热应激与禽致病性大肠杆菌感染对无笼饲养后期产蛋母鸡细菌定植动态、黏膜与全身免疫及盲肠微生物组稳态的差异性影响

《Poultry Science》：Heat Stress and Avian Pathogenic Escherichia coli Infection Differentially Alter Bacterial Colonization Dynamics, Mucosal and Systemic Immunity, and Cecal Microbiome Homeostasis in Late-Production Laying Hens in Cage-Free Housing

　　

热应激（HS）与禽致病性大肠杆菌（APEC）感染是商业产蛋母鸡健康和生产力的主要挑战，但其联合效应尚不清楚。本研究评估了持续性热应激（HS）与口服APEC O78感染对70周龄Hy-Line W-36无笼饲养后期产蛋母鸡生产性能、细菌定植、免疫应答及盲肠微生物组的影响。共112只母鸡被随机分配至四个处理组：热中性对照组（TNC）、热中性APEC接种组（TNI）、热应激对照组（HSC）和热应激APEC接种组（HSI）。室内热环境条件设定为22°C或35°C，感染组经口灌服1 × 10⁹ CFU的APEC O78。热应激对产蛋率和蛋重产生负面影响，而单独APEC感染未进一步损害生产性能。APEC无论热环境如何均迅速建立持续性胃肠道定植，而HS在接种后7天独特地加剧了肺部定植。与对照组和单一刺激组相比，HS与APEC联合刺激诱导脾脏IL-6、TNF-α和Hsp70更大幅度的上调，并通过减弱APEC诱导的常规TCRαβ⁺上皮内淋巴细胞应答同时扩增非常规先天淋巴样细胞群来改变黏膜免疫。盲肠微生物组分析确定HS是微生物失调的主要驱动因素，联合刺激产生最大程度的微生物丰富度降低和最多数量的差异丰富属。预测功能分析进一步表明联合HS与APEC刺激下涉及嘌呤降解和精氨酸生物合成的微生物代谢通路受到破坏。这些发现表明HS加剧了APEC相关的免疫失调和微生物组破坏，强调了综合热管理和感染控制策略对改善商业蛋鸡健康和生产力的重要性。

**研究背景** 热应激（HS）是全球家禽生产中的主要环境挑战，损害生长性能、产蛋率、产品质量和食品安全。在美国，HS每年给家禽业造成的经济损失估计超过1.28–1.65亿美元，且预计随全球气温持续上升而增加。HS还可损害淋巴器官发育和免疫功能，包括白细胞计数和抗体产生，并破坏肠道屏障功能，从而增加鸡对细菌感染的易感性。禽致病性大肠杆菌（APEC）引起的鸡大肠杆菌病通过腹膜炎、输卵管炎、气囊炎和全身感染等途径导致发病率和死亡率升高。APEC主要经口、呼吸道和泄殖腔上行途径进入宿主，随后全身播散至肝脏、脾脏和其他器官。由于APEC主要是机会性病原体，其临床严重程度在混合感染或免疫抑制的应激条件下更为显著。尽管高温和APEC感染在商业生产环境中自然共存，但将HS与APEC感染联系起来的蛋鸡特异性初步研究有限。大多数现有文献独立评估这些应激因素，或集中于肉鸡而非蛋鸡，导致对其联合生物学效应的理解碎片化。此外，尽管延长产蛋周期在经济上日益重要，但衰老已知会降低抗氧化能力并损害免疫功能，使老年鸡比年轻鸡更易受应激因素影响。据研究人员所知，尚无研究评估老年产蛋母鸡中HS与APEC感染的联合效应。此外，蛋鸡从传统笼养向无笼（CF）饲养系统的快速过渡引入了额外考量，因CF环境与更高的病原体暴露和粉尘水平相关。

