多草本薄荷醇润喉糖对上呼吸道感染的体外抗炎、抗病毒及抗菌活性研究

《Phytomedicine Plus》：In vitro anti-inflammatory, antiviral, and antimicrobial activities of a multi-herbal menthol lozenge for upper respiratory tract infections

　　

上呼吸道感染（URTIs）常伴随炎症和微生物病原体。本研究检测了一种市售润喉糖——含薄荷醇及光果甘草（Glycyrrhiza glabra L.）、余甘子（Phyllanthus emblica L.）和姜（Zingiber officinale Roscoe）提取物的多草本薄荷醇润喉糖——针对URTIs相关病理过程的体外生物学活性。抗炎活性在脂多糖刺激的RAW264.7巨噬细胞和白细胞介素（IL）-1β刺激的RPMI2650人鼻上皮细胞中评估，测定一氧化氮（NO）、IL-6和IL-1β的产生。抗病毒活性针对甲型流感H1N1和H3N2亚型，采用Madin–Darby犬肾细胞空斑减少试验评估。抗菌活性针对化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）和白色念珠菌（Candida albicans），在人工唾液中进行时间-杀菌试验。所有实验均进行三次独立生物学重复，数据采用双因素方差分析（ANOVA）结合Tukey事后检验分析。多草本薄荷醇润喉糖表现出显著的剂量依赖性抗炎活性，与对照相比NO、IL-6和IL-1β水平降低74–75%（p<0.05）。抗病毒试验显示H1N1（49–75%）和H3N2（37–75%）亚型的空斑形成均大幅减少。此外，对多种受试病原体观察到快速抗菌效应，暴露数分钟内微生物计数降低>3 log₁₀。虽然本研究未包含机制探讨，但研究结果证明了该多草本薄荷醇润喉糖的体外抗炎、抗病毒和抗菌特性。研究结果值得进一步探究URTIs相关的关键病理过程，并开展体内和临床研究以确认这些初步发现的临床相关性和治疗效力。

上呼吸道感染（URTIs）在全球范围内造成重大健康负担，临床上面临同时控制致病病原体与减轻宿主炎症反应的双重挑战。感染发生后，免疫相互作用触发局部炎症级联反应，特征为释放一氧化氮（NO）和促炎细胞因子包括白细胞介素-6（IL-6）和白细胞介素-1β（IL-1β）等介质。这些炎症过程通常由核因子κB（NF-κB）和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）等上游信号通路调控，介导红斑、疼痛和肿胀等常见症状，促成咽痛、咳嗽和全身不适的临床表现。特别是免疫和上皮细胞中NF-κB和MAPK级联的激活驱动诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和促炎细胞因子的转录，从而放大NO、IL-6和IL-1β的产生；因此，减弱这些介质的药物对于URTIs的症状缓解具有研究价值。URTIs主要由病毒病原体引起，包括流感病毒、鼻病毒和冠状病毒，其中甲型流感病毒H1N1和H3N2亚型是主要流行毒株。这些病毒感染可能使个体易感于机会性细菌和真菌病原体的继发感染。值得关注的病原体包括化脓性链球菌（细菌性咽炎的主要病因）、金黄色葡萄球菌（扁桃体炎和脓肿的常见病因）、肺炎克雷伯菌（与脆弱人群严重URTIs相关的革兰阴性病原体）以及白色念珠菌（口咽念珠菌病的主要真菌病因）。润喉糖广泛用于咽痛的症状管理，因其可向口腔和咽部黏膜持续释放活性成分，延长局部暴露时间。传统润喉糖通常含有防腐剂、局部麻醉剂或抗炎剂，但近年来对含植物化合物制剂的兴趣日益增加。本研究的样品为市售多草本润喉糖，其活性成分包括具有已记录生物活性的草药组分。薄荷醇提供清凉和轻度镇痛效果，也有报道显示其具有抗菌和抗炎活性。甘草（Glycyrrhiza glabra L.）含有甘草酸等三萜皂苷，具有抗病毒、抗菌和抗炎活性。余甘子（Phyllanthus emblica L.）果实中的没食子酸和非瑟酮已在动物细胞模型中显示抗炎活性。此外，姜（Zingiber officinale Roscoe）含有姜辣素和姜烯酚等生物活性化合物，可调节炎症信号通路并抑制促炎介质的产生。虽然薄荷醇、甘草、余甘子和姜的各自生物活性已有充分记录，但URTIs复杂的多面病理生理学涉及并发炎症、病毒增殖和细菌定植，提示多组分制剂可能优于单靶点药物。然而，这一理论优势在很大程度上尚未被证实。因此，本研究旨在检验该市售多草本润喉糖通过系统同步评估其体外抗炎、抗病毒和抗微生物通路效力展现多靶点活性的假设。本研究评估了多草本薄荷醇润喉糖的抗炎活性（巨噬细胞和鼻上皮细胞模型）、抗病毒活性（甲型流感H1N1和H3N2亚型）以及抗微生物活性（与咽痛相关的常见细菌和真菌病原体），以评估该制剂是否表现出与URTIs病理生理学相关的多靶点生物学效应。

