miR156-SPL与miR858-MYB模块调控不同成熟期油桃果实发育时序的异时性机制

《Plant Physiology and Biochemistry》：MicroRNA regulation of fruit development genes in contrasting Prunus persica varieties differing in harvest date

　　

在成熟期截然不同的两种油桃品种中，microRNA对果实发育基因的调控作用 摘要：桃是全球广泛栽培且具有重要农业与经济价值的水果作物之一。在其最重要的生产性状中，果实成熟期尤为关键，因为它直接影响市场价值、采收安排、采后品质和货架期。然而，成熟期并非仅在成熟启动时决定，而是在整个果实发育过程中逐步确立，其关键的生理决定因素早在个体发育早期阶段就已确定。因此，更好地理解控制果实成熟期的分子与生理机制对于改善桃果品质和延长采后表现至关重要。先前的研究已鉴定出参与激素生物合成、激素信号转导和细胞壁重塑的候选基因是桃成熟期的重要调控因子。在桃等呼吸跃变型果实中，向成熟的转变受一个涉及植物激素、转录因子和表观基因组重编程的复杂调控网络所支配。因此，成熟期不应被视为一个孤立的终末事件，而应被看作是整合了生长、组织分化和代谢随时间的转变这一协调发育程序的结果。本研究旨在表征在成熟期上存在差异的桃基因型中，果实发育期间microRNA（miRNA）表达的时空动态变化，并鉴定可能参与成熟期调控的候选miRNA-靶标互作关系。研究人员利用早熟品种‘Early Juan’（EJ）和晚熟品种‘Super August’（SA）两种油桃基因型，在整个果实发育过程中进行了表型、细胞壁生化、转录组和小RNA组学分析。结果表明，这两种基因型遵循相似的总体发育程序，但在各阶段的持续时间上存在显著差异，尤其是晚熟基因型的采前发育期延长。细胞壁组分分析揭示了品种特异性的生化动态变化：SA表现出更强的多聚半乳糖醛酸酶驱动的果胶溶解特征，而EJ则呈现出更显著的果胶酸裂合酶介导的重塑模式。小RNA测序共鉴定出214个已知miRNA和380个新型miRNA。差异表达分析显示，品种相关的miRNA差异随着发育进程逐渐增强，在T3阶段达到峰值，共有81个差异表达miRNA。通过整合降解组预测与转录组数据，研究人员构建了阶段特异性的调控网络，其中miR156-SPL和miR858-MYB模块作为候选调控通路脱颖而出。特别地，ppe-miR156g表现出阶段和基因型依赖性的表达转变：在SA中，其积累主要发生在T0至T1之间，而在EJ中则延迟至T1至T2之间。这种时序差异与SPL靶基因的表达抑制以及细胞壁重塑的动态变化相关联。RT-qPCR验证进一步支持了这些表达模式。综上所述，本研究表明，保守的miRNA-转录因子模块，特别是miR156-SPL轴，通过协调发育进程、激素相关通路和细胞壁修饰，参与了油桃果实成熟期的异时性调控。这些发现为理解果实发育时序的分子基础提供了新的见解，并为通过遗传改良优化桃果成熟期和采后品质提供了潜在的靶点。

论文解读：miRNA调控不同成熟期油桃果实发育的异时性机制

一、研究背景与科学问题

桃是全球重要的经济水果作物，其果实成熟期直接决定市场价值、采收安排、采后品质和货架期。已有研究表明，成熟期并非仅在成熟启动时决定，而是在整个果实发育过程中逐步确立，受控于一个由植物激素、转录因子和表观遗传重编程构成的复杂调控网络。在桃等呼吸跃变型果实中，细胞壁重塑是果实软化的核心过程，由多聚半乳糖醛酸酶、果胶酸裂合酶和果胶甲酯酶等酶类协同驱动。近年来，microRNA（miRNA）作为关键的后转录调控因子，已被证实参与乙烯生物合成、细胞壁重塑以及风味和香气等感官品质的调控。例如，miR159-GAMYB模块影响番茄胚珠发育和单性结实，miR828和miR858通过调控MYB转录因子影响花色苷和次生代谢，miR156-SPL模块在葡萄浆果成熟和着色中发挥作用。尽管已有证据表明miRNA在果实发育和成熟中扮演重要角色，但在桃中，对于不同发育时长和成熟期的基因型中miRNA表达如何随果实个体发生而变化，以及保守和新型miRNA是否对这些模式有差异性贡献，仍不清楚。因此，本研究旨在阐明两种成熟期截然不同的油桃基因型中，miRNA表达的时空动态变化，并鉴定可能参与成熟期调控的候选miRNA-靶标互作模块。

