《BioMed Research International》：Smart Soup Ameliorates Cognitive Dysfunction in Diabetic Encephalopathy by Inhibiting Hippocampal Ferroptosis and Restoring Mitophagic Balance
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糖尿病脑病（DE）是糖尿病常见的并发症，与进行性认知功能障碍密切相关。铁死亡（ferroptosis）是一种铁依赖性的调节性细胞死亡过程，已被认为参与DE中观察到的神经退行性变。智能汤（SS）是一种经典中药方剂，用于治疗记忆障碍。本研究评估了SS对DE的治疗潜
糖尿病脑病（DE）是糖尿病常见的并发症，与进行性认知功能障碍密切相关。铁死亡（ferroptosis）是一种铁依赖性的调节性细胞死亡过程，已被认为参与DE中观察到的神经退行性变。智能汤（SS）是一种经典中药方剂，用于治疗记忆障碍。本研究评估了SS对DE的治疗潜力。研究人员发现，口服SS可显著改善DE大鼠模型的学习和记忆缺陷。这种认知改善伴随海马铁死亡的抑制，表现为脂质过氧化、铁超载和活性氧（ROS）水平降低，同时抗铁死亡蛋白GPX4和FTH1水平升高。此外，SS治疗减轻了异常线粒体改变并降低了线粒体自噬相关蛋白（PINK1和Parkin）的水平，提示其缓解了触发过度线粒体自噬活性的上游损伤。在机制上，SS似乎靶向NR3C1（糖皮质激素受体），下调其对关键铁代谢因子LCN2和NCOA4的转录激活。总之，研究人员的发现表明，SS可能通过NR3C1/LCN2/NCOA4轴抑制铁死亡并改善线粒体稳态，从而在DE中发挥神经保护作用，为该病症提供了一种有前景的治疗策略。
**研究背景**
糖尿病脑病（DE）是糖尿病患者中枢神经系统的病理并发症，以神经生理和结构缺陷为特征，表现为不同程度的认知功能障碍。据2019年统计数据显示，全球糖尿病发病率约为9.3%（约4.63亿人），预计到2030年将升至10.2%（约5.78亿人），到2045年将达10.9%（约7亿人）。糖尿病患者群体的不断增长导致DE患病率持续上升，对公共健康构成日益严重的威胁。自20世纪60年代首次报道以来，DE受到越来越多的关注。然而，目前对DE的认识仍然不足，现有治疗选择有限。因此，深入研究DE的发病机制并开发新型治疗药物迫在眉睫。
传统中药（TCM）是一个整体医学体系，在科学和医学界获得越来越多的学术认可。许多研究报道中药方剂具有低毒性和多种生物活性，如抗炎和神经保护作用。智能汤（SS）最早记载于中国明代《古今医鉴》，是一种具有神经保护作用的中药方剂，用于治疗记忆缺陷已有数百年历史。该方剂由三味传统中药组成，即远志（Radix Polygalae）、茯苓（Poriacum Radix Pini）和石菖蒲（Rhizoma Acori Tatarinowii），各自具有针对神经功能障碍的药理功效。此外，SS在阿尔茨海默病（AD）治疗中也显示出明显效力。AD转基因果蝇经SS治疗后可见淀粉样蛋白β水平降低和神经元丢失延缓。阿瑞斯与SS联合使用甚至 exert 更好的治疗效果。这些研究强调了SS对AD的神经保护功效。鉴于DE具有AD样病理特征，研究人员假设SS也可改善DE中发生的认知功能障碍。
铁死亡是2012年发现的一种铁依赖性调节性细胞死亡形式，以细胞内铁积累、谷胱甘肽（GSH）耗竭、脂质过氧化和谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）表达降低为特征。自发现以来，铁死亡已被认为参与包括DE在内的多种疾病的发病机制。值得注意的是，来源于中草药的活性化合物，如石斛碱和槲皮素，已被证明可通过减轻氧化应激、脂质过氧化和铁超载来抑制铁死亡，从而改善小鼠模型的认知障碍。这些见解为研究SS与DE之间的潜在关系提供了重要机制线索。
