《Poultry Science》：Chicoric Acid Alleviates LPS-induced Hepatic Inflammation in Broilers by Regulating the TLR4/MAPK Signaling Pathway
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菊苣酸（CA）是一种天然酚酸，具有良好的抗炎特性。本研究系统评价了CA对脂多糖（LPS）诱导的肉鸡肝脏炎症的保护作用及其潜在机制。网络药理学分析鉴定出277个与肝脏炎症相关的重叠基因，功能富集揭示Toll样受体4（TLR4）/丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号
菊苣酸（CA）是一种天然酚酸，具有良好的抗炎特性。本研究系统评价了CA对脂多糖（LPS）诱导的肉鸡肝脏炎症的保护作用及其潜在机制。网络药理学分析鉴定出277个与肝脏炎症相关的重叠基因，功能富集揭示Toll样受体4（TLR4）/丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路显著参与其中。分子对接提示CA与核心靶点之间存在潜在稳定相互作用，包括TLR4、转化生长因子-β活化激酶1（TAK1）、c-Jun N末端激酶（JNK）和p38 MAPK。体内实验表明，CA显著改善LPS触发的肝脏组织病理学损伤，并降低促炎细胞因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）和白细胞介素-6（IL-6）的分泌。体内qRT-PCR显示，CA显著下调肉鸡肝脏组织中TLR4、TAK1、JNK和p38的mRNA表达，其中对JNK转录水平的抑制作用尤为显著。在LMH细胞体外实验中，qRT-PCR表明CA降低了LMH细胞中上述靶点的mRNA水平；基于细胞的Western blot显示总TLR4蛋白丰度降低，而总TAK1和p38蛋白水平未发生变化，同时伴随TAK1和p38磷酸化水平降低。综上，这些发现为将CA开发为一种天然、抗生素替代性家禽肝脏保护剂提供了相关性药理学证据。
研究背景：动物源性食品是人类能量、蛋白质和必需微量营养素的重要来源。家禽生产具有周期短、饲料效率高、文化和宗教饮食限制少等特点，禽肉和禽蛋是全球动物源性食品消费的核心组成部分。然而，现代家禽生产的集约化在提高生产效率的同时，也增加了肉鸡对病原体和各种应激源的暴露，从而提高了炎症性疾病和氧化应激损伤的风险。在此背景下，细菌感染及其他病因触发的肝脏炎症已成为限制家禽健康状况和生产性能的主要制约因素。在集约化饲养环境中，革兰氏阴性菌感染及相关内毒素释放是导致家禽肝脏炎症的重要病因学因素，其中脂多糖（LPS）作为内毒素的核心致病成分尤其值得关注。LPS是革兰氏阴性菌外膜的主要成分，也是炎症反应的主要诱导剂。它通过涉及Toll样受体4（TLR4）、核因子-κB（NF-κB）和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）的信号通路激活免疫系统，促进促炎介质的过度积累，触发细胞因子风暴和氧化应激，最终导致肝脏炎症。肉鸡生长迅速，肝脏代谢活动旺盛，给肝脏带来较大的生理负担，使肉鸡在商业饲养条件下更易发生LPS介导的肝损伤。目前，畜禽炎症性疾病的常规防治主要依赖抗生素和化学合成抗炎药物，其广泛使用已引发细菌耐药性和动物组织药物残留等严峻挑战。因此，寻找高效、低毒、无残留的天然生物活性物质作为替代品已成为研究重点。菊苣酸（CA）是一种来源于菊科植物的天然酚酸，具有显著的抗炎、抗氧化和免疫调节活性，其肝脏保护作用已在啮齿动物模型中得到验证。然而，CA在家禽中的药理特性及作用机制，特别是其对LPS诱导的肝脏炎症的保护效果及潜在调控通路，目前系统研究仍较匮乏。
研究人员开展的研究及结论与意义：本研究采用网络药理学联合分子对接方法预测CA作用的潜在靶点和核心信号通路，并基于此在LPS诱导的肉鸡肝脏炎症模型中通过体内和体外方法评价CA的抗炎和肝脏保护作用。研究结论表明，CA对LPS诱导的肝脏炎症的肝脏保护作用与调控TLR4/MAPK信号通路相关，这些相关性发现表明该保护作用至少部分归因于对TLR4/TAK1–p38信号级联的抑制。本研究拓展了对菊苣酸作为天然生物活性化合物的认识，为其作为饲料添加剂用于缓解家禽炎症性肝脏疾病提供了实验支持。
