《Immunology》：Wiskott–Aldrich Syndrome Protein Is Required for Glucocorticoid-Dependent Eosinopoiesis and Eosinophil-Rich Inflammation in Murine Models
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Wiskott–Aldrich综合征蛋白（WASP）是一种在造血组织中广泛表达的多效性细胞骨架调控因子，在免疫细胞功能（包括白细胞迁移和信号传导）中发挥重要作用。相比之下，WASP在白细胞生成中的作用尚未得到充分探索。近期研究发现，小鼠嗜酸性粒细胞生成分别受糖
Wiskott–Aldrich综合征蛋白（WASP）是一种在造血组织中广泛表达的多效性细胞骨架调控因子，在免疫细胞功能（包括白细胞迁移和信号传导）中发挥重要作用。相比之下，WASP在白细胞生成中的作用尚未得到充分探索。近期研究发现，小鼠嗜酸性粒细胞生成分别受糖皮质激素（GCs）和半胱氨酰白三烯（CysLTs）两条不同信号通路的调控，这促使研究人员探究其对WASP的依赖性。为探讨WASP对嗜酸性粒细胞发育的贡献及其与体内和离体条件下GC依赖性和CysLT依赖性调控通路的关系，研究人员采用野生型（WT）和WASP缺陷小鼠建立硫代乙醇酸盐诱导的腹膜炎、过敏性哮喘和手术应激模型，以评估嗜酸性粒细胞募集和生成。研究人员使用离体培养、共培养系统和药理学干预（地塞米松、氢化可的松、吲哚美辛、白三烯受体激动剂和拮抗剂）来评估嗜酸性粒细胞分化和嗜酸性粒细胞生成微环境的调控。WASP缺陷小鼠在髓外炎症部位显示嗜酸性粒细胞积聚减少，且未能产生GC诱导的嗜酸性粒细胞生成反应。该缺陷与黏附性基质富集组分相关，因为当WASP缺陷祖细胞与WT黏附性骨髓细胞共培养时，GC反应性得以恢复。相反，CysLT驱动的嗜酸性粒细胞生成在WASP缺陷小鼠中保持完整。研究结果表明，GC介导的嗜酸性粒细胞生成诱导依赖于WASP敏感的异质性黏附性骨髓组分。相比之下，CysLT通路在WASP缺失时仍具有功能。这些结果提示，WASP通过与黏附性造血微环境相关的效应促进嗜酸性粒细胞生成，而具体负责的细胞亚群仍有待明确。
**研究背景与意义**
Wiskott–Aldrich综合征（WAS）是一种罕见的X连锁原发性免疫缺陷病，以微血小板减少症、严重免疫缺陷和湿疹为特征，由X染色体上WASP基因突变所致。WASP是Arp2/3复合物的关键调控因子，通过促进分支肌动蛋白网络形成参与细胞迁移、免疫突触形成和细胞信号传导等多种细胞功能。目前大多数研究集中于WASP在免疫细胞（如T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞）功能中的作用，而WASP在白细胞生成中的作用研究尚不充分。研究人员此前报道，体内中性粒细胞对多种炎症刺激的迁移依赖于嗜酸性粒细胞，但WASP在嗜酸性粒细胞生物学中的可能作用尚未被探索。因此，研究人员通过检测WASP缺陷小鼠中嗜酸性粒细胞的生成和功能来探讨这一问题，旨在揭示WASP在嗜酸性粒细胞生成中的作用及其与GC和CysLT依赖性调控通路的关系，为理解WAS免疫缺陷背景下造血微环境功能重塑提供新视角。
**关键技术方法**
研究人员使用BALB/c背景的雄性和雌性（6–8周龄，SPF级）野生型（WT）对照和WASP缺陷敲除突变体小鼠，共使用144只WT小鼠和130只WASP缺陷小鼠。研究采用硫代乙醇酸盐（Tiog）诱导的腹膜炎模型、鸡蛋白腹腔植入物（EWIp）无菌手术炎症模型和卵清蛋白（OVA）诱导的过敏性哮喘模型评估体内嗜酸性粒细胞募集和生成。通过离体骨髓液体培养和半固体集落形成实验、黏附性与非黏附性骨髓细胞共培养体系以及药理学干预（地塞米松、氢化可的松、吲哚美辛、LTD4、孟鲁司特、美替拉酮、二乙基carbamazine）评估嗜酸性粒细胞分化和微环境调控。采用流式细胞术检测VLA-4表达，ELISA检测血清皮质酮水平，侵入性体积描记法评估肺功能，组织学染色评估肺部炎症。
