《BMC Medical Genomics》：ALPACA: a visual data mining system for subcellular location-specific knowledge mining from multi-omics data in cancer
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背景：亚细胞细胞器等区室为组成型蛋白质提供适宜的环境和相互作用伙伴，使这些蛋白质能够正确执行其专有功能。尽管mRNA或蛋白质丰度数据常用于计算分析，但基于单一丰度数据的数据挖掘往往无法为癌症等引入多种生物学功能扰动的疾病提供充分信息。此外，转录组学与蛋白质组学
背景：亚细胞细胞器等区室为组成型蛋白质提供适宜的环境和相互作用伙伴，使这些蛋白质能够正确执行其专有功能。尽管mRNA或蛋白质丰度数据常用于计算分析，但基于单一丰度数据的数据挖掘往往无法为癌症等引入多种生物学功能扰动的疾病提供充分信息。此外，转录组学与蛋白质组学数据在很大程度上并不一致。这些挑战使得从亚细胞定位角度比较分析多种组学数据成为必要，以更好地理解癌症的功能动态。本文介绍了一种定位-wise蛋白质组/转录组丰度比较分析器（ALPACA），这是一个基于网络的视觉数据挖掘系统，用于从多组学数据中挖掘亚细胞定位特异性知识。结果：ALPACA从癌症丰度数据计算定位富集分布，并以通路特异性方式可视化呈现这些分布，帮助研究人员观察生物学功能差异。ALPACA的有效性通过重现多种癌症类型中已知的癌症相关基因和通路得到证明。例如，ALPACA能够识别基底样乳腺癌中TP53的过表达和DIABLO/Smac的低表达，以及妇科癌症中Fc gamma R介导的吞噬作用通路的高差异，涉及基因GSN。结论：ALPACA将整个转录组和蛋白质组丰度数据按亚细胞定位进行划分，并利用亚细胞定位和生物学通路视觉呈现所选癌症的差异。ALPACA的过滤和排序功能为数据分析增加了生物学通路背景，有助于识别潜在生物标志物。ALPACA可在https://github.com/mwpak/ALPACA获取。
研究背景方面，癌症是由异常细胞不受控制生长所致的疾病，其成因涉及突变率、拷贝数畸变以及转录组/蛋白质组表达改变等多组学特征的变化。蛋白质是执行基本生物学功能的主要机器，且其功能执行具有亚细胞定位特异性。因此，为探究生物学功能异常，必须通过多组学数据的比较分析来研究蛋白质的动态变化。目前存在的主要问题包括：转录组与蛋白质组丰度数据之间常存在不一致性，这种不一致为癌症研究带来更多挑战；蛋白质的亚细胞定位等功能机制应进一步纳入考虑，以理解不一致性发生的功能背景及相关的潜在生物标志物；亚细胞区室为蛋白质提供功能特异性环境，多种疾病包括癌症的疾病表型已知与蛋白质功能异常及定位相关，不同疾病和条件下蛋白质的亚细胞定位分布差异广泛，因此比较分析癌症动态和表型时必须考虑蛋白质定位；然而考虑到癌症类型或亚型的多样性以及生物学功能的多样性，通过实验分析所有组合成本高昂且耗时，因此亟需一个能够在蛋白质定位和生物学功能背景下计算分析多种癌症类型的数据挖掘系统。现有工作方面，已有许多用于转录组或蛋白质组丰度数据的独立分析工具，但很少有工具设计用于从丰度数据中挖掘知识并通过可视化直观呈现结果；多数现有工具仅专注于丰度分析或数据可视化之一，且整合亚细胞定位信息的工具稀缺；MSstatsTMT、TopPIC和SDAMS是检测差异丰度蛋白质的命令行工具，但结果以命令行界面呈现，可视化方式受限；Heatmapper和expVIP通过基于网络的图形用户界面可视化基因表达数据，但不提供生物学功能特异性视图，限制了进一步的生物学解释；更重要的是，上述工具均未在亚细胞定位背景下分析数据；利用亚细胞定位数据的现有工具多用于蛋白质定位预测任务，而非数据挖掘或数据可视化；COMPARTMENTS虽可视化蛋白质亚细胞定位信息，但仅一次注释单个蛋白质；CellMap专注于在亚细胞定位及蛋白质-蛋白质相互作用背景下可视化蛋白质，但COMPARTMENTS和CellMap均仅关注定位层面的蛋白质注释，并未从蛋白质组/转录组丰度数据中挖掘知识；据研究人员所知，尚无在亚细胞定位方式下进行生物学功能特异性分析的视觉数据挖掘系统，且现有工具均未同时比较不同组学的多种丰度数据。