免疫健全型器官芯片（OoC）方法用于1型糖尿病（T1D）研究：从血管化胰腺芯片（PoC）到情境化验证

《Diabetic Medicine》：Immune-competent organ-on-chip methodologies to study type 1 diabetes

　　

目的：1型糖尿病（T1D）是一种自身驱动性自身免疫疾病，可导致胰腺中产生胰岛素的β细胞死亡。β细胞反应性免疫细胞外渗进入胰岛内空间，由包含免疫、血管和内分泌功能障碍的炎症循环所驱动。由于临床胰腺活检属禁忌，T1D研究依赖静态体外培养或体内模型，二者或无法完全重现三类不同组织间的动态相互作用，或与人类疾病过程差异甚大。方法：生物工程学的近期进展促成了器官芯片（OoC）平台的出现，其旨在重现人类糖尿病胰腺环境。早期与T1D相关的基于OoC的研究聚焦于评估胰岛活力。本综述将注意力转向血管化且免疫健全的胰腺芯片（PoC）模型这一新前沿，此类模型有望用于研究T1D的胰岛炎（insulitis）并预测对新型疗法的治疗反应。结果：PoC模型可整合为肿瘤及非糖尿病炎症应用所开发的技术，以指导芯片设计、血管化、免疫灌注及胰腺组分整合。已建立的PoC模型随后可依据预先设定的使用情境（CoU），对免疫、血管和胰腺组分进行详细的定量与定性分析及功能关联。结论：制造的便捷性，结合未来实现完全人类自体PoC的可能性，或可实现针对T1D组织的高通量筛选，以揭示患者异质性的潜在原因，进而为个体化治疗策略、延长细胞疗法存活时间及新型预防措施提供依据。

1 为何需要新的方法学（NAMs）研究1型糖尿病（T1D）

T1D是以胰岛β细胞破坏为特征的自身免疫疾病，始于外周免疫耐受机制失效，产生胰岛反应性效应淋巴细胞。其根本原因尚未完全阐明，但普遍认为由环境因素破坏正常胰岛生理、叠加免疫系统遗传背景（如特定人类白细胞抗原HLA单倍型）所引发。环境扰动可包括病毒感染或微生物组改变。针对病原体的免疫反应造成炎症环境，首先影响胰岛毛细血管；后者位于免疫与内分泌组织交汇处，兼具物理性（控制胰岛内空间与血流间免疫转运）与化学性（调控抗原提呈与促炎细胞因子产生）双重调节功能。胰岛毛细血管已被证明直接参与青少年T1D侵袭性胰岛炎的发生。炎症经毛细血管抵达胰岛内空间，引起β细胞应激，进而导致胰岛自身抗原可变剪接。由此形成恶性循环：被胰岛新抗原激活的循环免疫细胞经胰腺毛细血管外渗杀伤β细胞，导致循环胰岛自身抗原增多并进一步激活免疫。T1D发病机制难以完全阐明的主要原因在于难以直接检查自身免疫过程：胰腺不宜活检、β细胞量与功能无法直接成像、自身免疫触发事件不明、早期致敏发生于难以触及的淋巴组织、循环胰岛特异性T细胞难以捕获并免疫表型分析；动物模型无法重现人类免疫与遗传复杂性及异质性，标准体外培养亦无法完全重现免疫、血管与内分泌组分间的动态相互作用。在T1D免疫治疗快速发展的时代，亟需能预测新型治疗反应的人胰腺病理生理学改进型新方法学（NAMs）。OoC平台由生物相容材料制成的微腔室构成，可共培养多种组织类型并施加流体流动。专门用于T1D研究的OoC即胰腺芯片（PoC），可通过将胰腺内分泌构建体与可灌注免疫细胞的血管系统在微流控芯片上共培养来实现。Bender等的概念验证研究确立了PoC的可行性，读出指标包括葡萄糖刺激胰岛素分泌（GSIS）及胰岛周围同种异体T细胞聚集的定量。该模型是目前唯一已发表的、包含血管、免疫与胰腺三类组织的PoC。由于T1D环境的复杂性，PoC可扩展性与可重复性的数据十分有限；三类组织在疾病各阶段相互影响，因此PoC的建立同样复杂，芯片设计中各组织类型的决策需并行而非按层级顺序考虑。