研究人员开展的研究包括以下关键技术方法：采用脂多糖（LPS）刺激的RAW264.7小鼠巨噬细胞和IL-1β刺激的RPMI2650人鼻上皮细胞模型评估抗炎活性，通过Griess试剂和酶联免疫吸附试验（ELISA）测定NO、IL-6和IL-1β水平；采用空斑减少试验在MDCK细胞中评估对甲型流感H1N1（A/Puerto Rico/8/1934）和H3N2（A/Uruguay/716/2007）的抗病毒活性；采用时间-杀菌试验在人工唾液中对化脓性链球菌DMST 4369、金黄色葡萄球菌ATCC 25923、肺炎克雷伯菌ATCC 13883和白色念珠菌ATCC 10231评估抗微生物活性。以地塞米松（10 μM）作为抗炎阳性对照，法匹拉韦作为抗病毒阳性对照，并以含淀粉甲酚和2,4-二氯苄醇的防腐润喉糖作为基准对照。所有实验进行三次独立生物学重复，采用双因素方差分析结合Tukey事后检验进行统计。

研究结果如下：

抗炎活性：细胞毒性评估显示两种润喉糖溶液在100 μg/mL以下浓度对RAW264.7和RPMI2650细胞无毒（存活率>80%），选择10–100 μg/mL浓度进行抗炎测试。多草本薄荷醇润喉糖和防腐润喉糖在两种细胞系中均表现出显著且剂量依赖性的NO和促炎细胞因子（IL-6和IL-1β）水平降低（p<0.05）。在最高测试浓度下，多草本薄荷醇润喉糖使NO水平降低达74%，IL-6和IL-1β水平降低达75%。该活性支持该制剂在抑制咽痛相关急性炎症反应中的潜在作用。

抗病毒活性：细胞毒性评估显示两种润喉糖制剂在MDCK细胞中浓度高达100 mg/mL时维持>90%细胞存活率，但在100 mg/mL时观察到细胞皱缩，因此选择6.25–50 mg/mL浓度进行抗病毒测试。两种润喉糖均表现出对甲型流感H1N1和H3N2亚型的抗病毒活性，表现为空斑数量和大小的剂量依赖性减少。多草本薄荷醇润喉糖使H1N1空斑数量减少49–75%，H3N2空斑数量减少37–75%。在50 mg/mL时，两种润喉糖的抗H1N1和抗H3N2活性与法匹拉韦大致相当。这些发现表明制剂在测试的体外条件下可降低病毒感染性，但仅凭空斑形态无法确定受影响的具体病毒生命周期阶段，需要进一步的机制研究。

抗微生物活性：两种润喉糖均表现出强效快速的抗微生物活性，对受试咽痛相关病原体在暴露20分钟后实现>99.9%的菌落形成单位（CFUs）减少。值得注意的是，多草本薄荷醇润喉糖对化脓性链球菌和肺炎克雷伯菌在1分钟内实现>3 log₁₀减少，对金黄色葡萄球菌和白色念珠菌在5分钟内实现>3 log₁₀减少。1分钟内的快速>3 log₁₀减少表明抗微生物作用的快速启动，可能转化为润喉糖施用后的早期症状缓解。5分钟后抗微生物效应的平台期表明病原体死亡发生较早并在暴露期间维持。