基于上述背景，研究人员开展了ALPACA系统的研究，该系统聚焦于定位-wise丰度数据分析和数据可视化，设计使研究人员能够以简单直观的方式探索丰度数据并检索感兴趣的生物学背景中的有价值信息，从而高效比较不同癌症和组学类型的数据；由于ALPACA在从整个转录组/蛋白质组到单个蛋白质的多个粒度级别比较定位分布，研究人员可识别特定癌症条件下各种蛋白质在不同定位的富集差异。研究得出的结论是：癌症动态高度复杂，单一组学层的数据无法提供研究癌症表型特征的完整信息；转录组和蛋白质组丰度虽携带细胞状态的关键信息，但两者常不一致；为更好地捕捉感兴趣的生物学背景，必须在蛋白质定位和生物学通路背景下对其进行对比分析；ALPACA使研究人员能够有效比较不同癌症类型、生物学通路和亚细胞定位的多种组合，并通过定量表示癌症间定位富集分布差异的指标引导研究人员确定可能导致差异的重要通路或蛋白质；利用ALPACA，研究人员在多种场景下展示了数据挖掘案例研究，重现了不同癌症类型的已知生物标志物，并发现了不同组学之间的一致性和不一致性，精确识别了每种情况下涉及的蛋白质。本研究的重要意义在于提供了一个整合亚细胞定位信息、多组学数据和生物学通路背景的可视化数据挖掘系统，填补了现有工具在亚细胞定位方式下进行生物学功能特异性分析及同时比较多种组学丰度数据方面的空白，有助于识别潜在生物标志物并深入理解癌症中亚细胞组分特异性蛋白质活性。
研究人员为开展研究用到的主要关键技术方法包括：从COMPARTMENTS基准集中解析高置信度定位标签，并统一UniProt、Human Protein Atlas和LocTree3四个数据源，以COMPARTMENTS基准集的11个定位标签为规范标签，获得34,172个蛋白质-定位对；从CPTAC Python数据应用程序编程接口（API）获取多种癌症类型及亚型的转录组表达和蛋白质组定量数据，涵盖乳腺癌、透明细胞肾癌、结肠癌、肺腺癌、多形性胶质母细胞瘤、子宫内膜癌和卵巢癌，乳腺癌还包括PAM50亚型水平数据；从KEGG通路数据库获取生物学通路信息；采用定位丰度富集计算方法，对蛋白质丰度值按癌症类型跨样本取平均聚合，蛋白质组定量数据先指数化再取均值，基于聚合量计算11个定位的富集值，并通过softmax函数获得定位富集分布；采用均方误差（MSE）和Kullback-Leibler散度（KLD）作为定位分布差异度量指标；采用Welch t检验配合Bonferroni多重检验校正进行差异表达基因/蛋白质（DEG/DEP）分析，并结合定位信息过滤；系统采用Django Python后端框架及D3和React JavaScript库进行前端可视化。
研究结果方面，首先通过疾病基因检测分析展示了定位信息在疾病基因检测中的效用。研究人员通过统计检验和基于定位信息的过滤检测各癌症类型的疾病相关基因，并与DisGeNET收集的已知疾病基因进行比较；采用Welch t检验配合Bonferroni多重检验校正进行两种组学数据的差异表达分析，根据校正p值对基因或蛋白质排序，校正p值低于0.05者视为DEG/DEP；通过计算11个定位的平均丰度差异获得正常与肿瘤条件间差异最显著的定位列表，最终仅保留属于最具判别性定位的蛋白质以获得DEG/DEP排序列表。以肺腺癌（LUAD）蛋白质组为例，在top 1最具判别性定位阈值下应用定位过滤，检测到6个真实基因，最后一个真实基因MET的排名为297；相比之下，不应用定位过滤时检测到44个真实基因，但第六个真实基因排名为1,394，同一MET基因排名为4,395；这表明无定位过滤时需研究多达1,400个DEP才能纳入真实基因，而应用定位过滤后仅需研究约300个基因；尽管检测到的真实基因数量较少，但定位过滤去除假阳性和提升排名的效果更为显著；在不同top差异定位数量阈值下获得类似结果，表明加入定位信息可减少排名列表中位于真实基因之间的假阳性基因并提升真实基因排名；除子宫内膜癌（EDM）和透明细胞肾细胞癌（Ccrcc）少数情况外，应用定位过滤时捕获的真实基因数量更多；转录组数据中虽模式不如蛋白质组明显，但超过半数情况也呈现类似模式。