**研究结果**
**WT对照与WASP突变体的基线差异**：通过比较稳态条件下WT和WASP小鼠发现，WASP缺陷动物体重显著低于WT对照；外周血单核细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞比例相当，但中性粒细胞显著增加；骨髓总细胞数显著减少，嗜酸性粒细胞和单核细胞数量显著减少，而形态学鉴定的中性粒细胞数量不受影响；GM-CSF补充的半固体培养中WASP缺陷骨髓生成的集落显著减少，IL-5补充的液体培养中WASP培养物产生的嗜酸性粒细胞显著少于对照。
**WASP缺陷小鼠炎症刺激后白细胞募集受损**：通过Tiog诱导腹膜炎模型发现，WT小鼠腹腔嗜酸性粒细胞显著增加，而WASP小鼠未观察到该反应；两种基因型中性粒细胞流入均显著增加，但WASP小鼠增加幅度显著降低；骨髓中Tiog给药后两种基因型嗜酸性粒细胞数量相当增加，而骨髓中性粒细胞计数在两组中均降低。在EWIp模型中，WT小鼠仅在植入物存在时腹腔渗出液嗜酸性粒细胞显著增加，WASP小鼠也表现出嗜酸性粒细胞反应但水平显著较低；手术应激单独即可增加WASP小鼠骨髓嗜酸性粒细胞数量而非WT小鼠。
**WASP缺陷小鼠过敏性哮喘中骨髓嗜酸性粒细胞反应受损**：通过OVA诱导过敏性哮喘模型发现，WT小鼠骨髓嗜酸性粒细胞数量显著增加，美替拉酮预处理可消除该反应；WASP缺陷动物在OVA激发后无论是否使用美替拉酮均未能增加骨髓嗜酸性粒细胞数量。IL-5富集培养中WT小鼠过敏性激发后嗜酸性粒细胞产出增加，WASP小鼠该效应缺失；GM-CSF半固体条件下WT小鼠集落数显著增加而WASP对应组未增加。两种基因型血清皮质酮在OVA激发后均升高，美替拉酮在两种基因型中均有效抑制该反应。WASP小鼠在过敏原激发后对乙酰甲胆碱的气道力学反应正常，弹性阻力和气道阻力在WT和WASP小鼠中均类似升高。组织学评估显示WT O/O小鼠肺部炎症明显，Sirius Red染色可见大量红染细胞；WASP O/O肺组织仍显示明显炎症改变，但Sirius Red阳性嗜酸性粒细胞组分不如WT显著。
**WASP缺陷小鼠过敏性炎症中脾脏增大和嗜酸性粒细胞积聚**：通过OVA致敏和激发后发现，WASP缺陷小鼠出现脾脏增大，而WT对照脾脏大小不受影响；脾脏重量与体重比值在WASP小鼠O/S和O/O处理后均显著增加，DEC预处理完全阻止该脾脏增大。WASP缺陷动物脾脏总细胞数在所有条件下均较高，脾脏嗜酸性粒细胞数量在O/S或O/O处理后均显著高于WT对应组；GM-CSF半固体培养中WASP脾脏产生的造血集落显著多于WT脾脏。
**WASP缺陷小鼠GC诱导的嗜酸性粒细胞生成受损**：通过地塞米松（Dexa）处理发现，Dexa在WT和WASP小鼠中均诱导胸腺萎缩，证实药物全身有效性；但Dexa未能诱导WASP小鼠骨髓嗜酸性粒细胞典型扩增，而WT动物显著增加。WT骨髓细胞在体内、体外或两者联合Dexa处理后均表现强劲集落形成，而WASP缺陷培养物在所有条件下均无反应；IL-5液体培养中Dexa诱导WT培养物嗜酸性粒细胞产出剂量依赖性增加，WASP缺陷培养物在所有Dexa浓度下均无反应；氢化可的松同样未能诱导WASP缺陷骨髓嗜酸性粒细胞扩增。WT培养中Dexa处理显著增加嗜酸性粒细胞富集粒细胞群体中VLA-4+细胞比例，而WASP培养物无此反应；即使在基线条件下WASP来源培养物中VLA-4+细胞也少于WT。