2 T1D芯片生物工程与微流控考量

主流T1D芯片设计为中央通道容纳内分泌与血管组织、两侧通道用于营养输送，材料多为聚二甲基硅氧烷（PDMS）。PDMS便于软光刻快速原型制作、光学透明性高利于高分辨成像、气体通透性高利于有氧培养；但该材料可吸收并浸出疏水分子，影响细胞因子或治疗分子的药代动力学。因此，随着PoC从优化走向治疗靶点测试的常规应用，建议采用热塑性材料，如聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）或环烯烃共聚物（COC）；虽制造成本更高，但利于在供体异质性普遍存在时实现统计学意义的规模化。通道几何与灌注方式在各研究组间差异很大，二者均显著影响免疫细胞与营养输送的动力学。例如，同一芯片内葡萄糖与氧分布不均可致GSIS的区域差异。免疫与血管细胞还受流体流经侧通道所产生的物理力作用，以模拟胰岛毛细血管血流。内源性胰腺毛细血管中最具影响的物理力为壁剪切应力；T1D中血糖波动可致血液密度变化，产生振荡剪切应力（OSS），后者通过上调胰腺内皮细胞（PEC）的细胞黏附分子（CAMs）、TNFα、IL-1β与IL-6支持T1D炎症环境并增加免疫外渗。因此，复制或至少估算剪切应力对准确建模T1D环境至关重要。人胰腺中壁剪切应力与流速极难测量，唯有PoC技术提供了模拟这一关键人类生理要素的可能。现有T1D芯片采用多种灌注模式：被动扩散、基于液柱高度差（如移液器吸头）的静水压梯度，或压力控制的连续流。被动扩散与静水压梯度均无法产生足够力以复制内源性胰岛毛细血管流；在压力控制器（如注射器、蠕动泵或压电泵）施加单向连续流的芯片模型中，壁剪切应力可经数学估算并调整以模拟糖尿病毛细血管的OSS。剪切应力值取决于血液黏度，正常血糖时约为0.0035 Pa·s，在慢性高血糖或低血糖个体中可能不同。此类估算为受控（泵驱动）灌注比标准体外培养甚至静态（重力驱动）芯片灌注更具生理相关性提供了循证依据。需注意，因血管形态所致阻力差异，施加压力并非在每块芯片上转化为相同流速；因此压力控制器灌注装置的另一优势是可配备流量传感器，使所有芯片获得相同流速。较经济的流速估算方案可基于OoC腔室尺寸或平均血管尺寸计算。