接着，数据挖掘案例研究1（乳腺癌亚型）中，研究人员通过比较分析不同癌症类型组合展示ALPACA的实用性。在判别癌症亚型生物标志物的重新发现方面，基底型乳腺癌已知在所有乳腺癌亚型中预后最差；研究人员手动整理癌症相关通路并选择KLD值高的通路，利用ALPACA进一步选择分布差异显著的定位；在基底细胞癌通路中，蛋白质组学数据显示基底型与两种管腔型乳腺癌之间在内质网（ER）存在较大差距，这可由基底亚型中TP53基因过表达解释；TP53是编码P53的肿瘤抑制基因，P53在DNA损伤时调控凋亡，正常情况下在细胞核中表达并在DNA损伤时输出至细胞质，TP53过表达也暗示其突变，且TP53过表达已被报道为乳腺癌及其他癌症预后不良的明确标志，与研究人员知识挖掘的发现一致；类似地，研究人员发现铁死亡通路中溶酶体的SLC11A2和TFRC在基底型乳腺癌蛋白质组学中较管腔型显著过表达，转录组学数据中细胞外空间的TFRC在基底型显著过表达；TFRC是参与细胞铁摄取的转铁蛋白受体蛋白，研究人员可据此假设TFRC在溶酶体和细胞外空间的过表达可能是基底型乳腺癌预后不良的原因之一，文献支持铁死亡的重要性，即基底型乳腺癌对铁死亡更敏感从而可用于靶向治疗。在基于先验知识的数据挖掘方面，研究人员利用ALPACA研究基底样与HER2阳性乳腺癌之间的差异，该案例研究在用户利用凋亡与基底样和HER2乳腺癌亚型显著相关的先验知识场景下进行；凋亡是由caspase激活消除受损或冗余细胞的遗传编程过程；在该系统中，该通路在线粒体中显示显著差异，部分归因于DIABLO/Smac；DIABLO/Smac是促进细胞色素c依赖性caspase激活的线粒体蛋白，近期研究提示DIABLO/Smac是HER2特异性基因之一，显示拷贝数与基因表达谱之间存在一定相关性；此外，基底样乳腺癌已知高度增殖和抗凋亡，这也可由参与凋亡通路的DIABLO/Smac低表达水平解释。研究人员还研究了另一个已知与癌症相关的通路P53信号通路；P53是肿瘤抑制基因，通过防止基因组突变维持稳定性，被称为"基因组守护者"；P53可作为转录因子影响细胞周期阻滞或细胞衰老；根据文献，基底样乳腺癌有一些与较差生存相关的标志物，包括PTEN基因，该亚型中通常显示低表达；该标志物与研究人员系统的发现一致，即PTEN在基底样乳腺癌中较HER2阳性亚型显示更低表达。数据挖掘案例研究2（妇科癌症）中，在差异度量引导的数据挖掘方面，研究人员让ALPACA在没有基于特定癌症先验知识假设的情况下引导识别与妇科癌症表型相关的潜在生物标志物，即子宫内膜癌（EDM）和卵巢癌（OVCA）；按KLD分数排序通路，ALPACA立即显示EDM与OVCA之间转录组学数据中最远距离的通路是Fc gamma R介导的吞噬作用，在细胞外空间可观察到明显差异；最能解释相应差异的基因是凝溶胶蛋白（GSN）；GSN是已知促进细胞运动的肌动蛋白丝调节蛋白，与癌症进展和肿瘤细胞迁移高度相关；研究也报道了GSN过表达及其与某些癌症包括妇科癌症更具侵袭性表型和更差预后的关联；相反，GSN也已知为肿瘤抑制因子并在某些癌症如乳腺癌中下调，这与ALPACA显示的结果一致，可容易地确认GSN转录组表达水平在乳腺癌中为-0.05，而在OVCA和EDM中分别为56.02和12.35，表明GSN在OVCA中表达最高；此外，GSN已知定位到多个位置包括细胞质和血浆；一个相对研究充分的亚型pGSN定位于血浆，通过自分泌和旁分泌机制促进OVCA细胞存活，从而使OVCA成为最致命的妇科癌症；ALPACA也发现了这一结果，因为GSN引起的细胞外空间差异比其他定位更明显。