《Immunity, Inflammation and Disease》：ScRNA-Seq Reveals Jiangfu Zhixie Formula Alleviates IBS-D by Inhibiting Macrophage M1 Polarization through HIF-1α-Glycolysis Axis
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背景：腹泻型肠易激综合征（IBS-D）因其慢性病程及现有疗法长期疗效有限，仍是临床管理难题。中药复方姜附止泻方（JFZX）已显示出临床获益，但其潜在机制尚不明确。目的：本研究旨在探讨JFZX对IBS-D的治疗效果，并阐明其分子机制，重点关注巨噬细胞极化和HIF
背景：腹泻型肠易激综合征（IBS-D）因其慢性病程及现有疗法长期疗效有限，仍是临床管理难题。中药复方姜附止泻方（JFZX）已显示出临床获益，但其潜在机制尚不明确。目的：本研究旨在探讨JFZX对IBS-D的治疗效果，并阐明其分子机制，重点关注巨噬细胞极化和HIF-1α-糖酵解轴。方法：采用番泻叶灌胃联合束缚应激建立IBS-D小鼠模型。给予不同剂量JFZX或匹维溴铵（阳性对照）治疗14天。评估腹泻症状、内脏高敏感性和肠道屏障完整性。对结肠组织进行单细胞RNA测序（scRNA-seq）以分析细胞组成和细胞间相互作用。体外实验中，研究人员使用JFZX含药血清处理脂多糖（LPS）刺激的RAW264.7巨噬细胞，评估M1极化、细胞因子分泌（IL-1β、TNF-α）以及HIF-1α和糖酵解相关蛋白（GLUT1、LDHA）的表达。结果：JFZX治疗显著改善了IBS-D小鼠的腹泻症状，降低了内脏高敏感性，并恢复了肠道屏障完整性，伴随紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的上调。scRNA-seq显示，JFZX重塑了结肠细胞景观，减弱了髓系-上皮细胞相互作用，并减少了促炎性M1样巨噬细胞的比例。机制上，HIF-1α被确定为IBS-D中M1极化的关键驱动因素。JFZX在体内和体外均抑制了HIF-1α的表达及其下游糖酵解通路（GLUT1、LDHA），从而抑制了M1巨噬细胞极化，并减少了LPS刺激的巨噬细胞中IL-1β和TNF-α的分泌。结论：JFZX通过抑制HIF-1α-糖酵解轴来抑制M1巨噬细胞极化，从而缓解IBS-D，突显了其作为IBS-D治疗药物的潜力，并将HIF-1α确定为干预的有前景靶点。
研究背景与科学问题
腹泻型肠易激综合征（IBS-D）是一种常见的慢性功能性肠病，全球患病率约4%-10%，占所有IBS亚型的约54%。目前临床治疗以控制症状为主，常用药物包括解痉剂、止泻剂和益生菌等，但由于该病呈慢性反复发作的特点，现有疗法的长期疗效有限，毒副作用和耐药风险也制约了治疗效果。在此背景下，源自经典中医方剂的中药复方展现出多成分、多靶点和良好安全性的优势，成为IBS-D治疗的新方向。
姜附止泻方（JFZX）源于张仲景《伤寒论》中的真武汤和小青龙汤，由14味中药组成，旨在温补脾肾、散寒化湿、调畅气机，初步临床报告显示其对IBS-D患者的腹痛和腹泻有缓解作用，动物实验也提示其可能修复肠黏膜屏障。然而，JFZX发挥治疗作用的具体分子机制和药理靶点尚不清楚，阐明这些机制对于支持其临床应用和发现IBS-D新的治疗策略至关重要。
IBS-D的病理生理涉及免疫失调、肠道屏障功能障碍、内脏高敏感性等多重因素。其中，肠道屏障完整性破坏导致管腔抗原和微生物产物易位，激活黏膜免疫系统，被认为是驱动症状慢性的关键环节。在这一过程中，肠道巨噬细胞向促炎性M1样表型转化起着核心作用，而这种极化与缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）调控的代谢重编程密切相关——HIF-1α可转录上调糖酵解关键酶如GLUT1、HK2和PKM2，推动巨噬细胞进入糖酵解代谢状态，进而促进炎症反应。基于此，研究人员提出假设：JFZX的抗IBS-D作用可能涉及调节肠道巨噬细胞中的HIF-1α通路，通过抑制HIF-1α激活来削弱糖酵解、减少M1巨噬细胞极化、减轻肠道炎症并促进屏障修复。
主要技术方法
