《Immunity, Inflammation and Disease》：Identification and Validation of Hub Genes Associated With Periodontitis and Systemic Lupus Erythematosus
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背景：越来越多的证据表明牙周炎与系统性红斑狼疮（SLE）之间存在密切关系；然而，这种关联背后的共享分子机制仍不清楚。本研究旨在通过整合生物信息学分析和临床验证，鉴定牙周炎与SLE之间共享的候选基因和分子特征。方法：从基因表达综合数据库（GEO）获取基因表达谱，
背景：越来越多的证据表明牙周炎与系统性红斑狼疮（SLE）之间存在密切关系；然而，这种关联背后的共享分子机制仍不清楚。本研究旨在通过整合生物信息学分析和临床验证，鉴定牙周炎与SLE之间共享的候选基因和分子特征。方法：从基因表达综合数据库（GEO）获取基因表达谱，鉴定牙周炎与SLE之间共享的差异表达基因（DEGs）。进行基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析，随后构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络并筛选枢纽基因。在独立验证数据集中评估枢纽基因的表达模式，并通过受试者工作特征（ROC）曲线分析评估其判别性能。进一步研究免疫细胞浸润及其与枢纽基因表达的相关性。计算预测转录因子- microRNA调控网络和候选化合物。最后，采用定量实时PCR（qPCR）在临床样本中验证枢纽基因表达。结果：共鉴定出124个重叠DEGs，从中筛选出5个枢纽基因——CCL3、LY96、FOS、MMP9和PTGS2。GO和KEGG富集分析表明，重叠DEGs主要与炎症和免疫相关的生物学过程及信号通路相关。所有5个枢纽基因在独立牙周炎验证数据集中显示一致的表达模式，而FOS、LY96和PTGS2（而非CCL3和MMP9）在独立SLE验证数据集中显示一致的差异表达。ROC分析表明在所分析的数据集中判别性能存在差异。免疫浸润分析揭示了两个疾病数据集中估计免疫细胞谱的差异，计算预测鉴定了候选调控相互作用和化合物以供进一步研究。临床样本（每组n = 15）的qPCR验证显示，与各自健康对照相比，牙周炎患者牙龈组织和SLE患者外周血单个核细胞（PBMCs）中所有5个枢纽基因的表达均显著升高。结论：本研究鉴定CCL3、LY96、FOS、MMP9和PTGS2为与牙周炎和SLE相关的候选基因。FOS、LY96和PTGS2在数据集中显示一致的表达模式，而CCL3和MMP9在SLE中表现出数据集依赖性变异。临床qPCR验证显示所有5个基因在两个疾病队列中表达均升高。这些发现为牙周炎与SLE的共享分子特征提供了见解，并值得在更大规模、独立且临床特征明确的队列中进一步验证。
研究背景：牙周炎是一种由牙齿周围微生物生物膜触发的慢性炎症性疾病，可导致牙周支持组织破坏，全球成人患病率约为20%–50%。系统性红斑狼疮（SLE）是一种严重的自身免疫性疾病，以产生自身抗体和免疫复合物为特征，可累及皮肤、关节、肾脏、中枢神经系统和造血系统等多器官。流行病学证据表明两种疾病之间存在临床关联，约70%的SLE患者患有牙周炎，且牙周炎与SLE患者更严重的疾病活动度或全身性炎症相关。然而，尽管已有生物信息学研究探讨二者之间的分子联系，但由于所用数据集和分析方法的差异，报道的枢纽基因存在较大差异，且对 proposed 共享分子特征的实验验证仍然有限。因此，研究人员采用不同的GEO数据集独立筛选共享枢纽基因，在独立数据集中评估其表达模式，并通过qPCR在临床样本中验证其表达，同时评估其判别性能、调控网络、免疫浸润模式和候选化合物，以深入探究牙周炎与SLE的共享分子和免疫特征。