**研究概述** 本研究旨在通过评估持续性HS（35°C）与口服APEC刺激对70周龄Hy-Line W-36后期产蛋母鸡在CF饲养条件下的联合效应，填补这些关键知识空白，重点关注生产性能、细菌定植、免疫应答和盲肠微生物组组成。研究结果表明，HS与APEC O78感染单独及联合差异性地改变了CF环境中老年产蛋母鸡的细菌定植动态、黏膜和全身免疫应答及盲肠微生物组组成和预测功能能力。HS持续降低产蛋率和蛋重，而APEC感染未在HS效应之外进一步恶化这些参数。APEC无论热环境如何均迅速且持续定植于胃肠道和呼吸道，而HS独特地加剧了早期肺部定植。在免疫层面，HS与APEC联合感染产生比任一单独应激更大的脾脏促炎应答，同时HS重塑黏膜上皮内淋巴细胞（IEL）组成，减弱常规T细胞应答同时扩增先天淋巴样亚群。HS似乎是盲肠微生物组失调比APEC单独感染更强的驱动因素，尽管联合刺激在微生物丰富度、多样性和属丰度方面产生最大的组成变化。预测功能通路分析揭示了处理特异性微生物代谢能力变化。这些发现强调了商业产蛋母鸡生产中综合热管理和感染控制策略的重要性，为开发有针对性的营养、基于微生物组和管理策略以提高商业蛋鸡生产在不断加剧的气候挑战下的韧性和可持续性提供了机制见解。

**关键技术方法** 研究使用112只70周龄Hy-Line W-36后期产蛋母鸡，随机分配至四个处理组（TNC、TNI、HSC、HSI），每组28只，饲养于独立环境控制室。热环境设定为22°C或35°C持续17天，感染组经口灌服1 × 10⁹ CFU耐利福平APEC O78菌株。采用HOBO数据记录仪每5分钟监测温度和相对湿度。在接种后7天和14天进行剖检，采集肝脏、肺、输卵管和盲肠内容物进行细菌学分析，脾脏用于RT-qPCR基因表达分析，回肠用于IEL分离和流式细胞术分析，盲肠内容物用于16S rRNA基因扩增子测序（V3-V4区，Illumina NextSeq 1000平台）。微生物组数据通过nf-core/ampliseq流程和DADA2推断ASV，使用SILVA数据库进行分类学注释，PICRUSt2预测功能通路。

**研究结果**

热环境条件：热应激室（HSC、HSI）环境温度在整个17天试验期间持续高于热中性室（TNC、TNI），HSC和HSI温度主要稳定在31–35°C，伴有短暂下降和尖峰，部分类似自然循环热应激条件。TNC和TNI稳定在23–26°C。TNC和TNI相对湿度稳定在45–60%，而HSC和HSI在第6天后下降至约28–30%低点后部分恢复。

生产性能：HS组（HSC和HSI）的日产蛋率（HDEP）和蛋重持续低于热中性组（TNC和TNI）。蛋重降低在HS开始后数天内显现并此后保持相对一致，HSC和HSI维持较低的日均蛋重（约62–63 g/枚） compared to TNC和TNI（约65–67 g/枚）。APEC接种未进一步改变任一热环境条件下的产蛋率或蛋重。体重在所有组间保持可比。壳破裂强度、干壳重和Haugh单位在各处理组间无变化。

APEC O78感染率：TNC和HSC组未检测到APEC O78感染。2 dpi时，TNI和HSI组间APEC阳性鸟比例无差异。7 dpi时，两组所有鸟盲肠APEC阳性，持续至14 dpi。HSI鸟肺部感染率在7 dpi显著高于TNI组（总p = 0.011），但14 dpi时两组肺部均未再检测到APEC。肝脏和输卵管在两个时间点TNI和HSI组间无显著差异。

APEC O78载量：2 dpi时泄殖腔和气管拭子细菌载量在TNI和HSI组间无显著差异。7 dpi和14 dpi时盲肠细菌载量在两组间无显著差异，中位载量持续高于2 log₁₀ CFU/g。7 dpi时所有培养阳性肺、肝和输卵管样本细菌载量处于富集检测阈值（1.32 log₁₀ CFU/g），未进行定量载量比较。