关键技术方法：研究采用多数据库交叉验证策略进行网络药理学靶点预测，利用Venny 2.1.0筛选重叠靶点，通过STRING数据库和Cytoscape 3.10.2构建蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络并进行拓扑分析，采用DAVID数据库进行GO和KEGG通路富集分析，运用AutoDock Vina进行分子对接。动物实验选用24只1月龄健康中国白羽肉鸡，随机分为对照组、阳性组、模型组和给药组。细胞实验采用鸡肝癌细胞系（LMH细胞，来源为上海贝纳）。检测方法包括H&E染色组织病理学分析、ELISA检测细胞因子、qRT-PCR检测基因表达及Western blot检测蛋白表达。
研究结果：（1）网络药理学预测结果：通过多数据库交叉验证建立CA候选靶点非冗余数据集，共获得465个原始预测靶点；从OMIM和GeneCards数据库获得4791个疾病相关基因；Venn分析揭示277个重叠基因；PPI网络包含277个节点和3968条相互作用边；GO富集获得187个显著条目（86个BP、50个CC、51个MF）；KEGG富集获得153条显著通路，MAPK信号通路和Toll样受体信号通路显著富集。（2）CA与核心靶点的分子对接：CA与TLR4、TAK1、p38、JNK1和JNK2结合能范围为?6.9至?9.1 kcal/mol，提示良好的相互作用。（3）CA对LPS诱导的肝脏组织病理学变化的影响：H&E染色显示模型组肝索排列紊乱、肝细胞空泡变性、窦状隙和血管周围区域明显充血及炎性细胞浸润；CA治疗组肝细胞空泡变性明显减少，窦状隙充血减轻；模型组肝脏/体重比显著升高（P < 0.01）。（4）CA减轻肉鸡LPS诱导的肝脏炎症：LPS暴露显著增加血清和肝组织中TNF-α、IL-1β和IL-6水平（P < 0.01）；CA干预和阳性药物治疗均显著抑制促炎细胞因子的异常释放；qRT-PCR显示模型组TLR4、MYD88、TAK1、JNK1和JNK2转录水平急剧上调（P < 0.01），CA给药有效逆转了这些通路相关基因的升高表达（P < 0.01）。（5）CA预处理或治疗对LPS诱导的LMH细胞活力的影响：CA在所有测试浓度下细胞活力保持在90%以上；LPS以剂量依赖方式降低细胞活力，选择50 μg/mL（细胞活力69.8%）作为标准攻击剂量；CA（50–600 μmol/L）预处理以浓度依赖方式增加细胞活力，400 μmol/L时保护作用最大；LPS攻击后给予CA仍发挥明显细胞保护作用，400 μmol/L时细胞活力达84.14%。（6）CA减轻LMH细胞中LPS诱导的促炎信号并伴随TLR4/MAPK通路组分下调：qRT-PCR显示LPS显著升高IL-6、TNF-α、IL-1β及TLR4/MAPK通路关键基因mRNA水平（P < 0.01），CA或DXM预处理有效逆转此上调；Western blot显示LPS刺激升高总TLR4蛋白丰度并增强TAK1和p38磷酸化，CA预处理显著减弱这些分子变化（P < 0.05），而总TAK1和总p38蛋白丰度未变。
讨论部分总结与结论翻译：在集约化肉鸡生产体系下，肉鸡生长速度快，肝脏作为系统代谢和解毒的中心器官极易发生炎症损伤。肝脏炎症破坏营养代谢并损害免疫功能，因此预防肝脏病变已成为现代高效家禽生产的重中之重。在抗生素替代品的迫切需求驱动下，多酚、黄酮和萜类等植物源性抗炎化合物因其免疫调节活性而被广泛研究。肝脏在先天免疫中发挥关键作用，其组织形态学特征是评价机体健康状况的重要指标。当肠道屏障完整性受损时，细菌内毒素LPS可易位进入体循环并诱导肝脏炎症。鉴于LPS能持续可靠地诱导家禽炎症反应，本研究采用LPS建立肉鸡肝脏炎症模型。本研究结果表明，CA治疗显著改善LPS诱导的肝脏病理损伤，降低血清和肝组织中的炎症介质水平。与既往天然活性物质研究一致，CA表现出稳定的抗炎活性，有效抑制TNF-α和IL-1β等促炎细胞因子的分泌。