主要关键技术方法：研究从GEO数据库获取GSE16134（牙周炎训练集：241例患者和69例对照）和GSE61635（SLE训练集：99例患者和30例对照），以及GSE10334（牙周炎验证集：183例患者和64例对照）和GSE121239（SLE验证集：292例患者和20例对照）。采用"limma"R包鉴定DEGs（阈值|log2(fold change)| > 0.5，校正p < 0.05），Venny 2.1确定重叠DEGs。使用"clusterProfiler"R包进行GO和KEGG富集分析。通过STRING数据库（版本12.0）构建PPI网络并导入Cytoscape（版本3.9.1），利用cytoHubba插件中Degree、DMNC、MCC和MNC四种算法筛选枢纽基因。采用"pROC"R包进行ROC曲线分析。使用NetworkAnalyst 3.0平台预测转录因子（TF）和miRNA调控网络。通过CIBERSORT算法估计22种免疫细胞亚群的相对比例。利用DSigDB数据库预测候选化合物。临床样本来源于南昌大学第一附属医院2024年11月至2026年8月期间招募的参与者，SLE队列收集30例参与者（15例SLE患者和15例健康对照）的外周血样本，牙周炎队列收集30例参与者（15例牙周炎患者和15例健康对照）的牙龈组织样本，SLE诊断基于1997年美国风湿病学会（ACR）标准，所有SLE患者在采血时均未接受治疗。采用TRIzol试剂提取总RNA，FastKing RT Kit逆转录为cDNA，Bio-Rad CFX96 Touch热循环仪进行qPCR，以GAPDH为内参基因，采用2^?ΔΔCt方法计算相对mRNA表达水平。
研究结果：
3.1 牙周炎与SLE之间重叠DEGs的鉴定：使用"limma"R包在GSE16134数据集中鉴定出1151个DEGs（689个上调，462个下调），在GSE61635数据集中鉴定出3617个DEGs（1999个上调，1618个下调）。Venn分析鉴定出牙周炎与SLE之间共享的124个DEGs，包括73个共同上调基因和51个共同下调基因。
3.2 重叠DEGs的功能富集分析：GO富集分析表明这些DEGs主要与炎症反应调控、对外部刺激反应的的正调控、免疫反应激活、白细胞趋化、白细胞迁移、白细胞趋化调控、淋巴细胞趋化正调控、趋化因子介导的信号通路等生物学过程相关。KEGG富集分析显示显著富集于脂质与动脉粥样硬化、Toll样受体信号通路、恰加斯病、百日咳、酒精性肝病、TNF信号通路、NF-κB信号通路、IL-17信号通路、类风湿关节炎等通路。这些富集结果提示重叠DEGs主要与炎症和免疫相关的生物学过程及信号通路相关。
3.3 PPI网络构建与枢纽基因鉴定：使用STRING数据库构建重叠DEGs的PPI网络，以最低相互作用评分0.4进行分析，获得包含119个节点和135条边的网络。应用cytoHubba插件中四种算法（Degree、DMNC、MCC和MNC）筛选枢纽基因，鉴定出5个候选枢纽基因：CCL3、LY96、FOS、MMP9和PTGS2。这些枢纽基因被认为可能参与牙周炎与SLE之间的分子联系。
3.4 枢纽基因的验证：5个枢纽基因（CCL3、LY96、FOS、MMP9和PTGS2）在牙周炎和SLE训练数据集中的疾病组与对照组之间表达水平均存在显著差异。在独立牙周炎验证数据集GSE10334中，所有5个枢纽基因显示与训练数据集一致的差异表达模式。在SLE验证数据集GSE121239中，FOS、LY96和PTGS2显示一致的差异表达，而CCL3和MMP9在SLE与对照样本之间无显著差异。这些发现表明5个枢纽基因中有3个在SLE数据集中得到一致验证，而CCL3和MMP9表现出数据集依赖性变异。