**研究内容与结论**
本研究采用高脂饮食诱导的DE大鼠模型和高糖（HG）损伤的PC12细胞模型，评估SS对DE中铁死亡的治疗作用并阐明其潜在分子机制。研究人员将网络药理学分析与细胞功能获得和缺失实验相结合，鉴定并验证了SS治疗DE的关键靶点。研究结果表明，SS通过NR3C1/LCN2/NCOA4轴抑制铁死亡并改善线粒体稳态，从而在DE中发挥神经保护作用，为该病症提供了一种有前景的治疗策略。
**关键技术方法**
研究人员采用高脂饮食联合链脲佐菌素注射诱导SD大鼠DE模型，并以高糖（100 mM）培养PC12细胞构建体外模型。通过Morris水迷宫（MWM）评估空间学习记忆功能，采用HE染色和免疫荧光分析海马组织病理及NR3C1表达。通过网络药理学分析筛选SS靶点与铁死亡及AD基因集的交集。采用生化试剂盒检测海马组织铁含量、ROS、GSH、MDA和SOD活性，Western blot和qRT-PCR检测GPX4、FTH1、NR3C1、LCN2、NCOA4、PINK1和Parkin表达，双荧光素酶报告基因实验验证NR3C1对LCN2启动子的转录调控。样本来源为8周龄雄性SD大鼠及PC12细胞系（中国科学院细胞库，上海）。
**研究结果**
**3.1 SS对血糖水平的影响**：通过高糖高脂饮食联合链脲佐菌素注射构建DE大鼠模型，监测各组血糖水平。结果显示，DE模型组血糖始终显著高于对照组（p < 0.05）。灌胃SS 2至3周后，除低剂量组外，SS治疗组血糖较模型组显著降低（p < 0.05），高剂量组降幅最大。提示SS可降低大鼠血糖水平，延缓DE进展。
**3.2 SS改善SD大鼠学习记忆缺陷**：通过MWM测试评估SS对空间学习记忆的影响。结果显示，DE模型组寻找逃生平台时间显著延长，撤去平台后游泳轨迹紊乱、目标象限停留时间短且穿台次数少。SS治疗组，尤其高剂量组，显著逆转上述现象。HE染色显示SS治疗组海马CA1区椎体细胞增多且排列更紧密。提示SS可改善DE大鼠学习记忆缺陷并修复海马病理损伤。
**3.3 SS抑制SD大鼠海马铁死亡**：通过检测海马脂质过氧化指标、ROS和铁含量发现，DE模型组GSH水平和SOD活性显著降低（p < 0.01），MDA、ROS和铁水平显著升高（p < 0.01），SS剂量依赖性逆转上述变化。Western blot显示DE模型组GPX4和FTH1表达显著降低（p < 0.01），SS剂量依赖性逆转其下调。同时，DE模型组线粒体自噬相关蛋白PINK1和Parkin显著升高（p < 0.01），SS治疗减弱其上调。提示SS通过上调GPX4和FTH1抑制海马铁死亡，并通过减轻上游铁死亡损伤减少过度线粒体自噬激活，恢复线粒体稳态。
**3.4 网络药理学分析**：通过网络药理学分析发现，SS三味药靶点合并后共2486个靶点，捕获471个铁死亡基因中的162个（OR = 3.88，p = 5.9 × 10?3?）和1972个高置信度AD基因中的514个（OR = 2.87，p = 1.3 × 10???），分别富集约4倍和3倍。每味药单独分析均显示相同模式（均p < 1 × 10??）。SS靶点、铁死亡基因和AD基因三者交集包含59个核心基因，覆盖铁死亡通路各环节，包括GPX4、LCN2、NCOA4、TF、TFRC、CP等。SS成分命中42个KEGG铁死亡通路组件中的22个。以DE基因集替代AD基因集富集更强（OR = 13.13，p = 1.2 × 10???）。上述核心基因中GPX4、LCN2和NCOA4引导了后续实验。
