《Entomologia Experimentalis et Applicata》：Physiological and Biochemical Responses Associated With Resistance to Bemisia tabaci MEAM1 Herbivory in Soybean Cultivars Adapted to Tropical Regions
烟粉虱（Bemisia tabaci MEAM1）侵染是热带地区大豆生产的主要限制因素，但品种依赖性抗性背后的生理与生化机制仍知之甚少。本研究评价了热带适应型大豆（Glycine max (L.) Merr.）品种的抗生性抗性，并评估了Bemisia tabaci（Gennadius, 1889）Middle East–Asia Minor 1（MEAM1）取食对光合作用和抗氧化酶活性的影响。在相同实验条件下评价了四个大豆品种。选择品种Olimpo和Latitude作为代表性热带适应基因型，通过产卵和抗生性试验进行评价，分析无选择条件下的产卵及随后的若虫发育，同时纳入两个对烟粉虱侵染具有对比响应的品种M8808和B?nus用于比较目的。在生物测定结束时，评估了所有品种与气体交换相关的生理参数和抗氧化酶（SOD、CAT、APX和GPOD）活性。在评价的基因型中，M8808表现出最强的抗性响应，其特征为无选择条件下产卵量减少和若虫发育严重受阻，符合产卵减少与抗生性共同作用。该品种还表现出本研究中最高的过氧化氢浓度；然而，在未侵染植株中同样升高，表明其为组成型高水平库而非侵染诱导的氧化爆发。Latitude在取食下表现出显著的生化和光合变化，光合速率随时间逐渐降低。Olimpo在侵染下也表现出气体交换的显著变化，但其四种抗氧化酶均无显著变化。B?nus品种激活了抗氧化防御响应，尤其是过氧化氢酶活性；然而该响应似乎不足，因为植株仍保持感虫状态并支持本研究中最高的昆虫表现，尽管其气体交换参数未受侵染显著改变。总体而言，结果表明对B. tabaci MEAM1的抗性存在明显的品种依赖性差异，M8808兼具产卵减少、若虫发育阻断和独特的组成型生化特征。过氧化氢浓度和抗氧化酶活性被报道为所评价四个品种内与抗性表型相关的响应。由于本研究并非为检验因果关系而设计，且各品种间取食虫量未标准化，这些关联需要在更广泛的基因型面板中验证后才能用作抗性指标。
研究背景方面，烟粉虱Bemisia tabaci（Gennadius, 1889）（Hemiptera: Aleyrodidae）Middle East–Asia Minor 1（MEAM1）是入侵性最强且破坏性最大的农业害虫之一，在全球范围内对多种作物造成严重损害。在巴西，B. tabaci MEAM1直接影响大豆（Glycine max (L.) Merrill）生产，该作物约占该国农产品出口的50%。每片三出复叶上仅一头烟粉虱即可使大豆产量每公顷减少高达31.24 kg。近十年来，该害虫的防控日益困难，巴西大豆种植区频繁暴发。季节性热带地区如巴西Cerrado为昆虫侵染和扩散提供了有利环境条件，因此必须采用综合害虫管理（Integrated Pest Management, IPM）策略以减轻其影响。在农业边疆扩张区，大豆单作集约化导致B. tabaci暴发更加频繁，增加了对化学杀虫剂的依赖，凸显了对可持续替代方案如抗性品种的需求。B. tabaci MEAM1造成的损害可为直接或间接。直接损害发生于昆虫取食韧皮部时，降低植株活力并损害生长和发育。间接损害源于蜜露排泄，促进煤污病菌（Capnodium sp.）等真菌生长，降低叶片光合能力。此外，B. tabaci作为植物病原病毒的媒介影响大豆，包括Cowpea mild mottle virus（CPMMV）、Soybean crinkle mosaic virus（SCMV）和Soybean dwarf virus（SbDV），导致矮化、叶片畸形和产量损失。植物对植食者的抗性可分为三大类：抗生性（antibiosis）、排趋性（antixenosis）和耐受性（tolerance）。排趋性降低植物对昆虫的吸引力，阻止定殖、产卵和取食。抗生性直接干扰植食者的发育和繁殖，降低卵活力和若虫存活。耐受性使植物能够承受害虫攻击而无显著产量损失。除机械和化学相互作用外，抗性植物常 employ生化机制如氧化爆发，其特征为活性氧（reactive oxygen species, ROS）产生增加，作为防御信号并可能对植食者表现产生负面影响。这些响应不仅可能影响植食者发育，还可能影响植物关键生理过程包括光合效率和抗氧化稳态，将抗性机制与胁迫下的植物整体表现联系起来。