3.5 枢纽基因的ROC分析：在牙周炎训练数据集GSE16134中，CCL3、FOS、LY96、MMP9和PTGS2的曲线下面积（AUC）值分别为0.734、0.724、0.844、0.796和0.694。在SLE训练数据集GSE61635中，相应AUC值分别为0.696、0.993、0.969、0.721和0.840。在牙周炎验证数据集GSE10334中，AUC值分别为0.732、0.711、0.812、0.778和0.689。在SLE验证数据集GSE121239中，相应AUC值分别为0.573、0.753、0.804、0.499和0.754。FOS、LY96和PTGS2在SLE验证数据集中显示相对较高的判别性能，而CCL3和MMP9表现出有限的判别能力。总体而言，ROC分析表明所鉴定枢纽基因在各分析数据集中判别性能存在差异，其潜在临床效用需在更大规模独立队列中进一步验证。
3.6 枢纽基因的qPCR临床验证：qPCR分析（每组15例参与者）显示，与健康对照相比，牙周炎患者牙龈组织中CCL3、LY96、FOS、MMP9和PTGS2的相对mRNA表达水平显著升高。同样，与健康对照相比，SLE患者PBMCs中所有5个枢纽基因的mRNA表达均显著升高。
3.7 转录因子和miRNA调控网络：基于数据库的预测鉴定出90个TFs和102个miRNAs与5个枢纽基因潜在相关。调控网络包含197个节点和228条边。网络内CCL3、LY96、FOS、MMP9和PTGS2的连接度分别为2、95、63、8和62。总体而言，预测网络揭示了TFs、枢纽基因和miRNAs之间广泛的潜在调控关联。
3.8 免疫浸润分析：应用CIBERSORT算法估计22种免疫细胞亚群的相对比例。在GSE16134数据集中，牙周炎与对照样本之间多种免疫细胞亚群存在显著差异，包括初始B细胞、记忆B细胞、浆细胞、活化记忆CD4+ T细胞、滤泡辅助性T细胞、γδ T细胞、活化自然杀伤（NK）细胞、M0巨噬细胞、M1巨噬细胞、静息树突状细胞、活化树突状细胞、静息肥大细胞和中性粒细胞。在GSE61635数据集中，SLE与对照样本之间初始B细胞、浆细胞、CD8+ T细胞、静息记忆CD4+ T细胞、活化记忆CD4+ T细胞、单核细胞、活化树突状细胞和中性粒细胞存在显著差异。其中，初始B细胞、浆细胞、活化记忆CD4+ T细胞、活化树突状细胞和中性粒细胞的估计比例差异在两个疾病数据集中相对于各自对照组均被观察到。
3.9 免疫细胞与枢纽基因的相关性：在牙周炎数据集中，5个枢纽基因与多种免疫细胞亚群表现出不同的关联模式。同样，在SLE数据集中观察到枢纽基因表达与免疫细胞浸润之间的异质性相关模式。这些相关性的方向和幅度因单个枢纽基因和免疫细胞亚群而异。总体而言，这些发现表明牙周炎和SLE中枢纽基因表达与估计免疫细胞浸润的 distinct 模式之间存在关联。
3.10 候选化合物的预测：使用DSigDB数据库计算预测候选化合物，排名前10的预测化合物为地诺前列酮、吡咯烷二硫代氨基甲酸盐、辣椒素、苯环利定、氟比洛芬、普萘洛尔、辛伐他汀、双吲哚马来酰亚胺、DL-甲羟戊酸和倍氯米松。