3 血管系统的建立

人胰腺内分泌组分约占器官重量的2%，却接受多达20%的血供。该广泛血管结构高度特化，利于葡萄糖输送与胰岛素转运，其窗孔频率为1.3/μm，而外分泌毛细血管为0.13/μm。人胰岛血管与小鼠显著不同，为利用PoC而非动物模型改进对T1D环境的认识提供了机会：人胰岛毛细血管网络较啮齿类更稀疏、血管更细，且被双层基底膜（BM）包绕，即血管BM与胰岛周围BM，而小鼠为单层BM。人双层BM允许血管与内分泌组织间交互，如β细胞分泌的血管内皮生长因子（VEGF）支持血管生成，而PEC表达Pax6与Pdx1支持早期内分泌发育。T1D芯片中BM的作用由水凝胶与基质支持细胞（SCs）共同承担：水凝胶提供血管与内分泌组分间的物理支撑与接触，SCs分泌促血管生成生长因子。天然水凝胶如胶原或纤维蛋白接近天然胰岛细胞外基质（ECM），但非惰性且易降解；纤维蛋白因与细胞表面受体相互作用加速内皮细胞（EC）血管生成而最为常用。合成水凝胶如聚乙二醇（PEG）不易降解且可功能化。水凝胶类型的选择取决于PoC的使用情境（CoU）：重现生理性T1D环境更宜用天然凝胶，而基于合成凝胶的PoC在设计化合物细胞毒性测试时结果更清晰。由于芯片内水凝胶并非被动支架而主动参与工程化组织功能，在用于预测模型的芯片验证过程中必须对其充分表征。间充质干细胞（MSCs）因可分化为成纤维细胞与周细胞而最常用于T1D芯片血管化，但其多向分化潜能与免疫调节能力导致血管形态多变。成纤维细胞（如正常人肺成纤维细胞NHLFs）是更稳健可重复的选择；另一途径是以周细胞作为SCs。人与啮齿类胰岛毛细血管均被周细胞网络包绕，既往认为其仅被动支持，但Alma?a等近期发现人胰岛周细胞可响应β细胞与胰岛素共释放的ATP来源腺苷而主动扩张胰岛毛细血管直径：人胰岛毛细血管平均半径约6 μm，现知血糖升高可使其增加达20%。此外，周细胞变性或功能改变已被证明在T1D早期促进β细胞应激，提示其可能是T1D炎症循环的新触发因素，凸显未来PoC模型纳入周细胞的重要性。T1D芯片血管化的主要“主力”是内皮细胞（EC）。EC可响应VEGF-A或成纤维细胞生长因子（FGF）等促血管生成因子自组装为中空通道；芯片上血管生成可由向EC培养物直接接种生长因子启动，但最常用SCs启动受控EC血管生成并通过ECM分泌稳定新生毛细血管。多数研究组采用5:1的EC:SC比例，因可重复形成通畅血管。由于毛细血管长度与直径与接种细胞总数成反比并取决于中央通道几何，需针对每款芯片设计单独优化总细胞密度。T1D芯片设计最常用的EC为人脐静脉内皮细胞（HUVEC），因其血管生成能力强、维护成本低且可用表达荧光蛋白的HUVEC实现活体血管可视化。使用人胰腺内皮细胞（hPECs）的芯片尚未发表，原因在于其可得性极为有限及领域内用原代器官型EC建立可灌注血管的困难。可靠的自体内皮细胞来源优化仍在进行：MSCs与人诱导多能干细胞（hiPSCs）虽可分化为EC，但过程复杂且内皮谱系可随传代丢失；从健康供者分离的血源性生长内皮细胞（BOECs）近期已用于在微流控芯片平台重建可灌注血管，且健康供者与T1D供者的BOECs在培养中保留明显差异。尽管BOEC来源血管与HUVEC血管的转录组相似性尚待确定，BOEC芯片表现出成熟内皮细胞的血管形态与黏附标志物表达，提示该细胞类型在未来构建完全人自体PoC中的潜力。