二、研究内容与主要结论

研究人员选取了早熟油桃品种‘Early Juan’（EJ）和晚熟品种‘Super August’（SA），系统比较了它们在果实发育过程中的表型、细胞壁生化特性、转录组和miRNA组学特征。主要结论包括：

1. 1.
   两种基因型均遵循典型的双S形生长曲线，但发育周期长度差异显著：EJ在开花后94天（DAB）完成发育，而SA需174天。晚熟品种的采前发育期显著延长。
2. 2.
   细胞壁重塑呈现品种特异性：SA表现出更高的多聚半乳糖醛酸酶活性，尤其在T1和T3阶段，提示其以多聚半乳糖醛酸酶驱动的果胶溶解为主；而EJ则表现为持续的果胶酸裂合酶活性，显示出不同的软化策略。
3. 3.
   通过小RNA测序，共鉴定出214个已知miRNA和380个新型miRNA。差异表达分析表明，品种间的miRNA差异随发育进程逐渐增大，在接近成熟的T3阶段达到顶峰（81个差异表达miRNA）。
4. 4.
   整合miRNA靶标预测与转录组数据，构建了阶段特异性的调控网络。其中，miR156-SPL和miR858-MYB模块被识别为候选的关键调控通路。
5. 5.
   ppe-miR156g的表达呈现显著的阶段和基因型依赖性：在SA中，其在T0至T1阶段快速上升；而在EJ中，其上升延迟至T1至T2阶段。这种时序差异与SPL靶基因的抑制以及细胞壁重塑的动态变化相吻合。
6. 6.
   RT-qPCR验证了上述miRNA及其靶标的表达模式，进一步支持了miR156-SPL和miR858-MYB模块在果实发育中的调控作用。

三、主要关键技术方法

1. 1.
   植物材料与采样：选用早熟油桃品种‘Early Juan’（EJ）和晚熟品种‘Super August’（SA），均来自智利大学桃育种计划，种植于智利首都大区迈普的林科纳达，砧木为‘Nemaguard’。根据果实鲜重、赤道直径和内果皮木质化程度（间苯三酚-HCl染色法）划分发育阶段（T0至T3）。
2. 2.
   细胞壁分析与酶活测定：采用醇不溶性残渣制备和顺序化学分级分离法（水、CDTA、Na?CO?、KOH）获得不同果胶组分，通过比色法和气相色谱定量中性糖和糖醛酸。测定多聚半乳糖醛酸酶、果胶酸裂合酶和果胶甲酯酶的活性。
3. 3.
   高通量测序与生物信息学分析：对24个样品进行链特异性mRNA文库和small RNA文库构建及Illumina测序。使用STAR比对转录组数据，DESeq2进行差异表达分析。使用miRDeep-P预测新型miRNA，并结合psRobot、miRanda和psRNATarget三种工具预测miRNA靶标，仅保留至少两种工具支持的靶标，并进一步筛选与miRNA在同一发育阶段差异表达的靶基因。
4. 4.
   实验验证：采用茎环RT-qPCR对选定的miRNA（ppe-miR156a、ppe-miR156g、ppe-miR858）及其预测靶标（SPL3、MYB20）的表达模式进行独立验证。