讨论部分总结：研究人员讨论了牙周炎与SLE之间公认的临床关联，指出尽管已有生物信息学研究利用公共数据集探索其分子联系，但对所提出的共享分子特征的实验验证仍然有限。本研究独立筛选共享枢纽基因，在独立数据集中进一步评估其表达模式，并通过qPCR在临床样本中验证其表达。研究结果与先前报道的LY96和MMP9等相关联，同时鉴定出5个枢纽基因组合（CCL3、LY96、FOS、MMP9和PTGS2），据研究人员所知尚未被集体报道。CCL3（巨噬细胞炎性蛋白-1α，MIP-1α）是炎症反应的关键介质，与溶骨性骨病和骨吸收增加相关，在SLE患者中表达升高，其表达随牙周病严重程度增加而增加，但在独立SLE数据集GSE121239中未重复其差异表达，提示其与SLE的关联可能受数据集或队列特异性因素影响。MMP9主要由中性粒细胞分泌，参与细胞外基质降解、组织重塑和炎症反应，SLE患者血清MMP9水平升高，在牙周组织中参与多种蛋白质降解并在活动期牙周炎中大量表达，但在GSE121239中未得到一致验证，提示SLE中存在数据集依赖性变异。PTGS2（环氧化酶-2，COX-2）由炎症刺激诱导，通过产生促炎前列腺素在炎症反应中发挥重要作用，在SLE鼠模型中自发过表达，COX-2抑制剂可减少自身抗体产生并抑制T细胞反应，在慢性牙周炎患者牙周组织中COX-2表达与炎症程度相关，本研究显示PTGS2在各数据集和临床样本中一致验证并上调，提示其可能参与两种疾病的共享炎症特征。FOS属于即早基因家族，其蛋白产物可与JUN家族成员二聚化形成转录因子复合物激活蛋白-1（AP-1），参与信号转导、细胞增殖、分化和凋亡，AP-1介导的信号与SLE中IL-2表达失调和T细胞反应相关，FOS在各数据集和临床样本中一致验证，支持其与两种疾病的潜在相关性。LY96（淋巴细胞抗原96，MD-2）是先天免疫的关键参与者，与Toll样受体4（TLR4）结合促进脂多糖（LPS）识别，激活NF-κB通路并释放促炎细胞因子，先前生物信息学研究已鉴定LY96为SLE潜在生物标志物，且LY96与牙龈卟啉单胞菌相关，在牙周炎患者牙龈组织中表达显著升高，本研究显示LY96在各数据集和临床样本中一致验证。CCL3和MMP9在GSE121239中的不一致验证可能反映SLE数据集间的异质性，包括研究人群、疾病活动度或严重程度、治疗状态和实验平台的差异，由于公共数据集中未统一提供详细临床信息，这些因素的贡献无法确定，因此CCL3和MMP9与SLE的关联应谨慎解释并在独立且临床特征明确的队列中进一步验证。富集分析揭示了牙周炎与SLE之间的潜在分子联系，TLR、IL-17和NF-κB信号通路显著富集，全基因组关联研究、实验小鼠模型和临床样本分析均涉及TLRs在SLE发病机制中的作用，SLE患者中细胞因子释放加速B细胞分化为浆细胞进而增强B细胞内的TLR信号，TLR信号也与牙周炎症和牙槽骨丢失相关，SLE患者血浆和靶器官中IL-17水平显著升高且与疾病严重程度正相关，IL-17可激活NF-κB信号通路并启动牙周炎中的骨吸收，NF-κB通路调控人牙周膜干细胞的增殖和成骨分化同时在炎症条件下促进凋亡，这些发现支持TLR、IL-17和NF-κB信号通路可能参与牙周炎与SLE的共享炎症特征。免疫细胞浸润分析显示两种疾病中免疫谱改变，初始B细胞、浆细胞、活化记忆CD4+ T细胞、活化树突状细胞和中性粒细胞的估计比例差异在两个疾病数据集中均被观察到，先天性和适应性免疫反应均参与牙周炎和SLE的发病机制，中性粒细胞作为最丰富的白细胞在炎症中发挥重要作用，其胞外诱捕网可能促进SLE自身免疫，在牙周炎中中性粒细胞是抗病原体的第一响应者，牙周组织也表现出浆细胞、初始B细胞、中性粒细胞和活化记忆CD4+ T细胞的改变，在SLE中失调的B细胞和T细胞反应导致全身免疫功能障碍和自身抗体产生，活化树突状细胞可招募T细胞和NK细胞至牙周感染部位，其与CD4+ T细胞的相互作用进一步支持适应性免疫参与牙周炎。相关性分析进一步揭示了枢纽基因表达与多种免疫细胞亚群之间的不同关联，提示所鉴定枢纽基因与两种疾病免疫失调之间的潜在关系。