讨论部分总结：本研究证明含薄荷醇及光果甘草、余甘子和姜提取物的多草本薄荷醇润喉糖表现出与URTIs病理生理学相关的多种生物学活性。体外实验显示该制剂降低关键炎症介质、抑制甲型流感H1N1和H3N2亚型复制，并对咽痛相关细菌和真菌病原体产生快速抗微生物效应。这些发现提示该制剂可能通过多种互补机制发挥作用，包括调节炎症通路和减少口咽环境中的微生物负荷。抗炎活性与其关键成分的已知机制一致：姜中的活性成分可降低NO、IL-6和IL-1β水平并抑制上游NF-κB信号和肿瘤坏死因子（TNF）-α产生；甘草中的甘草酸可抑制这些相同的促炎介质；余甘子中的没食子酸通过直接下调巨噬细胞模型中NO、IL-6和TNF-α表达发挥强效抗炎作用。抗病毒活性与甘草酸的双重作用一致，即通过抑制病毒聚合酶限制流感复制同时保护宿主细胞免受病毒诱导的凋亡。抗微生物功效得到其关键成分已知药理特征的支持：姜中的姜烯酮-A和6-姜烯酚通过靶向酶抑制金黄色葡萄球菌；甘草根提取物和活性次级代谢产物如光甘草定、甘草次酸和甘草查尔酮A对化脓性链球菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌具有强效抑制活性。该制剂的某些组分已在体内肺部和病毒攻击模型中进行研究，例如甘草酸在流感病毒感染小鼠模型中可降低肺部病毒滴度、肺病理和死亡率；姜的活性化合物可在小鼠模型中通过抑制炎症细胞募集和下调促炎细胞因子减轻肺和气道炎症。本研究结果与含传统药用提取物的草本润喉糖制剂的近期研究一致，这些研究报告了抗炎和抗微生物活性。此外，临床证据支持植物来源成分在咽痛管理中的作用：一项涉及200例接受相同多草本薄荷醇润喉糖治疗的急性咽炎患者的前瞻性、开放标签、非对照研究报道了快速的症状缓解，给药后15分钟即观察到咽痛统计学显著降低。然而，该初步临床观察需谨慎解读。其他含植物来源成分润喉糖的研究也报道了与安慰剂相比患者报告舒适度和治疗体验的改善。综上，现有证据支持多草本薄荷醇润喉糖在咽痛及相关URTI症状对症管理中的作用，需要进一步的随机对照临床试验确认疗效和安全性。

本研究存在以下局限性：虽然商业产品由制造商对选定标记化合物进行标准化，但这些含量未在本实验室独立重新定量，分析规格为专有信息，因此不能完全排除批间变异性。虽然纳入了防腐润喉糖和DMSO溶剂对照，但未测试安慰剂或仅含赋形剂的润喉糖，因此观察到的效应必须归因于完整润喉糖制剂，草药混合物与基质效应（如渗透压、pH或单独薄荷醇）的具体贡献无法分离。此外，RPMI2650是癌来源细胞系，可能无法完全再现正常鼻上皮。抗炎读数仅限于分泌介质（NO、IL-6和IL-1β），上游信号（NF-κB、MAPK和iNOS）需要未来标准化、机制性和体内研究。另一局限性是本研究未测试薄荷醇、光果甘草、余甘子和姜提取物对观察到的活性的各自贡献；由于测试样品为成品商业润喉糖，数据无法区分草药成分之间或草药混合物与非草药基质之间的加和、协同或拮抗相互作用，因此观察到的活性应归因于所测试的制剂，不能从当前数据集得出协同作用的结论。

结论部分翻译：本体外研究证明了商业多草本薄荷醇润喉糖的生物学活性。该制剂在RAW264.7和RPMI2650细胞中产生剂量依赖性的LPS和IL-1β诱导的NO、IL-6和IL-1β降低；在MDCK细胞中减少甲型流感H1N1和H3N2亚型的空斑数量和空斑大小；在人工唾液中实现对化脓性链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌和白色念珠菌存活计数的快速（≥3 log₁₀）降低。需要进一步的体内研究和对照临床研究来评估该制剂的临床相关性和潜在疗效。