4 免疫灌注

T1D可描述为由免疫细胞在胰岛内空间与胰岛毛细血管间循环所驱动的胰岛炎症循环。简言之，在胰腺淋巴结针对胰岛抗原致敏的未成熟T细胞，由胰岛毛细血管中的抗原提呈细胞（APCs）提呈胰岛抗原；这些活化的胰岛反应性T细胞上调趋化因子受体（如CXCR3）以增强向胰岛归巢，并上调黏附因子以更有效经胰腺毛细血管内皮外渗至β细胞。外渗过程分为不同步骤，以特定T细胞表面因子的上调为特征：选择素介导的与血管内皮黏附、沿趋化因子浓度梯度滚动、因整合素与内皮CAM结合而在穿血管部位停滞。进入胰岛内空间后，CD8⁺ T淋巴细胞通过Fas介导途径与穿孔素释放诱导β细胞凋亡；CD4⁺ T细胞间接促成β细胞死亡：Th1与Th17细胞分泌促炎细胞因子促使APC由耐受型转为免疫原型，而CD4⁺调节性T（Treg）细胞功能下降，使针对胰岛的细胞毒性不受抑制。β细胞死亡后，碎片被胰岛驻留APC吞噬并加工为新抗原，用于激活内分泌毛细血管中循环的未成熟T细胞。稳态下APC通过清除识别自身抗原的T细胞参与外周耐受；然而循环β细胞抗原与促炎细胞因子浓度升高使APC由耐受型转为免疫原型。T1D的促炎环境具有自我驱动性，IL-1β、IL-6、IFNγ或TNFα等细胞因子由APC与T淋巴细胞共同分泌。当然，T1D并不限于细胞毒性T细胞与APC的免疫功能障碍，滤泡辅助性T细胞（Tfh）与B细胞参与T1D特异性自身抗体产生，固有免疫细胞（如巨噬细胞与自然杀伤NK细胞）参与β细胞细胞毒性；但如本综述后文所述，PoC的CoU限于胰岛即刻环境内的胰岛炎事件，而非外周自身免疫发展的早期事件。由于T淋巴细胞是β细胞的主要杀伤者，其自然成为PoC中建模T1D炎症应使用的细胞类型。然而，由于T细胞需经抗原提呈激活，问题在于采用灌注前已激活的T细胞，还是同时灌注T细胞与APC（即使用全血外周血单个核细胞PBMCs）。PBMC灌注可得到更接近生理、细胞因子环境更复杂的PoC，而仅T细胞灌注可在免疫表型变化与胰岛死亡间建立更清晰的关联。虽可进一步主张分别灌注CD4⁺与CD8⁺ T细胞以获得更高清晰度，但CD4⁺ Treg功能障碍对CD8⁺ T细胞胰岛细胞毒性失控的影响极为深远，分离两类细胞可能反而掩盖潜在的治疗效应。历史上T1D芯片多聚焦于维持尸体胰岛移植活力，围绕胰岛炎的研究开发较少，因此“免疫健全”NAMs需求很大。该主题在肿瘤OoC领域备受关注，增强免疫外渗是新型实体瘤免疫治疗的目标；该领域主要挑战之一是免疫细胞寿命，这与T1D的慢性性质高度相关。压力控制器实现的自动化连续流灌注提供了解决方案：免疫细胞可经芯片再循环以提高外渗频率，并通过IL-2刺激与反复抗原暴露维持活力。血管化芯片迄今可维持长达130天，而功能性体外T细胞培养仅可维持30至60天；该估算未考虑免疫细胞在微流控系统中承受的剪切应力，后者可能进一步缩短其寿命。在早期阶段，PoC的重点不包括需要此类寿命的长期药物毒性研究，而是构建能实现最接近生理条件的人胰腺模型以发现新的治疗干预靶点。此外需注意，T淋巴细胞外渗约持续30 min，因此在微流控芯片较小表面积内定位并表征该过程各步骤应不困难。

5 胰腺内分泌组织的整合

迄今整合入T1D芯片的胰腺内分泌组织包括人与鼠胰岛、干细胞来源构建体以及永生化产胰岛素细胞系（如INS-1E与α-TC1–6共培养或EndoC-βH5）。各方法各有优劣，胰腺组织的选择应由PoC的CoU决定。分离的尸体人胰岛保留α、β、δ、ε与胰多肽（PP）细胞的天然结构，但常混有外分泌组织，且消化过程对基底膜破坏程度不一。人胰岛大小差异显著（50–400 μm），导致微流控芯片中因大胰岛核心坏死而功能可变，因此建议分离后重新聚集；该过程可获得更均匀的胰岛大小而不显著影响结构，因人胰岛内分泌细胞类型随机分布，不同于小鼠的核心–外套结构。尽管如此，人胰岛组织仍然稀缺且难以获取。胚胎干细胞（ESC）或多能干细胞（PSC）来源胰岛的生成正日益标准化，但此类构建体开发与维持极为困难；此外，SC胰岛的代谢功能（如GSIS）常无法复制天然组织。另一胰岛素分泌组织来源是源自大鼠胰岛素瘤的INS-1细胞，或源自人胎儿胰腺芽的条件永生化EndoC-βH系，后者因具生理样GSIS功能而常受青睐。此类细胞系可在免疫细胞功能与胰岛健康间建立更清晰关联，但无法完全复制T1D环境中胰岛素分泌受β细胞与非β细胞旁分泌信号影响的情形。除组织来源外，PoC模型在维持过程中亦面临挑战：血管与内分泌组织均需非常特定的培养条件以支持血管生成并维持生理性双相GSIS分泌谱。例如，Jun等确立，为实现干细胞胰岛血管化并在芯片上保持胰岛素产生，共培养起始时血管培养基占75%、胰岛培养基占25%，并在五天内逐步增至100%胰岛培养基；这主要因内皮细胞启动血管生成需VEGF等生长因子，共培养开始时由血管培养基提供VEGF，随后随血管包绕胰岛而逐渐由胰岛来源VEGF替代。在血管自组装前，胰岛氧合依靠PDMS高气体通透性经扩散实现。将胰岛整合于悬浮于水凝胶中的血管系统内，可避免连续流剪切应力所致胰岛活力下降，同时充分供应维持生理性双相胰岛素释放所需的营养。β细胞因依赖线粒体呼吸而对缺氧高度敏感。据Shang等，天然胰岛（平均大小100 μm）的临界pO₂为14.5 mmHg；然而缺氧与高氧（>50% O₂）均可导致活性氧（ROS）产生，可能进一步驱动T1D胰岛炎症。