B. tabaci种群抗性的进化降低了化学杀虫剂的有效性，使该方法日益低效且对环境有害。在此背景下，抗性品种的开发和部署成为烟粉虱侵染长期管理的 promising且可持续的策略。本研究中，大豆品种Olimpo和Latitude因其对热带环境的适应性和在巴西生产系统中的农艺重要性被选为重点基因型。为将其响应置于更广泛的抗性框架中，纳入了两个具有对比感虫性特征的品种M8808和B?nus用于比较目的。本研究旨在检验以下假设：(i) 适应热带地区的大豆品种通过抗生性对B. tabaci MEAM1表现出差异化抗性；(ii) 生化防御响应，即侵染诱导的氧化爆发和抗氧化酶（SOD、CAT、APX和GPOD）的激活，与昆虫表现降低相关。如下文所述，第二个假设未获支持：过氧化氢浓度未对侵染作出响应，且抗氧化诱导在昆虫表现最好的品种中最强。因此，本研究旨在调查大豆品种Olimpo和Latitude中与抗性相关的产卵和抗生性响应，以M8808和B?nus作为比较参照，并评估侵染对光合参数和抗氧化酶活性的影响，有助于鉴定在热带农业生态系统中具有更大可持续B. tabaci管理潜力的品种。
研究人员开展了以下研究：在温室受控条件下（30°C ± 2.0°C，相对湿度50%–60%）于Federal University of Piauí, Professor Cinobelina Elvas Campus进行生物测定，采用完全随机设计。B. tabaci MEAM1种群 originally from untreated kale（Brassica oleracea L. var. acephala），经分子分析确认生物型。大豆品种Brasmax Olimpo IPRO和Latitude Adapta LT8402 IPRO因热带适应性被选为焦点基因型；M8808 IPRO（已报道具有排趋性和抗生性）和Brasmax B?nus IPRO（已报道高度吸引成虫）作为比较参照。产卵和抗生性生物测定中，每品种6株独立植株（V3–V4期），每株释放200头未性别成虫于两个"voil"笼中，24 h后移除成虫并计数卵量，标准化保留50卵/笼（100卵/株），每日观测至成虫羽化，记录孵化率、若虫存活率、羽化率及发育历期。生理参数测定中，每品种3株侵染植株和3株未侵染对照，于侵染后1、15和20天使用红外气体分析仪（IRGA）测定光合速率（A）、蒸腾速率（E）、气孔导度（gs）和胞间CO2浓度（Ci），并计算水分利用效率（WUE、iWUE）和羧化效率（A/Ci）。生化测定于侵染后20天取样，测定过氧化氢（H2O2）浓度及超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）和愈创木酚过氧化物酶（GPOD）活性。统计分析采用广义线性模型、线性混合效应模型、双因素方差分析和主成分分析（PCA）。研究结论表明：适应热带地区的大豆品种对B. tabaci MEAM1的抗性及对取食的生理生化响应存在差异。Olimpo和Latitude在侵染下气体交换发生显著变化，而B?nus在任何评价时间点均无任何气体交换变量的侵染与未侵染对比达到显著；抗氧化酶在Latitude和B?nus中被诱导，而在Olimpo中未被诱导。这些响应均未伴随昆虫表现降低。在评价的基因型中，M8808一致表现出最强的抗性相关响应，特征为无选择条件下产卵减少、卵和若虫死亡率高以及成虫完全未羽化。该品种还表现出组成型较高的过氧化氢浓度和最高的组成型超氧化物歧化酶活性，以及取食下有限的酶诱导。由于品种间取食虫量未标准化且未进行操控实验，这些生化性状被报道为与抗性表型相关的响应而非已证实的抗性原因。总体而言，研究结果表明热带大豆品种对B. tabaci MEAM1的抗性涉及产卵减少、若虫发育受阻和品种特异性生理生化特征的联合表达。过氧化氢浓度和抗氧化酶活性在所评价的四个品种内与抗性表型相关，但其作为通用抗性指标的使用需要在更广泛的基因型面板中、在标准化取食压力和田间条件下进行验证。