**3.5 SS抑制NR3C1并转录促进LCN2和NCOA4**：通过检测大鼠脑组织发现，DE模型组NR3C1、LCN2和NCOA4的mRNA和蛋白水平显著上调（p < 0.01），SS浓度依赖性降低其表达。LASAGNA数据库分析表明NR3C1可结合LCN2启动子区域，双荧光素酶报告基因实验证实NR3C1过表达显著增加LCN2活性（p < 0.01）。NeuN和NR3C1双免疫荧光染色显示DE大鼠海马NR3C1荧光信号与NeuN重叠，SS-M组NR3C1荧光强度显著低于DE模型组。提示SS通过直接靶向NR3C1调控LCN2和NCOA4，通过失活NR3C1/LCN2/NCOA4轴减少DE大鼠铁死亡。
**3.6 SS抑制HG诱导的PC12细胞铁死亡**：通过HG（100 mM）诱导PC12细胞铁死亡模型发现，HG显著降低细胞活力（p < 0.01），各剂量SS共处理均显著恢复（p < 0.01）。SS抑制HG诱导的MDA升高，逆转GSH和SOD活性降低。HG显著下调GPX4和FTH1蛋白水平（p < 0.01），SS治疗恢复其表达。同时HG上调PINK1和Parkin（p < 0.01），SS减弱其上调。进一步分析NR3C1、LCN2和NCOA4发现，HG组三者显著上调（p < 0.01），SS含药血清降低其水平。NR3C1过表达可抑制SS对LCN2和NCOA4的下调作用；LCN2过表达抑制SS对NCOA4的下调；NR3C1过表达联合LCN2沉默则降低NCOA4水平。NR3C1和LCN2过表达可减弱SS对GSH、MDA、SOD以及GPX4、FTH1、Parkin和PINK1的调节作用。GPX4抑制剂（RSL3）和ROS清除剂（NAC）均抑制SS对FTH1和GPX4的上调作用。提示SS通过NR3C1/LCN2/NCOA4轴抑制铁死亡并减少代偿性线粒体自噬激活。
**讨论与结论**
DE以糖尿病所致认知障碍和脑神经生理或结构改变为特征，临床主要表现为学习和记忆障碍，最终可导致痴呆，严重影响患者生活质量并造成巨大社会医疗负担。SS由《古今医鉴》（1576年）记载的三味药组成，用于治疗认知障碍已有数百年历史。本研究验证了SS对DE大鼠认知障碍的治疗作用，行为学测试显示SS可挽救DE大鼠记忆缺陷并改善学习记忆能力，组织病理学染色显示SS可改善突触结构从而增强神经元功能。这些数据支持SS可改善神经退行性变，是治疗DE的有前景的候选药物。
为阐明SS的神经保护机制，研究人员采用生物信息学分析、DE模型大鼠体内研究和PC12细胞体外验证相结合的综合方法。研究结果表明，SS通过抑制铁死亡挽救DE认知功能障碍。体内证据显示SS治疗DE大鼠脑组织中铁含量和ROS水平降低，同时铁死亡抑制因子FTH1和GPX4水平升高。在PC12细胞模型中，SS同样减轻铁死亡标志物，提供受控的机制印证。进一步研究发现该抗铁死亡效应通过靶向NR3C1（糖皮质激素受体）介导，NR3C1转录调控关键铁代谢因子LCN2和NCOA4。鉴于线粒体在铁死亡执行中的核心作用，研究人员还检测了线粒体自噬活性。SS治疗后线粒体自噬相关蛋白PINK1和Parkin下调，提示SS改善线粒体自噬的过度激活。需要指出的是，SS并不直接抑制核心线粒体自噬机器，而是通过减轻上游铁死亡损伤（经NR3C1/LCN2/NCOA4轴）及相关线粒体损伤，减少触发代偿性但最终有害的线粒体自噬流的病理刺激，从而帮助恢复线粒体自噬平衡。总之，研究结果表明SS有效挽救DE认知缺陷，这种神经保护可能通过NR3C1/LCN2/NCOA4信号轴抑制铁死亡，进而减轻继发性线粒体损伤并正常化相关细胞清除通路来实现。