6 胰腺芯片的读出指标

可分析PoC各组分并结合模型的小尺寸，实现纵向、高通量的详细定性与定量评估，这在现有体外或体内平台中难以做到。定量活细胞成像可在同一实验系统内整合自组装血管、灌注免疫细胞与胰腺内分泌构建体的形态与功能。胰腺构建体的血管化可通过共聚焦图像Z轴上两组分荧光信号的共定位表征，并辅以血管–胰腺连接成功的间接读出，如功能性GSIS反应或免疫介导的胰岛死亡。血管屏障功能可通过灌注荧光分子（如葡聚糖）或事后免疫荧光染色内皮紧密连接标志物直接可视化。血管形态可在灌注前利用荧光标记内皮细胞评估，或灌注后以染料评估；直径、长度或迂曲度等特定血管指标可用ImageJ插件（如Angiotool）量化。血管内皮对免疫细胞外渗的贡献可用高速共聚焦或光片方法实时评估，并对各外渗阶段特异性黏附分子表面表达进行染色：免疫细胞黏附、爬行与穿血管迁移。活体肌动蛋白染色可将物理（如剪切应力增加）与化学（如细胞因子梯度）触发因素与细胞骨架重塑相关联，而较长期容积成像可捕捉血管重塑、胰岛退化与细胞异质性。随后需自动分割与追踪，将图像序列转化为可重复参数，如细胞速度、停滞时长、迁移方向性、血管直径、网络连通性与空间分辨的报告基因活性。PoC模型还提供了将胰腺样环境中流体流动表征为超越营养与免疫细胞输送手段的机会。剪切应力、基质刚度、血管变形与免疫–内皮直接接触可通过机械敏感通路主动影响内皮与免疫细胞信号。Piezo1尤为相关，其将膜张力转化为钙依赖性信号，可能将微流控力与内皮屏障重塑、免疫细胞激活及外渗联系起来。Piezo1依赖性活动的基因编码报告系统（如GenEPi）可实现对活细胞与组织中该活动的无创、时空分辨成像；将此类报告系统引入内皮或免疫细胞，可使PoC系统区分生化炎症与机械诱导信号，并将局部Piezo1活动与β细胞损伤相关联。内分泌组分的功能验证应超越静态细胞活力测量。GSIS仍是主要终点，并可与PoC流出液的生化检测（如促炎细胞因子ELISA）结合，以提示T细胞亚型特异性功能。T1D芯片环境中多数GSIS检测通过血管灌注向胰岛递送葡萄糖，并对芯片流出液进行离片ELISA。Bowles等显示芯片上胰岛GSIS值随芯片血管化程度而异；Bender等显示芯片上胰岛GSIS动力学与健康人胰腺相似，但不同于标准非血管化灌注检测。此外，后者PoC模型凸显了供者间变异；每芯片胰岛数量少可能放大既有的供者异质性。Granlund等估计准确建模T1D患者变异约需400个胰岛，单芯片因尺寸小而无法达到，但若建立标准化PoC模型则可累积实现。芯片内变异亦可能存在，因胰岛相对于供糖通道的位置不同；但通过对芯片上所有接种胰岛实现稳健血管化可将其最小化。芯片上胰腺构建体的功能还可通过测量耗氧率（OCR）或β细胞连通性的钙成像进一步表征。胰岛内协调的钙反应提供功能性偶联信息，这些信息可能无法仅从总胰岛素输出中显现，而连通性破坏可能先于广泛β细胞死亡或可测量的内分泌量损失。因此，PoC系统应尽可能结合分泌胰岛素测量与空间分辨钙成像，从而区分急性信号功能障碍与不可逆β细胞丢失。最后，除先进成像方案外，PoC组分可回收用于通过RNA-Seq鉴定下游信号通路；此类方法尚未用于将PoC模型与人胰腺组织进行验证。