关键技术方法方面（不超过250字）：研究采用温室完全随机设计生物测定，以每株植物为实验单元。产卵和抗生性试验在V3–V4期植株上释放200头未性别B. tabaci MEAM1成虫，24 h后计数卵量并标准化为100卵/株队列，每日观测至成虫羽化。生理参数使用便携式红外气体分析仪（IRGA, GFS-3000）于侵染后1、15和20天测定气体交换变量，同一植株重复测量。生化测定于侵染后20天取 youngest fully expanded trifoliate leaf，采用分光光度法测定H2O2浓度及SOD、CAT、APX、GPOD活性，酶活性以总可溶性蛋白为基础表示。统计分析使用R 4.3.3，包括负二项广义线性模型、准二项广义线性模型、线性混合效应模型（REML）、双因素方差分析和主成分分析（PCA）。样本队列来源为Federal University of Piauí, Professor Cinobelina Elvas Campus温室，B. tabaci MEAM1种群 originally from untreated kale，经Embrapa Arroz e Feij?o分子确认。
研究结果方面：
3.1 产卵和抗生性生物测定：负二项模型显示大豆品种对B. tabaci MEAM1产卵有显著影响（likelihood-ratio chi-square = 16.84, df = 3, p = 0.0008）。M8808估计平均每株卵量最低（649；95% CI 496–850），较Olimpo（1311；95% CI 1002–1716）减少约50%，较B?nus（1201；95% CI 918–1572）减少46%。Latitude呈中间响应（815；95% CI 623–1067），与M8808无统计学差异。在标准化队列上，各品种在未成熟存活各组分上均存在差异。M8808卵孵化率（80.2%）显著低于Olimpo（98.3%）、B?nus（98.2%）和Latitude（97.7%）（quasi-binomial GLM, F(3, 20) = 20.53, p < 0.0001）。若虫至成虫存活率差异更为明显（F(3, 20) = 96.49, p < 0.0001）：Olimpo、Latitude和B?nus中86.4%–92.0%的孵化若虫完成发育且三者间无差异（Holm-adjusted pairwise contrasts, all p ≥ 0.79），而M8808六株植物上孵化的481头若虫无一到达成虫期。总体卵至成虫存活率在Olimpo为88.3%、B?nus为90.3%、Latitude为84.3%，M8808为0%（F(3, 20) = 110.35, p < 0.0001）。发育历期仅在三个有成虫羽化的品种间比较，品种显著影响卵至成虫历期（F(2, 15) = 5.78, p = 0.0138），Latitude最长（21.50 ± 0.20天），较B?nus（20.54 ± 0.28天）和Olimpo（20.67 ± 0.15天）长约4%。卵至若虫历期在四品种间差异显著（F(3, 20) = 9.01, p = 0.0006），Latitude最长（7.83 ± 0.10天），M8808最短（7.18 ± 0.07天）。
3.2 取食下大豆生理参数：线性混合效应模型揭示侵染条件对所有七个变量有显著主效应，评价时间对六个变量显著（羧化效率除外，F(2, 32) = 2.65, p = 0.0860），品种对五个变量显著（气孔导度和蒸腾速率不显著）。四个变量显示显著的品种×侵染×评价时间三因素交互（气孔导度 F(6, 32) = 2.61, p = 0.0359；蒸腾速率 F(6, 32) = 3.18, p = 0.0145；羧化效率 F(6, 32) = 3.15, p = 0.0153；瞬时水分利用效率 F(6, 32) = 3.36, p = 0.0110）。光合速率（A）受品种（F(3, 16) = 10.63, p = 0.0004）、侵染条件（F(1, 16) = 12.01, p = 0.0032）和评价时间（F(2, 32) = 89.90, p < 0.0001）显著影响，并显示显著的品种×侵染交互（F(3, 16) = 7.37, p = 0.0026）和侵染×时间交互（F(2, 32) = 6.97, p = 0.0031）。B?nus和Olimpo维持较高A值，Latitude和M8808在各评价期表现较低值。胞间CO2浓度（Ci）受品种（F(3, 16) = 4.29, p = 0.0212）、侵染条件（F(1, 16) = 15.59, p = 0.0011）和侵染×时间交互（F(2, 32) = 3.33, p = 0.0486）影响，在侵染Olimpo和Latitude植株中于15和20 DAI下降。气孔导度（gs）和蒸腾速率（E）亦受侵染降低（gs: F(1, 16) = 11.33, p = 0.0039; E: F(1, 16) = 12.95, p = 0.0024），具显著品种×侵染交互（gs: F(3, 16) = 7.94, p = 0.0018; E: F(3, 16) = 5.57, p = 0.0082），Latitude和Olimpo降低更明显。