研究人员从河北省中医院获取所有生药材并验证植物学身份，制备JFZX煎剂和番泻叶浸剂。动物实验方面，采用60只雄性C57BL/6小鼠，随机分为对照组、模型组、JFZX低/中/高剂量组和阳性对照（匹维溴铵）组，IBS-D模型通过番泻叶灌胃（5g/kg/天）联合每日1小时束缚应激持续14天建立，随后各组分别给药14天。关键技术包括：利用10× Genomics平台对结肠组织进行单细胞RNA测序（scRNA-seq），使用Cell Ranger和Seurat软件进行数据处理、降维聚类和UMAP可视化，并通过SeekSoul Online平台进行KEGG富集分析、细胞间通讯推断和拟时序轨迹构建；体外实验使用LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞系，采用CCK-8法检测细胞活力，免疫荧光染色检测CD86和CD206表达，ELISA检测IL-1β和TNF-α分泌水平，Western blot检测HIF-1α、GLUT1和LDHA蛋白表达。
研究结果
3.1 JFZX改善IBS-D小鼠腹泻症状：通过建立IBS-D小鼠模型，研究人员观察到模型小鼠体重增长显著减缓、腹泻率和粪便含水量升高、布里斯托大便评分增加、内脏敏感性增强。经不同剂量JFZX连续治疗14天后，上述指标均得到明显改善，证实JFZX有效缓解IBS-D的关键症状特征。
3.2 JFZX改善IBS-D小鼠肠道屏障功能：H&E染色显示模型小鼠结肠黏膜结构受损，腺体间有炎性细胞浸润，组织架构紊乱，而JFZX治疗呈剂量依赖性地减轻这些病理改变并减少炎性细胞浸润。Western blot分析进一步证明JFZX上调了结肠组织中紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的表达。
3.3 scRNA-seq揭示JFZX改变IBS-D小鼠结肠细胞异质性：对对照组、模型组和JFZX中剂量组小鼠结肠组织进行scRNA-seq，共获得18,847、25,279和23,284个高质量细胞，通过无监督聚类识别出22个细胞簇，归为上皮细胞、基质细胞、T细胞、B细胞和髓系细胞五大类。JFZX处理后上皮细胞比例从34.62%增至58.63%，基质细胞从20.62%增至24.15%，而B细胞、T细胞和髓系细胞比例下降。配体-受体互作分析显示，模型组髓系细胞与上皮细胞的相互作用强度和数量增加，JFZX则显著减弱了这种互作。
3.4 M1样巨噬细胞与IBS-D的相关性：对髓系细胞进行亚聚类分析，鉴定出五种亚群：组织驻留样巨噬细胞（高表达F13a1、Lyve1）、单核细胞（高表达Ly6c2、Ccr2）、抗原提呈巨噬细胞（高表达H2-Ab1、H2-Aa、H2-Eb1）和M1样巨噬细胞（高表达Nlrp3、Il1b、Cd86）。JFZX治疗后M1样巨噬细胞比例降低。拟时序分析显示单核细胞处于轨迹起始位置，抗原提呈巨噬细胞和M1样巨噬细胞更接近终点，分支决策点基因追踪表明M1样巨噬细胞分支启动了Nlrp3和Il1b等促炎基因表达。
3.5 M1样巨噬细胞特异性信号通路和调控因子的鉴定：KEGG富集分析显示M1样巨噬细胞差异表达基因显著富集于趋化因子信号、NOD样受体信号、TNF信号和NF-κB信号等炎症通路。AUCell调控子活性分析和转录因子调控子活性分析均表明，HIF-1α活性与IBS-D中的M1样巨噬细胞显著相关，且HIF-1α调控子在M1样巨噬细胞中最为活跃。
3.6 JFZX体外抑制LPS诱导的M1巨噬细胞极化：CCK-8实验确认2.5%-60%浓度的JFZX含药血清不影响正常和LPS处理的RAW264.7细胞活力，因此选择10%浓度和48小时孵育时间进行后续实验。免疫荧光显示LPS刺激显著上调M1标志物CD86并下调M2标志物CD206，JFZX处理显著逆转了这些变化。JFZX还显著抑制了LPS诱导的促炎细胞因子IL-1β和TNF-α的表达。Western blot分析表明，JFZX处理降低了结肠组织和培养细胞中HIF-1α蛋白水平，同时降低了葡萄糖转运蛋白GLUT1和糖酵解限速酶LDHA的蛋白表达。
讨论与结论
讨论部分指出，IBS-D的常规药物治疗主要针对症状管理，常受限于毒性、副作用和耐药风险。JFZX的设计遵循中医温阳化湿的策略，以干姜、附子为君药温阳散寒，苍术、茯苓健脾燥湿，麻黄、桂枝、细辛等为臣药散寒调水，白芍、五味子等为佐药敛津，甘草为使药调和诸药。研究证实JFZX可上调紧密连接蛋白ZO-1和Occludin表达，修复肠道屏障损伤，并通过减少M1样巨噬细胞比例来逆转促炎性巨噬细胞极化。scRNA-seq分析揭示了JFZX重塑结肠细胞景观的作用，特别是减弱了髓系-上皮细胞互作。机制上，HIF-1α在M1样巨噬细胞中活性升高，JFZX通过抑制HIF-1α介导的糖酵解通路来抑制M1极化，减少促炎细胞因子产生。
研究结论：JFZX通过抑制HIF-1α-糖酵解轴来抑制M1巨噬细胞极化，从而缓解IBS-D小鼠的腹泻和内脏高敏感性等关键症状，并增强肠道屏障完整性。这些发现为JFZX的治疗作用提供了新的分子视角，并将HIF-1α确定为IBS-D管理的潜在靶点。
