ALKBH5通过介导BARD1的m?A修饰调控鸡成肌细胞增殖与分化

《Poultry Science》：ALKBH5 mediates m?A modification of BARD1 to regulate the proliferation and differentiation of chicken myoblasts

　　

骨骼肌发育是肉鸡育种中的关键经济性状，N?-甲基腺苷（m?A）修饰在成肌过程中的转录后基因调控中发挥关键作用。AlkB同源蛋白5（ALKBH5）是一种主要的m?A去甲基化酶，而BRCA1相关RING结构域蛋白1（BARD1）参与细胞周期调控。本研究采用过表达和RNA干扰两种方法，系统研究了ALKBH5和BARD1在鸡原代成肌细胞（CPMs）增殖与分化中的作用。研究发现，ALKBH5显著抑制成肌细胞增殖并促进分化。机制上，ALKBH5降低了整体m?A水平以及BARD1 mRNA上的m?A丰度，从而降低BARD1 mRNA稳定性并下调其表达。功能上，BARD1发挥相反作用，增强成肌细胞增殖并抑制分化。值得注意的是，在BARD1的m?A修饰位点引入同义突变可显著减弱其促增殖和抗分化活性。综上所述，这些发现揭示了ALKBH5通过m?A去甲基化调控BARD1的表达和功能，从而调节CPMs的增殖与分化。本研究为骨骼肌发育的表观转录组调控提供了新的机制见解。

**研究背景与问题**

骨骼肌是动物体内最大的组织，约占体重的40%，其发育受多基因网络的精密调控。鸡骨骼肌发育是一个复杂且 tightly orchestrated 的过程，肌纤维总数在胚胎发育期间确定，出生后肌肉生长主要依赖肌肉特异性蛋白的积累以及成肌细胞的增殖与分化。正常骨骼肌发育依赖于多种基因的协调调控和有序表达，然而鸡骨骼肌发育的遗传和分子机制尚未完全阐明。BARD1是肿瘤抑制因子乳腺癌易感基因1（BRCA1）的主要相互作用伙伴，二者通过N端RING结构域形成异二聚体，保留E3泛素连接酶活性，在DNA损伤修复、细胞周期控制和基因组稳定性维持中发挥关键调控作用。然而BARD1在鸡成肌细胞增殖和分化中的生物学作用尚未见报道。RNA表观遗传学近年来成为生命科学研究的热点，在已鉴定的170多种RNA化学修饰中，m?A是真核mRNA中最丰富且分布最广的动态修饰之一，通过调控RNA稳定性、剪接、核输出和翻译，在细胞分化、发育和应激反应中发挥核心作用。ALKBH5是AlkB家族的关键RNA m?A去甲基化酶，作为RNA表观转录组的重要调控因子，动态去除RNA分子上的m?A修饰，广泛影响RNA代谢、剪接、核输出和翻译效率，参与多种生理和病理过程的调控。然而ALKBH5在鸡成肌细胞中的功能尚未见报道。因此，本研究聚焦ALKBH5-m?A-BARD1轴，阐明其在鸡成肌细胞增殖和分化中的机制作用，为鸡遗传育种提供新的理论依据。

**关键技术方法**

研究人员从河南农业大学家禽种质资源场获取受精蛋（n=55），于胚胎第11天采集Arbor Acres（AA）肉鸡胚胎腿肌组织，分离鸡原代成肌细胞（CPMs）。采用过表达和RNA干扰方法，构建pcDNA3.1-3×Flag-ALKBH5和pcDNA3.1-3×Flag-BARD1过表达质粒，合成siALKBH5和siBARD1。通过qRT-PCR、Western blot、CCK-8、流式细胞术、EdU掺入、免疫荧光、m?A RNA甲基化定量试剂盒、MeRIP-qPCR、双荧光素酶报告基因实验和放线菌素D追踪实验等进行功能验证。统计采用单因素方差分析和Student's t检验。

**研究结果**

**ALKBH5和BARD1在鸡成肌细胞中的时序表达模式**：通过m?A RNA甲基化定量试剂盒检测发现，分化期整体m?A甲基化水平显著低于增殖期，D2和D4之间无显著差异。qRT-PCR显示ALKBH5 mRNA在D2和D4显著高于G1，与整体m?A甲基化谱一致；BARD1 mRNA表达持续下降，提示其在成肌细胞增殖和分化中具有潜在调控作用。

**ALKBH5抑制鸡成肌细胞增殖并促进分化**：过表达ALKBH5显著下调促增殖基因CDK1、PCNA、CCNB1和CCND1的mRNA水平，上调抗增殖基因P21；敲低则相反。CCK-8显示过表达ALKBH5显著降低细胞活力，流式细胞术显示S期细胞比例显著减少，EdU掺入实验证实EdU阳性细胞百分比显著降低，Western blot显示CDK1蛋白水平显著下降。在分化方面，过表达ALKBH5显著上调分化标志基因MyHC、MyOD和MyOG的mRNA水平，免疫荧光显示肌管面积显著增加，Western blot显示MyHC蛋白水平显著升高；敲低则产生相反效果。