四、研究结果详述

• •
  果实发育与表型特征：EJ和SA均呈现典型的三阶段生长模式，但SA的每个阶段，尤其是采前发育期（S3）显著延长。EJ的生长速率在S1阶段较高，而两者在S3阶段均达到最大生长速率。内果皮木质化标志着S2的开始，其发生时间在品种间存在差异。
• •
  细胞壁重塑差异：醇不溶性残渣含量在两种品种中均在T1阶段达到峰值，但SA在所有阶段均高于EJ。在水溶性果胶组分中，SA的中性糖和糖醛酸含量更高，表明其果胶解聚更为广泛。在离子结合型果胶组分中，EJ的含量更高。多聚半乳糖醛酸酶活性在SA中显著更高，尤其在T1和T3阶段；而果胶酸裂合酶活性则在EJ中持续更高。这表明两种品种采用了不同的细胞壁软化策略。
• •
  转录组全局差异：主成分分析显示，发育阶段是转录组变异的主要来源（PC1解释69%方差），其次是品种差异（PC2解释11%方差）。差异表达基因数量在T1阶段最多（4242个），且早期以SA下调基因为主，后期转为以上调为主。仅有119个差异表达基因在所有阶段共享，表明大多数转录差异是阶段特异性的。
• •
  miRNA鉴定与表达动态：共鉴定出214个已知miRNA和380个新型miRNA，长度以21和24核苷酸为主。主成分分析显示miRNA表达谱同样按发育阶段和品种聚类。差异表达miRNA的数量从T0的22个增加到T3的81个，且新型miRNA的比例逐渐增加。仅有4个miRNA在所有阶段差异表达，表明miRNA调控具有高度阶段性。
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  阶段特异性调控网络：基于预测的miRNA-靶标互作，构建了四个发育阶段的调控网络。网络复杂度在T1和T3阶段最高，T0和T2阶段较低。网络包含与激素信号（脱落酸、生长素）、发育过程、细胞壁代谢、钙信号和苯丙烷代谢等相关的基因。
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  miR156-SPL模块：ppe-miR156g与多个SPL转录因子（SPL2、SPL3、SPL4等）呈负相关。在SA中，ppe-miR156g在T0至T1阶段迅速积累，伴随SPL靶标表达的快速下降；在EJ中，这一上升延迟至T1至T2阶段。RT-qPCR验证了这一阶段和基因型依赖性的表达模式。
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  miR858-MYB模块：ppe-miR858被预测靶向MYB20和纤维素合酶样蛋白CSLC12。在SA中，ppe-miR858表达逐渐上升，MYB20在T3阶段下降；在EJ中，ppe-miR858在T1阶段下降后回升，MYB20在T2阶段短暂上升。RT-qPCR验证了两者之间的拮抗关系。

五、讨论与结论

本研究结果表明，油桃品种间成熟期的差异主要源于果实发育程序的时序协调差异，而非根本性的发育程序改变。早熟品种EJ在更短的时间窗口内完成了相同的发育序列，因此成熟期可被视为一种异时性性状。研究首次将miRNA鉴定为这种时间差异的候选调控因子。其中，保守的miR156-SPL模块是最具说服力的候选者。在模式植物拟南芥中，miR156在幼年期高表达，随后逐渐降低以解除对SPL的抑制，从而促进营养生长到生殖生长的转变。在本研究中，晚熟品种SA在发育早期（T0至T1）即出现ppe-miR156g的快速积累和SPL靶标的快速下降，这与其加速的细胞壁重塑和多聚半乳糖醛酸酶活性升高相吻合，提示SA可能在发育早期就启动了与成熟相关的程序。相比之下，EJ的这一转变延迟，导致其发育进程相对缓慢。此外，miR858-MYB模块也可能通过调控MYB转录因子参与细胞壁代谢或苯丙烷途径。总之，本研究揭示了一个模型：保守的miRNA-转录因子模块，特别是miR156-SPL轴，通过协调发育进程、激素信号和细胞壁修饰，参与了油桃果实成熟期的异时性调控。这些发现为理解果实发育时序的分子基础提供了新见解，并为通过遗传改良优化桃果实成熟期和采后品质提供了潜在的分子靶点。