《Plant Physiology and Biochemistry》：An Alfalfa AP2/ERF Transcription Factor MsTOE1 Negatively Regulates Salt Tolerance in
Arabidopsis and Directly Represses the Phenylpropanoid Pathway Gene
MsPAL
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非生物胁迫（如干旱、盐渍和极端温度）通过调控基因表达和细胞代谢限制植物生长并造成严重产量损失。盐胁迫的抑制效应主要归因于Na+和Cl-过量积累引起的渗透胁迫和离子胁迫。植物感知盐胁迫后，渗透势发生改变，损害水分和养分
非生物胁迫（如干旱、盐渍和极端温度）通过调控基因表达和细胞代谢限制植物生长并造成严重产量损失。盐胁迫的抑制效应主要归因于Na+和Cl-过量积累引起的渗透胁迫和离子胁迫。植物感知盐胁迫后，渗透势发生改变，损害水分和养分吸收。此外，渗透胁迫和离子胁迫可诱导次生胁迫，尤其是活性氧（ROS）的过量积累，损害细胞结构并破坏生物大分子功能。为适应盐渍环境，植物激活多种生理与分子响应。例如，盐胁迫诱导包括AP2/ERF、WRKY、MYB和bZIP等转录因子（TFs）在内的众多基因表达。这些转录因子结合靶基因启动子区的顺式作用元件，从而调控胁迫相关功能基因。在這些家族中，AP2/ERF超家族是参与植物生长发育和胁迫耐受的大型转录因子家族。每个AP2/ERF成员含有一个或两个约60–70个氨基酸的保守AP2结构域。根据结构域数目和DNA结合序列，该超家族分为五个亚家族：AP2（APETALA2）、RAV（与ABI3/VP相关）、DREB（脱水响应元件结合）、ERF（乙烯响应元件结合蛋白）和Soloist。AP2亚家族含有两个高度同源的串联AP2/ERF结构域，包括AP2、三个TARGET OF EAT蛋白（TOE1、TOE2和TOE3）、SCHLAFMüTZE（SMZ）和SCHNARCHZAPFEN（SNZ）。该亚家族在花器官发育、根系形态建成、株高、种子发育和叶片形态建成中发挥重要作用。目前对AP2亚家族的研究主要集中于植物生长发育。在拟南芥中，TOE亚家族包含三个成员：AtTOE1、AtTOE2和AtTOE3。过表达AtTOE1或AtTOE2增加分枝数，AtTOE1过表达还导致矮化和晚花。相反，toe1toe2双突变体表现为株型增大和早花表型。在功能上，AtTOE1和AtTOE2是转录抑制因子，拮抗光周期开花激活因子CONSTANS（CO）以抑制成花素FT表达，并通过抑制免疫受体FLS2介导年龄依赖性先天免疫。然而，它们在小麦非生物胁迫耐受中的功能研究有限。累积证据表明AP2转录因子受多种非生物胁迫信号强烈诱导。例如，盐节木（Halostachys caspica）HcTOE3受NaCl、甘露醇、高温和低温显著诱导，其在拟南芥中过表达通过提高抗氧化能力和渗透调节物质含量增强抗冻性。在甘薯（Ipomoea batatas）中，IbTOE3过表达通过ROS清除增强烟草的耐盐和抗旱性。此外，银杏（Ginkgo biloba）愈伤组织中GbTOE1a过表达提高黄酮含量，而其沉默降低黄酮积累、削弱抗氧化能力并增加对盐和干旱胁迫的敏感性。因此，调控次生代谢物（如黄酮类）生物合成以增强抗氧化防御和非生物胁迫耐受是一种关键的适应策略。植物激素作为重要的信号调节因子，在胁迫适应以及抗逆性与生长之间的平衡中也发挥核心作用。紫花苜蓿（Medicago sativa L.）是一种优质豆科牧草作物，在畜牧业和土壤修复中具有重要经济价值。然而，全球盐碱地面积已超过13.8亿公顷且仍在扩大，使盐胁迫成为限制紫花苜蓿生产的主要因素。本研究从紫花苜蓿中鉴定出拟南芥TOE1的同源基因MsTOE1，并通过异源过表达于拟南芥研究其在植物生长和盐胁迫响应中的作用。本研究为AP2亚家族在牧草作物耐盐性中的调控功能提供了新见解，并为高产耐盐紫花苜蓿品种的分子育种提供了理论基础和技术参考。
研究背景：非生物胁迫（干旱、盐渍、极端温度）通过调控基因表达和细胞代谢限制植物生长，造成严重产量损失。盐胁迫的抑制效应主要源于Na
+和Cl