IEL亚群分析：7 dpi时，TNI组活IEL、CD45⁺和TCRαβ⁺细胞频率显著高于HSI组。HSI组TCRαβ⁺CD8αα⁺细胞频率显著高于TNI组。HSC和HSI组CD45⁺TCR^?细胞频率显著高于TNI组。14 dpi时，HSI组CD45⁺细胞频率显著高于HSC组，TNI组TCRαβ⁺CD4⁺细胞显著低于TNC、HSC和HSI组，TNI组TCRαβ⁺CD4⁺CD8αα⁺细胞显著高于HSC组，HSC和HSI组TCRαβ⁺CD8αα⁺细胞显著高于TNI组，HSI组总TCRγδ⁺细胞频率显著低于TNC和TNI组，HSI组CD45⁺TCR^?细胞显著高于TNC组，TNI组iCD8α⁺亚群显著高于TNC组。

脾脏基因表达：7 dpi时，HSI组脾脏IL-6、TNF-α和Hsp70表达显著高于所有其他处理组。HSI组TLR4和IL-10表达显著高于TNC组。IL-1β和Nrf-2表达在所有组间无差异。

微生物组分析：质量过滤后保留2,372个ASV。Alpha多样性：HSI鸟观察到的ASV数显著少于TNC、TNI和HSC鸟，Simpson指数在TNI鸟显著高于HSI鸟。Beta多样性：PERMANOVA显示所有三种距离指标下处理组间盲肠微生物群落组成存在显著差异，HSI鸟在所有排序图中显示最大离散度。分类组成：盲肠微生物组在所有组中由Bacteroidota（61.0%）和Firmicutes（30.2%）主导，Firmicutes相对丰度在HSI鸟显著高于TNC、TNI和HSC鸟。差异丰富分析：TNI vs TNC产生6个富集和5个耗竭属，HSC vs TNC产生11个富集和9个耗竭属，HSI vs TNC产生最大组成变化（14个富集和12个耗竭属），HSI vs HSC揭示21个额外差异丰富属。核心微生物组：所有四组共享87个ASV，核心ASV数量TNC（119）、TNI（121）、HSC（115）、HSI（107）。预测功能通路分析：检测到415条MetaCyc通路，24条在调整p < 0.05达到显著。TCA循环IV、苯乙胺降解超通路等在TNC和HSI鸟中显著高于TNI和HSC鸟。嘌呤核碱基降解I和L-Nδ-乙酰鸟氨酸生物合成在HSI鸟中显著低于所有其他组。

**讨论与结论** 本研究证明持续性HS和APEC感染相互作用，改变CF饲养条件下后期产蛋母鸡的细菌定植动态、免疫应答和盲肠微生物组结构。HS损害生产性能，而APEC O78感染在老年产蛋母鸡中引起亚临床感染，无 overt临床症状或可测量生产效应。HS选择性增强早期肺部APEC定植，而胃肠道定植和全身播散保持不变。HS和APEC感染引发不同的黏膜免疫应答轨迹，HS并非简单抑制黏膜免疫而是重编程免疫组成，特征为减少早期适应性T细胞活化并持续非常规先天淋巴样活性。联合HS和APEC感染协同放大脾脏促炎和应激应答。HS和APEC感染协同改变盲肠微生物多样性 and群落稳定性，HS似乎是比APEC单独感染更强的微生物失调驱动因素。核心微生物组成员保持稳定而分类群丰度经历渐进性、应激源依赖性失调梯度。研究结论为：HS和APEC O78感染单独及联合差异性地改变了CF环境中老年产蛋母鸡的细菌定植动态、黏膜和全身免疫应答及盲肠微生物组组成和预测功能能力；HS持续降低产蛋率和蛋重，而APEC感染未在HS效应之外进一步恶化这些参数；APEC无论热环境如何迅速且持续定植于胃肠道和呼吸道，而HS独特加剧早期肺部定植；联合HS和APEC感染产生比任一单独应激更大的脾脏促炎应答，同时HS重塑黏膜IEL组成；HS似乎是盲肠微生物组失调比APEC单独感染更强的驱动因素；预测功能通路分析揭示处理特异性微生物代谢能力变化；这些发现强调了商业产蛋母鸡生产中综合热管理和感染控制策略的重要性。研究局限性包括微生物组分析限于单一肠道位点和时间点、使用PICRUSt2推断而非直接测量的功能通路活性、以及发现具有年龄和品种特异性可能限制对年轻鸡或其他商业蛋鸡品种的推广。