M8808在20 DAI时侵染与未侵染植株间光合参数变异有限。瞬时羧化效率（A/Ci）显示显著品种×侵染交互（F(3, 16) = 4.47, p = 0.0183），侵染Olimpo植株A/Ci高于未侵染对照。平均而言，侵染植株瞬时和内在水分利用效率较高（WUE: F(1, 16) = 44.67, p < 0.0001; iWUE: F(1, 16) = 21.64, p = 0.0003），但显著品种×侵染交互（WUE: F(3, 16) = 6.04, p = 0.0060; iWUE: F(3, 16) = 5.58, p = 0.0081）及WUE三因素交互（F(6, 32) = 3.36, p = 0.0110）表明该响应在品种或时间间不一致。M8808效率指数在侵染条件下相对稳定，B?nus和Latitude呈中度变异。
3.3 取食下大豆过氧化氢浓度和抗氧化酶活性：H2O2浓度品种间差异显著（F(3, 16) = 53.77, p < 0.0001），但不受侵染条件影响（F(1, 16) = 0.02, p = 0.885），无品种×侵染交互（F(3, 16) = 1.54, p = 0.243）。M8808在两种条件下均表现出所有品种中最高的H2O2浓度（侵染619.8 ± 26.6、未侵染632.8 ± 38.1 nmol g?1 fresh mass），约为Olimpo、Latitude和B?nus（232–410 nmol g?1 fresh mass）的两倍。四种抗氧化酶均检测到显著品种×侵染交互：SOD（log-transformed; F(3, 16) = 11.15, p = 0.0003）、CAT（F(3, 16) = 8.62, p = 0.0012）、APX（log-transformed; F(3, 16) = 35.04, p < 0.0001）和GPOD（F(3, 16) = 3.46, p = 0.0415）。分解交互为各品种内侵染简单效应显示对比模式：Latitude是唯一四种酶在侵染下均显著增加的品种（SOD, p = 0.0003; CAT, p = 0.0002; APX, p < 0.0001; GPOD, p = 0.0006）。B?nus显示SOD（p = 0.042）、CAT（p = 0.0001）和APX（p = 0.0004）显著增加，GPOD无显著变化。Olimpo四种酶均无显著变化。M8808表现出最高的组成型SOD活性（未侵染植株102.4 ± 12.1 AU mg?1 protein），是唯一在侵染下酶活性显著降低的品种（SOD从102.4降至62.5 AU mg?1 protein, p = 0.042），CAT、APX和GPOD无显著变化。因此，取食下酶诱导在Latitude和B?nus中最强，在M8808中基本缺失。
3.4 生理和生化参数的主成分分析（PCA）：基于气体交换性状的PCA前两个组分解释总变异的91.6%。第一组分（67.2%）对比气体交换幅度（Ci、gs、E）与效率指数（A/Ci、WUE、iWUE），第二组分（24.4%）主要由光合速率和羧化效率主导。四品种凸包广泛重叠，表明品种在生理排序中未清晰分离。沿第一组分的主要离散对应20 DAI侵染植株，占据高水分利用效率和低胞间CO2浓度区域。生化参数PCA前两个组分解释总变异的74.4%。第一组分（45.4%）对比H2O2浓度和SOD活性与GPOD、APX和CAT活性，第二组分（28.9%）主要与SOD、APX和H2O2相关。M8808沿第一组分在两种条件下均与其他三品种清晰分离，而Olimpo、Latitude和B?nus重叠；侵染Latitude植株占据第一组分相反极端，朝向GPOD和APX方向。这些分组为描述性，鉴于每组合三个生物学重复，应解释为探索性模式而非统计学支持的聚类。