-过量积累引起的渗透胁迫和离子胁迫，并可诱导次生胁迫，尤其是活性氧（ROS）过量积累，损害细胞结构并破坏生物大分子功能。植物通过激活包括AP2/ERF、WRKY、MYB和bZIP等转录因子（TFs）在内的多种生理与分子响应适应盐渍环境。AP2/ERF超家族是参与植物生长发育和胁迫耐受的大型转录因子家族，根据结构域数目和DNA结合序列分为AP2、RAV、DREB、ERF和Soloist五个亚家族。AP2亚家族含两个高度同源的串联AP2/ERF结构域，包括AP2、TOE1、TOE2、TOE3、SMZ和SNZ，在花器官发育、根系形态建成、株高、种子发育和叶片形态建成中发挥重要作用。目前对AP2亚家族的研究主要集中于植物生长发育，其在非生物胁迫耐受中的功能研究有限。已有证据表明AP2转录因子受多种非生物胁迫信号强烈诱导：盐节木HcTOE3受NaCl、甘露醇、高温和低温显著诱导，过表达增强拟南芥抗冻性；甘薯IbTOE3过表达通过ROS清除增强烟草耐盐和抗旱性；银杏GbTOE1a过表达提高黄酮含量，沉默则降低黄酮积累、削弱抗氧化能力并增加盐和干旱敏感性。因此，调控次生代谢物（如黄酮类）生物合成以增强抗氧化防御是关键的适应策略。紫花苜蓿是优质豆科牧草作物，全球盐碱地面积已超过13.8亿公顷且仍在扩大，盐胁迫成为限制紫花苜蓿生产的主要因素。本研究从紫花苜蓿中鉴定出拟南芥TOE1的同源基因MsTOE1，通过异源过表达于拟南芥研究其在植物生长和盐胁迫响应中的作用，旨在为AP2亚家族在牧草作物耐盐性中的调控功能提供新见解，并为高产耐盐紫花苜蓿品种的分子育种提供理论基础和技术参考。
主要技术方法：研究人员以紫花苜蓿品种"中牧3号"为材料，采用qRT-PCR（实时定量PCR）检测基因表达，构建35S::MsTOE1-GFP融合载体进行亚细胞定位分析，通过农杆菌介导的花序浸染法获得MsTOE1过表达拟南芥转基因株系，设置0、40、70和100 mM NaCl进行种子萌发和幼苗盐胁迫实验，对40和70 mM NaCl处理的过表达株系与野生型（WT）进行转录组测序（RNA-seq）及GO和KEGG富集分析，测定SOD、POD、CAT、APX活性及MDA含量和总抗氧化能力（T-AOC），并采用酵母单杂交（Y1H）、电泳迁移率变动分析（EMSA）、双荧光素酶报告实验和染色质免疫共沉淀-qPCR（ChIP-qPCR）验证MsTOE1与MsPAL启动子的结合及调控关系。
研究结果：
3.1 MsTOE1基本分子特征分析：研究人员以拟南芥三个TOE蛋白氨基酸序列为参考构建多物种TOE同源基因系统发育树，在紫花苜蓿中鉴定出四个TOE同源基因，其中MsG0280010861与AtTOE1亲缘关系最近且表达量最高，与蒺藜苜蓿Medtr2g093060序列相似性达95.3%，暂命名为MsTOE1。MsTOE1编码451个氨基酸蛋白，含两个典型AP2/ERF结构域和上游核定位信号（NLS）。组织表达分析显示MsTOE1在根中表达最高，其次为叶和根颈。盐胁迫下MsTOE1表达呈动态变化，300 mM NaCl处理下根中表达先上调后持续下调。烟草瞬时表达分析表明MsTOE1蛋白定位于细胞核，支持其作为转录因子调控基因表达的潜在功能。
3.2 MsTOE1过表达增加拟南芥盐敏感性：异源过表达MsTOE1导致拟南芥矮化表型且随表达量增加而加重。200 mM NaCl处理7天后，转基因植株较WT生长抑制和叶片黄化更明显，MDA含量显著升高而T-AOC显著降低，CAT活性下降，POD和APX活性部分上调但不足以抵消抗氧化防御系统的整体损伤。种子萌发实验表明，100 mM NaCl下转基因种子萌发率（84.41%）始终低于WT（95.12%）；40和70 mM NaCl下萌发延迟但最终萌发率接近WT；萌发后10天转基因植株鲜重显著降低。结论：MsTOE1过表达抑制拟南芥正常生长，增加膜脂过氧化，降低总抗氧化能力，延迟盐胁迫下种子萌发，最终增强盐敏感性。