**CysLT驱动的嗜酸性粒细胞生成在WASP缺陷小鼠中保持功能**：通过吲哚美辛（Indo）和LTD4处理发现，WT培养中Indo和LTD4均显著增强集落形成，CysLT受体拮抗剂孟鲁司特（MKT）完全逆转该效应；WASP缺陷培养物反应类似，Indo或LTD4处理下集落扩增强劲且被MKT抑制。液体培养中IL-5、Indo和LTD4在WT和WASP培养物中均增加嗜酸性粒细胞产出，MKT同样阻断这些效应。LTD4处理可将WASP来源粒细胞中降低的VLA-4表达恢复至WT水平。
**黏附性基质富集骨髓组分在嗜酸性粒细胞祖细胞对GC和过敏原激发调控反应中的作用**：通过骨髓细胞黏附性和非黏附性组分分离及共培养实验发现，非黏附细胞单独在IL-5存在下培养时嗜酸性粒细胞产出显著低于未分离骨髓；Dexa不影响WT非黏附细胞培养中嗜酸性粒细胞生成。自体黏附细胞重建共培养恢复嗜酸性粒细胞分化并进一步增强Dexa反应。异体共培养显示，WT祖细胞与WASP缺陷基质细胞共培养时对Dexa无反应，而WASP缺陷祖细胞与WT基质共培养时Dexa诱导的嗜酸性粒细胞扩增得以恢复，表明黏附性基质富集组分中功能性WASP的存在足以恢复WASP缺陷非黏附祖细胞培养中GC驱动的嗜酸性粒细胞扩增。WT小鼠中OVA激发降低离体Indo嗜酸性粒细胞反应，而WASP小鼠骨髓对Indo的反应不受体内暴露影响；异体共培养显示Indo嗜酸性粒细胞反应抑制仅在非黏附组分来源于既往暴露于过敏原激发的WT小鼠时观察到。
**讨论与结论**
研究人员鉴定WASP为骨髓中GC相关嗜酸性粒细胞生成的重要调控因子。在多种实验设置中，包括Dexa给药、无菌炎症EWIp模型和过敏性哮喘，WASP缺陷小鼠均显示嗜酸性粒细胞反应受损，而全身GC可用性保持完好。共培养实验表明，当WASP缺陷非黏附骨髓细胞与WT黏附细胞组合时GC反应性恢复，而WT非黏附细胞在WASP缺陷黏附细胞支持下未能反应，支持GC驱动的嗜酸性粒细胞生成依赖于异质性黏附性基质富集骨髓组分功能特性的结论。巨噬细胞是該黏附组分中生物学上合理的候选细胞群，因其造血来源、表达WASP、塑料黏附性及在造血微环境中的已知作用，但本研究未直接评估巨噬细胞身份、极化状态或介质产生，因此巨噬细胞中心模型应视为工作假说。WASP缺陷小鼠在髓外炎症部位显示嗜酸性粒细胞积聚减少，但该发现本身不能确定 underlying 机制。脾脏发现提示WASP缺陷小鼠中存在嗜酸性粒细胞分布改变和/或代偿性髓外造血活性。WASP缺陷表型的另一相关特征是基线中性粒细胞增多和慢性免疫失调迹象。尽管GC驱动的嗜酸性粒细胞生成受损，WASP缺陷小鼠对CysLT依赖性刺激保持反应性，表明WASP在此实验条件下对CysLT驱动的嗜酸性粒细胞生成反应并非必需。研究人员提出保守工作模型：WASP依赖的异质性黏附骨髓组分功能特性是全量GC驱动嗜酸性粒细胞生成所必需的，巨噬细胞和巨噬细胞样黏附细胞是合理的候选贡献者；同时CysLT依赖通路保持运作并提供GC非依赖性嗜酸性粒细胞谱系反应途径。研究局限性包括黏附性和非黏附性骨髓组分未经表型鉴定，无法确定具体负责的细胞亚群； assays无法区分嗜酸性粒细胞产出减少反映的是分化、增殖、存活改变还是嗜酸性粒细胞谱系祖细胞组成变化；炎症部位嗜酸性粒细胞积聚减少不能确定机制是否涉及迁移受损、造血组织排出缺陷、存活改变、组织滞留受损或向脾脏再分布。
研究结论翻译：研究结果表明，GC介导的嗜酸性粒细胞生成诱导依赖于WASP敏感的异质性黏附性骨髓组分；相比之下，CysLT通路在WASP缺失时仍具有功能。这些结果提示，WASP通过与黏附性造血微环境相关的效应促进嗜酸性粒细胞生成，而具体负责的细胞亚群仍有待明确。