讨论部分总结：产卵和抗生性试验揭示大豆品种与B. tabaci MEAM1相互作用的明显对比。M8808在24 h暴露期产卵量最低且对未成熟发育有强烈负面影响。无选择条件下产卵减少表明品种间暴露后产卵响应的差异，但不应解释为排趋性证据。M8808对未成熟发育的显著效应进一步表明其抗性表型与昆虫表现降低相关。卵和若虫死亡率升高以及成虫完全未羽化表明该品种对昆虫生活史有严重限制，与抗生性一致。解释产卵试验差异时需注意两个特征：24 h暴露期间成虫存活未记录，产卵雌虫数可能因品种而异；笼内叶面积未标准化，卵数差异部分可能反映产卵表面差异。B?nus和Olimpo支持较高产卵和未成熟发育，强化其感虫性。Latitude呈中间响应，特征为发育历期略有延长但成虫到达概率无显著降低，提示部分抗生性而非完全发育阻断。本研究未评价耐受性，因未测定植物生物量、适合度和产量且植食者压力未在各品种间均等化，故不能从这些数据推断耐受性。总体而言，这些结果强调品种特异性性状如何调节烟粉虱种群动态，并强调抗性应沿梯度而非二元性状解释。烟粉虱取食以品种依赖方式改变光合表现。Olimpo中侵染降低气孔导度和胞间CO2浓度，该组合表明光合作用以气孔限制为主，与侵染Olimpo植株中观察到较高羧化效率一致，也与先前B. tabaci取食损害叶片气体交换的证据一致。Latitude显示气孔导度和蒸腾的中度调节，提示气体交换的补偿性调整，但光合活性在侵染下仍下降，尤其在后期评价时当代谢资源日益分配给生殖过程。B?nus维持相对稳定的气体交换参数；然而该生理稳定性未转化为昆虫表现降低，表明光合性状单独不足以预测抗性，生理稳定性不应等同于抗性。M8808在侵染下光合参数波动也相对较小。然而该比较须谨慎解释。由于用于生理和生化测定的植株取自抗性生物测定，且M8808不支持发育至成虫期并表现出最高的未成熟死亡率，该品种在20天期间经历的累积取食压力必然低于感虫品种。M8808表观生理稳定性可能部分反映较低的有效植食者负载而非内在更强的缓冲胁迫能力，同样的告诫适用于H2O2浓度和抗氧化酶活性的品种间比较，这些变量在youngest fully expanded leaf而非笼内叶片中测定，因此描述的是系统性响应。相反，B?nus承受本研究最高的昆虫表现，然而该品种任何气体交换变量在任何评价时间点的侵染与未侵染对比均未达显著，因此该品种的感虫性表现在昆虫表现而非可测量的生理损害。生化响应进一步区分品种，但方向与最初预期不符。M8808表现出所有品种中最高的H2O2浓度，但未侵染植株中同样高且不随取食增加，表明组成型升高的H2O2库而非侵染诱导的氧化爆发。组成型活性氧积累在其他植物-植食者系统中也被提出作为预形成防御的组分。由于侵染和未侵染植株在单一采样时间比较且未进行H2O2产生操控，本设计无法确定该升高H2O2库是否因果性贡献于B. tabaci MEAM1在该品种上的差表现或仅为相关性状。酶响应模式强化该解释。将品种×侵染交互分解为简单效应显示Latitude是唯一四种酶均被取食显著诱导的品种，B?nus诱导四种中的三种，Olimpo无显著诱导，M8808唯一显著酶变化为SOD活性从已高组成型水平下降。因此酶诱导在支持最高昆虫表现的两个品种中最强，在无成虫羽化的品种中基本缺失。在本数据集中，更大的抗氧化诱导与更大而非更小的昆虫表现相关，抗氧化活性增加不应自动解释为更有效防御响应的证据。Harish, Ravinder, and Kumar (2023)报道较抗大豆基因型中更强且更协调的抗氧化响应；与本研究结果的差异可能反映基因型、采样时间或有效侵染水平差异，表明抗氧化诱导与抗性间关系在不同研究中不一致。两种排序表现不同。生理PCA中四品种广泛重叠，气体交换性状单独不能区分品种；主要梯度对应20 DAI侵染植株，向较高水分利用效率和较低胞间CO2浓度偏移。相反，生化PCA中M8808沿对比H2O2浓度和SOD活性与过氧化物酶和过氧化氢酶的组分与其他三品种清晰分离，该分离在未侵染和侵染植株中均存在，与组成型而非诱导型差异一致。由于PCA为描述性排序方法且此处应用于少量生物学重复，这些模式描述测量变量与品种间的关联，不证明任何变量导致抗性。除氧化和酶防御外，异黄酮类和酚类化合物等次生代谢物已反复与大豆抗植食者相关。虽本研究未评估这些化合物，将其纳入未来代谢组学分析将提供对抗性表达的更全面理解并帮助阐明生化和代谢途径如何与生理响应互作。综上所述，研究结果表明大豆对B. tabaci MEAM1的抗性通过无选择条件下产卵减少、未成熟发育受损和品种特异性生理生化特征的组合表达。所检验的四品种中，M8808一致表现出最强的抗性相关响应，而Latitude的中间响应和Olimpo与B?nus的感虫性强调热带适应大豆中抗性策略的连续性。H2O2浓度和抗氧化酶活性在品种间存在差异并在当前实验条件下与抗性表型相关。然而仅评价四个品种（其中一个已报道为抗性），未标准化植食者负载且未操控H2O2产生或抗氧化途径，这些变量不能视为已验证的抗性指标，其在不同大豆基因型中的预测价值仍未经检验。从应用角度，昆虫生物测定、生理测量和生化谱分析的整合为鉴定抗性相关性状提供了稳健框架。未来研究应优先进行田间验证并纳入代谢组学和遗传学方法以加强这些性状在育种计划和综合害虫管理策略中的应用。