3.3 MsTOE1过表达调控拟南芥盐胁迫响应的转录组分析：正常条件下MsTOE1过表达产生136个差异表达基因（DEGs，103个上调、33个下调），GO富集于"防御响应""胞外区域""氧化还原酶活性"，KEGG富集于"代谢途径""次生代谢物生物合成""苯丙烷生物合成"和"淀粉与蔗糖代谢"。40 mM NaCl下检测到312个DEGs（74个上调、238个下调），Venn分析排除正常条件下已有DEGs后获得291个低盐特异响应基因，富集于"氧化还原酶活性""过氧化物酶活性""跨膜运输""细胞氧化解毒"及"苯丙烷生物合成""谷胱甘肽代谢""植物激素信号转导""淀粉与蔗糖代谢""黄酮生物合成"通路。70 mM NaCl下鉴定184个特异DEGs（175个上调、50个下调），富集于"水杨酸响应"及"苯丙烷生物合成""植物激素信号转导"通路，而谷胱甘肽代谢、淀粉与蔗糖代谢和黄酮生物合成不再显著富集。结论：低盐胁迫下MsTOE1过表达主要调控抗氧化过程及多种代谢途径，高盐胁迫下这些途径减弱而植物转而依赖苯丙烷生物合成和激素信号应对严重生长抑制。
3.4 qRT-PCR验证DEGs表达水平：选取9个DEGs进行qRT-PCR验证，正常条件下WT与过表达株系间无显著表达差异；盐胁迫下转基因株系表达模式与对照明显不同且随盐浓度变化，与转录组结果一致。40 mM NaCl下AtGSTU9、AtGSTU22、AtPER64、AtFLS5和AtDOX1表达变化与测序数据一致；70 mM NaCl下AtTT8、AtSARD1和AtEDS16变化一致。结论：qRT-PCR结果与转录组数据高度一致，证实RNA-seq分析的可靠性。
3.5 MsTOE1结合MsPAL启动子并抑制其转录活性：苯丙氨酸解氨酶（PAL）是苯丙烷代谢途径首个关键限速酶。研究人员分析紫花苜蓿多个PAL基因启动子，在一个PAL基因（MsG0280010930）启动子区鉴定出两个TOE1结合位点。Y1H实验验证MsTOE1直接结合MsPAL启动子；EMSA证明MBP-MsTOE1融合蛋白特异性结合含GACGAGGT和ATGATAGA结合序列的生物素标记探针，突变探针无结合；ChIP-qPCR在表达35S::MsTOE1-3Flag的苜蓿毛状根中检测到含TOE1结合位点的MsPAL启动子片段显著富集；双荧光素酶报告实验表明MsTOE1与pMsPAL::LUC共表达显著降低相对荧光素酶活性，证明MsTOE1负调控MsPAL转录。值得注意的是，MsTOE1过表达拟南芥转录组中未检测到AtPAL同源基因差异表达，Y1H显示MsTOE1不能结合四个AtPAL启动子，提示MsTOE1对PAL的直接调控可能具有物种特异性。
讨论部分总结：研究人员从紫花苜蓿中克隆MsTOE1并过表达于拟南芥，表型分析显示转基因株系矮化程度与MsTOE1表达水平呈剂量依赖相关。转录组测序表明转基因株系中75.74%的DEGs上调，其中GA2ox7基因上调达133倍，该基因编码赤霉素2-氧化酶7，催化活性赤霉素转化为非活性形式，其过表达导致矮化；AIL7转录因子也显著上调，与矮化表型和种子萌发率改变相关。盐胁迫下转基因植株MDA含量显著升高、T-AOC显著降低、CAT活性受抑制，POD和APX活性虽部分上调但不足以抵消抗氧化防御系统损伤。低盐（40 mM NaCl）下MsTOE1过表达主要延迟萌发速度而不大幅改变最终萌发率，76.28%的DEGs下调，GSTU8、GSTU9和GSTU22显著下调可能增强盐胁迫敏感性；高盐（70 mM NaCl）下77.78%的DEGs上调，主要富集于苯丙烷生物合成和植物激素信号转导通路。转录因子通常具有物种特异性和环境依赖性，同一转录因子在不同物种和生理条件下可靶向不同靶基因。本研究结合已报道TOE1结合位点、JASPAR预测和体外结合实验，在MsPAL启动子中鉴定出两个MsTOE1结合位点并证明其负调控作用，但MsTOE1不能结合AtPAL启动子，可能因AtPAL启动子缺乏MsTOE1识别的特异性结合基序（ATGATAGA和GACGAGGT未在AtPAL启动子中检测到），以及MsTOE1与AtTOE1内在无序区（IDRs）序列差异影响辅因子招募和染色质环境响应。研究人员承认MsTOE1介导的MsPAL抑制与耐盐性之间的直接功能联系尚未通过实验建立，上述物种特异性解释目前仍为工作假说而非结论性证据，深入解析MsTOE1介导的PAL调控与紫花苜蓿盐胁迫关系将是未来主要研究方向。研究结论：综上，尽管MsTOE1不能结合或直接调控AtPAL启动子，但Y1H、EMSA、双荧光素酶报告和ChIP-qPCR结果支持其在紫花苜蓿中对MsPAL的直接负调控作用。本研究为AP2亚家族在牧草作物耐盐性中的调控功能提供了新见解，并为高产耐盐紫花苜蓿品种的分子育种提供了理论基础和技术参考。