在判别癌症类型的生物标志物重新发现方面，另一个KLD高的通路是心肌收缩；利用ALPACA，研究人员能够检测到关于OVCA中心脏功能的潜在生物标志物；卵巢癌已知诱导心肌功能障碍和心脏恶病质；从OVCA转录组数据中，定位分布最显著的特征是线粒体的富集； contributing因素之一是一种称为TNNC1的蛋白质；TNNC1是TnC的骨骼/心脏亚型，是肌钙蛋白的亚基；肌钙蛋白的作用是调节横纹肌收缩；近期研究中，TNNC1被报道尤其在OVCA中过表达；此外，TNNC1敲除被报道导致癌细胞侵袭表型、增殖和集落形成减少，这与ALPACA检索的转录组数据信息一致；如所示，TNNC1基因表达值在EDM中为7.2552，而在OVCA中为10.4166；在蛋白质组丰度数据中，TNNC1仅在OVCA中测量到，而EDM中无TNNC1测量值；基于ALPACA的结果及TNNC1过表达与EMT和肌动蛋白微丝行为变化相关的已知关联，研究人员可假设TNNC1在线粒体中的功能可能涉及OVCA的这一表型。
讨论部分总结：癌症动态高度复杂，单一组学层的数据无法提供研究癌症表型特征的完整信息；转录组和蛋白质组丰度虽携带细胞状态的关键信息，但两者常不一致；为更好地捕捉感兴趣的生物学背景，必须在蛋白质定位和生物学通路背景下对其进行对比分析；本文提出的ALPACA使研究人员能够有效比较不同癌症类型、生物学通路和亚细胞定位的多种组合，并通过定量表示癌症间定位富集分布差异的指标引导研究人员确定可能导致差异的重要通路或蛋白质；利用ALPACA，研究人员在多种场景下展示了数据挖掘案例研究，重现了不同癌症类型的已知生物标志物，并发现了不同组学之间的一致性和不一致性，精确识别了每种情况下涉及的蛋白质；存在不同组学数据结果不一致的情况，例如案例研究2中OVCA的GSN转录组丰度较EDM和BRCA最高，与文献一致，但在蛋白质组数据中BRCA的GSN丰度最高，BRCA和OVCA在细胞外空间的富集水平也相反，这是为何BRCA中GSN丰度在两种不同组学水平不一致的开放研究问题；研究人员计划继续构建ALPACA以更全面地知识挖掘和可视化丰度及亚细胞定位数据；ALPACA源代码可在https://github.com/mwpak/ALPACA获取，源代码包括软件前端部分，数据通过永久链接获取；ALPACA有望为研究人员提供信息引导的分析功能，促进对癌症中亚细胞组分特异性蛋白质活性的更高层次理解。研究结论翻译：癌症动态高度复杂，单一组学层的数据无法提供研究癌症表型特征的完整信息。尽管转录组和蛋白质组丰度携带细胞状态的关键信息，但研究发现这两种组学往往并不一致。为了更好地捕捉感兴趣的生物学背景，必须在蛋白质定位和生物学通路的背景下对它们进行比较分析。本文提出了ALPACA，一个视觉数据挖掘系统，使研究人员能够有效比较不同癌症类型、生物学通路和亚细胞定位的多种组合。借助定量表示癌症间定位富集分布差异的指标，该系统引导研究人员确定可能导致差异的重要通路或蛋白质。利用ALPACA，研究人员展示了各种场景下的数据挖掘案例研究。结果，研究人员能够在该系统引导下重新发现不同癌症类型的已知生物标志物。研究人员还能够发现不同组学之间不仅存在共识也存在不一致，并精确识别了每种情况下涉及的蛋白质。存在不同组学数据显示不一致结果的情况。例如，在案例研究2中，OVCA的GSN转录组丰度较EDM和BRCA最高，与文献一致。然而，在蛋白质组数据中，BRCA的GSN丰度最高。BRCA和OVCA在细胞外空间的富集水平也相反。这是一个开放的研究问题：为何BRCA中GSN的丰度在两种不同组学水平上不一致。研究人员计划继续构建ALPACA以更全面地知识挖掘和可视化丰度及亚细胞定位数据。ALPACA的源代码也可在https://github.com/mwpak/ALPACA找到。为保证稳定可用性，源代码包括软件的前端部分，其中数据通过永久链接获取。ALPACA有望为研究人员提供信息引导的分析功能，促进对癌症中亚细胞组分特异性蛋白质活性的更高层次理解。