研究人员指出一个重要考虑是用于牙周炎和SLE的转录组数据集来源于不同的生物学来源，分别为牙龈组织和外周血/PBMCs，牙龈组织包含多种 resident 和浸润细胞群体，而外周血/PBMC样本主要代表循环免疫细胞，这些组织组成和细胞背景的差异可能影响基因表达谱并因此影响重叠DEGs的鉴定，也可能影响基于CIBERSORT的免疫浸润估计，因此应将其解释为组织特异性相对免疫模式而非牙周炎与SLE之间直接可比的免疫细胞丰度。本研究进一步探索了涉及所鉴定枢纽基因的潜在TF-miRNA调控相互作用，在预测调控网络中STAT1在TFs中表现出高度连接，信号转导和转录激活因子1（STAT1）是一种干扰素响应性转录因子，与SLE和牙周炎均有关联，在miRNAs中miR-146a也表现出高度连接，miR-146a水平在侵袭性牙周炎患者中高于健康对照并可能作为牙周病严重程度的指标，此外miR-146a已被报道通过调控经典和非经典NF-κB信号通路减轻SLE小鼠肾损伤，总体而言这些计算预测的TF-miRNA相互作用为连接牙周炎与SLE的潜在调控机制提供了假设，但其生物学相关性需要进一步的实验验证。使用DSigDB数据库以5个枢纽基因预测候选化合物并鉴定出前10种化合物，其中PGE2相关信号与SLE实验模型中的免疫调节有关，吡咯烷二硫代氨基甲酸盐（PDTC）是NF-κB激活抑制剂，已被报道可减轻LPS诱导的炎症反应和牙周炎症，PDTC也被报道至少部分通过NF-κB和MAPK信号通路减轻实验性SLE的肾脏炎症，辣椒素降低巨噬细胞中LPS诱导的TNF-α和IL-6水平并降低细胞内ROS，提示其具有与牙周病相关的潜在抗炎作用，因此这些计算预测为进一步研究提供了候选化合物，但其对牙周炎和SLE的潜在治疗相关性需要在适当的体外和体内模型中验证。ROC曲线分析表明5个枢纽基因在训练和验证数据集中判别性能存在差异，LY96在两个牙周炎数据集中表现出相对一致的性能，而FOS、LY96和PTGS2在独立SLE验证数据集中表现出相对较高的判别性能，相反CCL3和MMP9在SLE数据集中表现不太一致，表明其潜在诊断相关性应谨慎解释。从临床角度来看，这些发现强调了SLE患者进行更密切牙周评估的潜在价值以及加强牙周炎与SLE关联的跨学科意识的重要性，然而鉴于本研究的探索性性质和独立数据集间的变异性，这些候选基因尚不应被视为已确定的临床生物标志物，需要在更大规模、独立且临床特征明确的队列中进一步验证后才能确定其潜在诊断或风险分层价值。本研究存在若干局限性：第一，尽管枢纽基因在临床队列（每组n = 15）中通过qPCR验证，但需要更大规模、独立和多中心队列来确定其稳健性和临床相关性；第二，牙周炎和SLE数据集之间生物学来源和细胞组成的差异可能影响共享分子和免疫特征的鉴定；第三，研究人群、疾病严重程度、治疗状态和实验平台的异质性可能影响结果，且并非所有候选基因在独立数据集中均得到一致验证。未来研究应在更大规模、独立且临床特征明确的队列中验证这些候选基因，并使用体外和体内模型进一步研究其在牙周炎与SLE潜在共享机制中的功能作用，此外预测调控网络和候选化合物的实验验证将有必要确定其生物学相关性和潜在转化价值。
研究结论翻译：总之，研究人员的整合生物信息学和临床验证分析鉴定CCL3、LY96、FOS、MMP9和PTGS2为与牙周炎和SLE相关的候选基因。FOS、LY96和PTGS2在所分析的数据集中显示一致的表达模式，而CCL3和MMP9在SLE中表现出数据集依赖性变异。临床qPCR验证显示所有5个枢纽基因在两个疾病队列中表达均显著升高。这些发现为牙周炎与SLE的共享分子特征提供了见解，尽管需要在更大规模独立队列中进一步验证。
