分子和功能验证方法开展研究。研究结论：FcεRI聚集在皮肤MCs中触发广泛转录重编程（>5000基因、>6400启动子和48个新型MC富集lncRNAs），乳房皮肤和包皮MCs共享核心转录程序但在类胰蛋白酶同工酶和IL-8/IL-1RA释放上存在选择性差异，MALAT1反义敲低选择性微调基因表达（RPS27）并减少FcεRI触发的组胺释放。该研究提供了静息和刺激原代皮肤MCs的更新扩展转录组，为科学界提供宝贵资源，探索了皮肤部位间差异，检测了蛋白质组和功能水平的调节，鉴定了多个受FcεRI调控的lncRNAs，并确定了原型lncRNA对MC功能的影响。论文发表在《Allergy》。
关键技术方法：研究采用低量单链基因表达帽分析（LQ-ssCAGE）测序对原代皮肤MCs进行转录组分析，样本来源于包皮（7-12供体混合培养，n=5）和乳房皮肤（单供体培养，n=2）共7个独立原代skMC培养物，共84个LQ-ssCAGE文库。通过反义寡核苷酸（ASO）转染实现MALAT1敲低。功能评估包括流式细胞术检测表面受体、caspase-3/7活性检测细胞存活、多重细胞因子阵列（45-Plex）检测分泌组、组胺释放实验以及RT-qPCR验证。生物信息学分析采用edgeR、limma、DREAM管道、diffSplice/topSplice进行差异基因表达（DGE）、差异转录本表达（DTE）和差异转录本使用（DTU）分析，以及Zenith包进行基因集富集分析。
研究结果：
3.1 skMCs的综合转录组分析：对包皮来源和乳房皮肤来源skMC培养物组合数据集进行LQ-ssCAGE转录组分析，数据集包含7个独立原代skMC培养物，每种在三种ASO条件下分析，其中5个还在FcεRI交联后分析，产生36个生物样本，每个测序2-3次，共84个LQ-ssCAGE文库。数据进行三层生物信息学分析，涵盖DGE、DTE和DTU。
3.2 FcεRI途径激活诱导skMCs广泛转录变化：主成分分析（PCA）显示PC1（49.3%方差）按活化状态区分MCs，PC2（16.7%方差）按组织来源区分。监督层次聚类分析进一步强调FcεRI交联对MC转录组的巨大影响。DGE分析（Dream算法）揭示FcεRI交联后2725个显著下调和2568个上调基因（校正p<0.05）。应用log2FC阈值1，鉴定795个上调和480个下调基因。上调基因变化幅度更大（CCL1最大log2FC为9.39，PTAFR为?3.62）。GSA显示免疫和炎症通路富集，包括IL-17、NF-κB、TNF和IL2-STAT5信号。下调基因与DNA修复、E2F靶点和细胞周期相关通路相关。DTE分析鉴定13982个启动子，其中3199个下调和3248个上调。DTU分析鉴定1040个基因在刺激MCs中具有差异转录本使用，包括转录因子GATA2和细胞表面受体NTRK1、BMPR1A和IL-4R。DTU分析独特鉴定33个基因，DTE分析发现523个独特转录本，凸显多种分析方法必要性。
3.3 FcεRI刺激在缺乏生长因子时维持skMCs并促进NGF/NTRK1依赖的存活：FcεRI活化导致CD69阳性MCs增加。SIGLEC-6和SIGLEC-8阳性细胞百分比在观察期内不变。NTRK1（NGF受体）在静息skMCs中通常缺失或低表达，但FcεRI活化强烈上调细胞表面NTRK1。FcεRI交联有效促进skMC存活，24h后caspase-3/7活性降低。在缺乏SCF条件下4天后，几乎无法回收细胞，而FcεRI聚集后仍可检测到明确细胞群体。新产生的NTRK1通过与FcεRI聚集协作帮助挽救MCs。FcεRI交联直接强烈促进MC存活，还赋予MCs利用NGF作为替代生长因子的能力，从而在SCF有限的体内环境中提供更大灵活性。
3.4 GM-CSF、IL-5和TNF-α是皮肤MCs中最强烈诱导的细胞因子：多重细胞因子阵列测量44份上清液中45种细胞因子。分析细胞因子中8种在刺激后显示统计学显著增加：GM-CSF、IL-5、IL-8、IL-13、LIF、TNF-α、MIP-1α（CCL3）和MIP-1β（CCL4）。CCL1未包含在面板中。其他细胞因子由skMCs产生但水平未受FcεRI交联显著改变，包括IL-1RA、IL-6、MCP-1（CCL2）和VEGF-A。随机森林分析鉴定GM-CSF、IL-5和TNF-α为预测skMCs刺激状态的前三位显著变量。