研究人员承认本研究未包含UPLC-MS或HPLC植物化学分析以鉴定SS中的生物活性化合物，这是本研究的局限性，使得单个化合物与协同相互作用对观察到的治疗效应的相对贡献尚不清楚。然而，网络分析为本研究的实验发现增加了系统层面的论据。富集不仅限于方剂整体：三味药单独分析均在铁死亡基因中显著富集，其与AD相关基因共享的59个核心基因涵盖整个铁死亡过程，包括铁输入和储存、膜脂重塑、ROS产生和GPX4防御线。这种广度符合多组分汤剂的行为，也与治疗大鼠中观察到的结果一致：GPX4和FTH1恢复、铁和ROS积累消退、NR3C1/LCN2/NCOA4轴下调。LCN2出现在核心基因集中，NCOA4和铁蛋白自噬机器涵盖在KEGG铁死亡通路中，为研究人员实验验证的轴提供了网络层面支持。既往关于组成药味的研究指向相同方向。石菖蒲提取物近期被报道通过Nrf2/GPX4信号抑制APP/PS1小鼠和Aβ攻击HT22细胞的神经元铁死亡，伴随TFR1降低和FPN1表达增加。远志中tenuifolin通过恢复GPX4和SLC7A11并抑制ACSL4保护D-半乳糖和Aβ损伤的HT22细胞和小鼠，并通过相同Nrf2/SLC7A11/GPX4途径对抗皮质酮诱导的铁死亡。Senegenin对Aβ25-35诱导的PC12细胞铁死亡显示类似效应。茯苓三萜和多糖通过AMPK、PPARα和Nrf2/GPX4在外周模型中调节铁死亡，尽管神经元系统尚待测试。最能说明问题的是，与SS共享远志、石菖蒲和茯苓的开心散已被证明通过SIRT1/FSP1和Keap1/Nrf2/GPX4信号抑制阿尔茨海默模型中的铁死亡，并在睡眠剥夺小鼠中正常化海马TFRC、SLC7A11、GPX4、ACSL4和FTH1。这些研究中涉及的分子（SIRT1、GPX4、HMOX1和TFRC）均出现在研究人员的核心基因中。
还需注意本研究采用PC12细胞（大鼠嗜铬细胞瘤细胞系）作为体外模型。尽管PC12细胞是研究神经元存活经过充分验证的系统，适合初步机制研究，但其并非海马来源。未来采用原代海马神经元培养或海马来源细胞系（如HT-22）的研究将更有价值地确认SS对DE的神经保护作用。
正如结果部分所示，与DE模型相比，SS治疗显著降低大鼠血糖水平。这一现象可能引发疑问：认知改善是全身降糖的继发效应还是SS对海马的直接神经保护效应。全身降糖确实有助于认知改善。然而，体外实验也证明SS在恒定HG条件下直接抑制铁死亡并增强海马培养物中的神经元活力，独立于任何全身代谢变化。这为SS的内在神经保护特性提供了直接证据。因此，SS的认知益处可能源于有益全身效应（改善高血糖环境）和对海马神经元的关键直接神经保护效应（可能通过抑制铁死亡）的综合作用。未来采用纵向血糖监测和治疗组内个体水平相关性分析的研究将有助于进一步阐明各机制的相对贡献。
NR3C1下调是经典应激模型的共同特征。然而，本研究中DE模型NR3C1表达水平上调。这一现象可能代表对DE特定代谢损伤的独特病理反应。在此背景下，NR3C1表达升高似乎主动驱动铁死亡细胞死亡程序，如其对关键铁死亡介质LCN2的转录促进所证明。这与NR3C1激活可在其他病理背景下促进铁死亡的新兴证据一致。
尽管本研究证明了SS通过抑制海马神经元铁死亡减轻SD大鼠认知障碍的推定作用，但仍存在一些局限性。本研究涉及的调控机制有待未来深入研究，如SS如何降低NR3C1表达水平。尽管本研究提示SS可能通过NR3C1/LCN2/NCOA4轴发挥神经保护活性，但是否有其他通路参与SS相关抗铁死亡效应仍不清楚。需要进一步研究探索其他分子通路以全面理解SS的抗铁死亡效应。此外，SS对其他疾病的治疗效应和分子机制也值得评估。
**研究结论翻译**：总之，研究人员的发现表明，SS可能通过NR3C1/LCN2/NCOA4轴抑制铁死亡并改善线粒体稳态，从而在DE中发挥神经保护作用，为该病症提供了一种有前景的治疗策略。