值得注意的是，CA调节MAPK相关信号分子，表明其抗炎作用主要通过MAPK通路介导。网络药理学和分子对接分析确定TLR和MAPK信号为CA靶点富集的主要通路，TLR4、JNK和p38为核心预测分子。GO富集显示CA候选靶点与柠檬酸代谢、三羧酸循环和碳水化合物代谢等基础代谢过程密切相关，而炎症条目富集程度不高，提示CA可能同时调节炎症和宿主代谢，其代谢效应值得进一步探索。由于实验模型专门用于评价LPS触发的肝脏炎症损伤，研究人员优先对炎症相关TLR/MAPK信号进行实验验证。分子对接采用人TLR4和TAK1晶体结构作为模板，因为PDB中缺乏鸡这两个蛋白的晶体结构，这种跨物种对接仅为计算机预测工具，不能完全再现鸡体内天然蛋白-配体相互作用。网络药理学作为跨物种生物信息学预测，为候选通路假设提供依据，并由禽类体内外实验验证；分子对接仅产生计算机预测而非物理结合证据，对接结果应谨慎解读。TLR4作为LPS感知的核心模式识别受体，在多种动物物种肝脏炎症发病机制中占据关键地位。在家禽中，TLR4 mRNA表达升高反复与LPS触发的炎症、氧化应激和代谢紊乱相关。LPS结合后，TLR4招募衔接蛋白MyD88启动细胞内信号级联，最终促进促炎细胞因子的转录和分泌。本研究的分子对接提示CA与TLR4蛋白之间可能存在有利相互作用，暗示CA可能干扰LPS识别和随后的受体激活。qRT-PCR验证CA治疗显著减弱LPS诱导的肉鸡肝脏TLR4和MyD88 mRNA上调。体外实验进一步证明CA预处理降低LPS刺激的鸡肝癌细胞中TLR4、MyD88和主要促炎细胞因子的mRNA丰度。这些观察与先前报道一致。TAK1是TLR4下游的关键调控节点，作为连接TLR4与下游激酶级联的分子枢纽。研究人员将TAK1纳入分子对接，预测CA与TAK1之间存在有利相互作用，提示CA可能通过 interacting with TAK1调节下游信号。体内实验中LPS上调肉鸡肝脏TAK1 mRNA，CA逆转此升高。现有文献表明JNK和p38是肝脏炎症损伤的核心介质，p38在应激诱导的肝细胞凋亡中发挥主导作用。值得注意的是，在LMH细胞实验中反复尝试未能获得稳定的磷酸化JNK条带，因此本研究仅评估了JNK转录变化，而未检测体外TAK1和p38磷酸化。本研究整合生物信息学分析、分子对接、体内肉鸡模型和体外LMH细胞实验，探讨CA对LPS诱导的肝脏炎症损伤的保护作用。生物信息学分析和分子对接仅作为计算机预测工具，不能确认CA与靶蛋白之间的实际物理相互作用。CA似乎通过下调体内上游受体和衔接基因的转录以及抑制体外LMH细胞中TAK1和p38磷酸化来调节TLR4/MyD88/TAK1/MAPK信号级联。这一核心炎症信号轴活性的改变伴随促炎细胞因子分泌减少和肝脏病理表现改善。综上，从计算机预测到湿实验的多层次证据表明，CA在LPS攻击的肉鸡中发挥肝脏保护和抗炎活性。本研究存在若干局限性：第一，无法区分观察到的效应是源于CA与靶蛋白的直接结合还是间接细胞反馈反应；第二，虽然在LMH细胞中检测到TAK1和p38磷酸化改变，但未在肉鸡肝脏组织中通过Western blot验证这些蛋白的磷酸化形式；第三，组织病理学评估仅依赖代表性H&E显微照片，未进行盲法半定量评分；第四，CA治疗后炎症细胞因子和信号激酶转录丰度降低可能部分源于一般细胞保护效应而非对TLR4/MAPK炎症信号级联的特异性调节，需要额外测量如LDH释放、细胞归一化细胞因子定量和标准化凋亡检测来明确区分细胞保护与直接通路调控。总之，CA对LPS诱发肝脏炎症的肝脏保护作用与TLR4/MAPK信号通路的调节相关，本研究拓展了对菊苣酸作为天然生物活性化合物的认识，为其作为饲料添加剂用于缓解家禽炎症性肝脏疾病的潜在应用提供了实验支持。结论部分翻译：分子对接提示CA与p38之间存在潜在相互作用。在肉鸡中，CA下调LPS诱导的肝脏TAK1、JNK和p38 mRNA表达。使用LMH细胞，研究人员进一步验证CA抑制TAK1和p38的磷酸化，而这些靶点的总蛋白水平保持不变。综上，CA对LPS诱发的肝损伤发挥抗炎和肝脏保护功能，这些相关性发现表明该保护作用至少部分归因于对TLR4/TAK1–p38信号级联的抑制。