**ALKBH5介导BARD1的m?A修饰并调控其mRNA稳定性和表达**：通过在线工具预测BARD1 CDS区5个m?A修饰位点。过表达ALKBH5显著降低整体m?A修饰水平，MeRIP-qPCR显示BARD1高置信度m?A修饰位点的m?A水平显著降低。qRT-PCR显示过表达ALKBH5显著下调BARD1 mRNA水平，敲低则相反，回补实验可显著恢复。放线菌素D追踪实验表明过表达ALKBH5显著降低BARD1 mRNA稳定性。此外，ALKBH5显著上调YTHDF2 mRNA表达，过表达YTHDF2显著降低BARD1 mRNA表达，提示ALKBH5可能通过YTHDF2影响BARD1的转录后调控。

**BARD1促进鸡成肌细胞增殖并抑制分化**：过表达BARD1显著上调CDK1、PCNA、CCNB1和CCND1的mRNA水平，下调P21；敲低则相反。CCK-8显示过表达BARD1显著增强细胞活力，流式细胞术显示S期细胞比例显著增加，EdU实验证实EdU阳性细胞显著增多，Western blot显示CDK1蛋白水平显著上调。在分化方面，过表达BARD1显著下调MyHC、MyOD和MyOG的mRNA水平，免疫荧光显示肌管面积显著减小，Western blot显示MyHC蛋白水平显著降低；敲低则产生相反效果。

**BARD1 m?A修饰位点突变减弱其对鸡成肌细胞增殖和分化的影响**：选择BARD1 CDS区高置信度m?A修饰位点进行同义突变，预测确认突变后该位点被消除。双荧光素酶报告基因实验显示Mut组荧光素酶活性显著低于WT组。qRT-PCR证实WT和Mut BARD1 mRNA水平均显著升高。与WT相比，Mut显著下调促增殖基因CDK1、PCNA、CCNB1和CCND1的mRNA水平，上调P21；显著上调分化标志基因MyHC、MyOD和MyOG的mRNA水平。CCK-8显示Mut组细胞活力显著低于WT组，EdU实验证实Mut组EdU阳性细胞百分比显著降低，免疫荧光显示Mut组肌管面积显著增加，Western blot显示Mut组CDK1蛋白水平显著降低、MyHC蛋白水平显著升高。表明m?A修饰对BARD1调控鸡成肌细胞增殖和分化的正常功能至关重要。

**讨论与结论**

本研究以鸡成肌细胞为模型，系统研究了m?A去甲基化酶ALKBH5及其潜在下游靶标BARD1的生物学功能，阐明了ALKBH5可能通过m?A擦除调控BARD1表达从而影响成肌细胞增殖和分化的分子机制。既往研究表明ALKBH5在鸡肌纤维类型形成调控中发挥关键作用。本研究进一步发现ALKBH5协调调控增殖和分化相关基因的表达，抑制鸡成肌细胞增殖并促进分化。BARD1表型与ALKBH5相反，促进成肌细胞增殖并抑制分化。通过在线预测工具鉴定出BARD1中一个被ALKBH5特异性擦除的高置信度m?A修饰位点，同义突变消除该m?A修饰后，BARD1促增殖和抑分化能力显著减弱，表明BARD1的生物学功能依赖于该特定位点的m?A修饰。MeRIP-qPCR证实过表达ALKBH5显著降低BARD1 mRNA的m?A修饰水平，降低BARD1 mRNA丰度并加速其降解。双荧光素酶报告基因实验进一步证实缺乏m?A位点的BARD1突变体荧光素酶活性显著低于野生型。此外，YTHDF2被证明可调控BARD1 mRNA表达，提示BARD1的转录后调控可能至少部分由YTHDF2介导。尽管本研究主要聚焦ALKBH5-m?A-BARD1调控轴，但越来越多的证据表明该轴与若干已确立的信号通路之间存在潜在串扰，包括MyoD/Myogenin信号级联、Myostatin介导的生长抑制以及IGF-1/PI3K/Akt通路，但直接实验证据目前尚缺乏，未来研究拟采用全转录组m?A图谱结合功能实验系统阐明这些相互作用。综上所述，本研究揭示了ALKBH5-m?A-BARD1调控轴在鸡骨骼肌发育中的作用，为成肌过程的表观转录组调控提供了新见解。研究结论：本研究揭示了ALKBH5和BARD1在鸡成肌细胞中的拮抗调控关系：ALKBH5抑制增殖并促进分化，而BARD1发挥相反作用。BARD1的生物学功能依赖于其mRNA内的m?A修饰位点，该位点被ALKBH5的去甲基化酶活性擦除，导致BARD1 mRNA稳定性和表达降低。这些发现阐明了骨骼肌发育中的ALKBH5-m?A-BARD1调控轴，为成肌过程的表观转录组调控提供了新见解。