7 使用情境：验证PoC模型需要哪些步骤

预测性模型（无论基于动物还是NAM）并非意图复现人类生理的全部复杂性，而应适合其用途。核心挑战在于确定在给定决策情境中实现所需预测力所需的最低复杂程度。对PoC而言，这意味着验证不能视为模型或通过或失败的单一、与目的无关的测试，而必须相对于特定CoU定义，即模型拟回答的精确问题及所依赖的决策。需考虑两项不同要求：其一为技术验证，即PoC作为研究模型在芯片内、芯片间及操作者间重现读出指标的可靠性；其二为PoC资格认定，即模型能预测其CoU所指定人类结局的证据。重要的是，所需严格程度不由模型的复杂程度决定，而由错误预测的后果决定：用于产生机制假说或优先筛选化合物的PoC具有自定义标准，而输出拟用于监管决策者必须经正式资格认定。PoC针对特定CoU的资格认定须通过四个维度的验证加以明确：（i）结构性，包括血管形态及其与胰岛的连接；（ii）功能性，包括血管可灌注性、GSIS、Ca²⁺动力学、OCR与细胞因子分泌；（iii）机制性，包括CAM表达、免疫外渗动力学、Piezo1依赖性活动、细胞骨架重塑与β细胞连通性；（iv）预测性，表现为对既定炎症刺激或治疗的反应与人类组织学、供者表型或临床观察一致。在每一层面，应报告生物学供者数量、独立芯片制备与技术重复，并预先设定接受标准及芯片间与供者间变异的度量。对T1D PoC而言，相关CoU对证据的要求差异很大。按负担大致递增顺序，涵盖胰岛炎的机制剖析；免疫调节生物材料与封装策略的筛选（包括其在主动免疫攻击下的耐久性）；药物疗效与药物诱导β细胞易感性评估；以及要求最高的、对teplizumab等免疫治疗应答者的分层。预测有效性最终取决于与现有人类参考数据的基准比对，如芯片上胰岛炎与供者组织学的一致性、供者特异性表型与自身抗体及遗传风险状态的一致性，以及以敏感性与特异性表达的已知临床药物反应的重现。此处须认识到，可获得的人胰岛数据稀缺本身即是PoC拟缓解的约束之一。

8 结论

T1D是涉及免疫、血管与内分泌组分间病理相互作用并导致β细胞死亡的复杂疾病。OoC模式的发展使研究人员更接近验证与制造具生理相关性的人胰腺模型，其在T1D研究中的应用有潜力处于NAM革命的中心。本文总结了若干有望促成这一目标的近期技术进步：生物工程进展使新型微流控设计的高通量测试及生理相关方式灌注成为可能；先进成像应纳入模型验证策略，而非仅视为说明性证据；得益于微流控芯片血管化，连续流灌注可向胰腺构建体输送氧、营养与免疫细胞而不直接对组织施加剪切应力。然而，芯片上胰腺内分泌样毛细血管的建立取决于诸多因素，使已发表结果难以比较，凸显透明共享方法学与严格可重复性测试的必要性。与此相关的是对长期NAM培养中β细胞功能的细致解读要求。首批用于建模与筛选可能改变T1D病理生理进程的免疫健全NAMs正按CoU进行验证，范围从预测免疫治疗对β细胞浸润的反应到筛选旨在保护替代β细胞免受免疫攻击的支架。向BOEC与干细胞来源胰岛整合的进展应能实现完全人自体平台的制造。此类模型不仅推进摆脱动物研究的目标，也为这一公认异质的T1D疾病提供个体化医学途径。最终，T1D PoC的愿景涵盖从准确绘制免疫/血管/胰腺界面图谱，到从疾病最早期即指导新型治疗策略，再到替代后维持内分泌量，并最终设计个体化免疫治疗以从起始阶段遏制疾病。