3.5 皮肤来源对MC转录组和分泌组的影响：对乳房和包皮来源MCs进行DGE分析，共980个基因（415下调和565上调）在bsMCs和fsMCs间差异表达。应用log2FC阈值1进一步精炼至265个优先基因。最显著差异为TPSD1。log2FC最高的DEGs为性染色体相关基因（RPS4Y1、XIST）。多个功能相关基因也差异表达（如FCER1G、CMA1、IL13、IL18）。DTE分析显示bsMCs中995个差异表达转录本。膜结合类胰蛋白酶同工酶TPSG1主要在bsMCs中表达，而TPSB2在fsMCs中更丰富。DTU分析鉴定31个基因在bsMCs中具有不同转录本/启动子使用模式，包括TPSB2、TPSG1和TPSAB1。结合TPSD1在fsMCs中的稳健过表达，类胰蛋白酶同工酶发现表明bsMCs与fsMCs中16号染色体类胰蛋白酶簇的调控模式不同。活化bsMCs和fsMCs的分泌组也显示选择性差异，bsMCs中IL-1RA和IL-8水平显著高于fsMCs。随机森林分析鉴定IL-8和IL-1RA为皮肤来源的关键预测因子。
3.6 FcεRI交联有效调控skMC中的lncRNAs：多个新型lncRNAs在FcεRI触发后经历显著表达变化。由FANTOM5联盟首次鉴定的多个调控lncRNAs由MCs选择性表达，提示在谱系中的功能影响。最强上调lncRNAs如CATG00000048788（logFC=7.41）和CATG0000098162（logFC=4.01）显示稳健表达变化。下调lncRNAs包括CATG00000067785（logFC=?1.90）。RT-qPCR在独立MC制备物中验证了LQ-ssCAGE观察到的差异表达。这些发现暗示MC选择性lncRNAs在MC活化程序编排中迄今未被认识的作用。MALAT1未包含在图中因为其不是FcεRI调控最强的lncRNAs之一，而是基于其在skMCs中异常高丰度被选用于功能扰动。
3.7 skMCs中的MALAT1：分析24个样本（54个LQ-ssCAGE文库）接受三种预处理：MALAT1-ASO1、MALAT1-ASO2和非靶向ASO 2天。MALAT1基线平均表达为12.75 log2CPM，FcεRI交联后略增至13.00 log2CPM，排名为MCs中第六高表达基因。ASO技术有效，平均敲低效率达51%。在基线样本中，MALAT1-ASO1导致RPS27差异表达。MALAT1-ASO2导致更多DEGs，也包括RPS27。在刺激样本中，MALAT1-ASO1处理后检测到12个DEGs，MALAT1-ASO2后同样。尽管MALAT1在MCs中高丰度，但它是跨条件最一致的DEG，确认成功扰动。DTE分析鉴定与DGE发现对应的转录本，DTU分析显示无启动子切换。RT-qPCR在额外skMC制备物中验证了LQ-ssCAGE发现。MALAT1敲低减少skMCs释放组胺的倾向。结论：虽然MALAT1丰度在统计学显著阈值上对skMCs整体转录影响有限，但可能微调FcεRI诱导的脱颗粒，这一过程可能受多个基因小的累积变化或MALAT1对其他过程（如剪接）的影响。
讨论部分总结：lncRNAs在过敏性疾病中的作用日益明确，多种lncRNAs已被鉴定为Th2反应的关键调节因子。然而，由于高通量技术的技术挑战和转录组分析中基因/转录本模型的限制，包含lncRNAs的大规模数据集仍然有限。FANTOM联盟开发了FANTOM5的元转录组框架并报告了综合启动子水平图谱的早期阶段。本研究利用更新的FANTOM-CAT注释LQ-ssCAGE数据，使用先进的DREAM管道鉴定795个上调和480个下调基因（log2FC阈值1），比先前研究多3.7倍DEGs。在DEGs中发现48个新型lncRNAs，一些显示MCs中独家或富集表达。MALAT1被选为示例lncRNA研究是否可在原代skMCs中扰动lncRNA水平以及是否影响基因表达。ASO介导的敲低技术成功建立，效率超过50%。DGE分析揭示几个受影响基因包括RPS27（上调）和SCARNA2（下调）。尽管在统计学显著水平上对单基因调控影响适度，MALAT1对MC脱颗粒有影响。这是首次证明lncRNA与MC脱颗粒之间功能联系的研究。除lncRNAs外，静息和FcεRI刺激MCs间检测到深刻整体差异。分泌组测定确认基因调控与蛋白质释放间相关性。FcεRI刺激同样调控细胞表面受体包括NTRK1（TrkA），流式细胞术确认。FcεRI介导的活化本身赋予skMCs强烈存活促进，外源性NGF适度增加此存活促进作用。转录组差异可能反映组织来源、供体年龄和性别的复合影响。除性染色体编码基因外，最显著差异在16p13.3染色体簇的类胰蛋白酶基因。总之，本研究提供了静息和刺激原代皮肤来源MCs的更新扩展转录组，作为科学界的宝贵资源。研究结论翻译：FcεRI聚集在皮肤MCs中触发广泛转录重编程，也包括新型MC选择性lncRNAs。皮肤来源对FcεRI反应性贡献适度，而MALAT1微调MC功能。该研究表明lncRNAs可在原代组织MCs中成功操纵，以进一步确定这类新型生物分子的功能。
