基于全基因组CRISPR筛选鉴定多巴胺能神经元中PRKN非依赖性线粒体自噬调控因子

《Neuroscience Research》：PRKN-independent mitophagy regulators in dopaminergic neurons identified by genome-wide CRISPR screening

　　

帕金森病是一种晚发性神经退行性疾病，其特征为静止性震颤、运动迟缓和肌肉强直，并与黑质多巴胺能神经元的进行性变性及随后的多巴胺耗竭相关。尽管10%的患者具有与已知特定基因相关的遗传形式，但90%的患者为特发性，无已知基因突变。PRKN和PINK1在遗传性帕金森病中的发现具有典范意义，阐明这两个基因通过线粒体自噬介导线粒体质量控制的共同通路。然而，由于PRKN和PINK1在帕金森病中的突变或功能改变属于功能丧失型，因此通过PRKN-PINK1通路激活线粒体自噬对PRKN/PINK1帕金森病患者而言颇具挑战。因此，探索独立于PRKN-PINK1通路的代偿性线粒体自噬机制具有重要意义。本研究利用人诱导多能干细胞分化的多巴胺能神经元，结合mito-SRAI荧光探针和全基因组CRISPR敲除筛选，在PRKN敲除的多巴胺能神经元中鉴定调控PRKN非依赖性线粒体自噬的基因。在筛选的19027个基因中，67个基因的敲除满足CCCP处理后TOLLES/YPet比值升高的标准。其中，组织蛋白酶F的敲低在CCCP处理后显著增加了TOLLES/YPet比值，并在百草枯暴露后部分保留了酪氨酸羟化酶阳性神经元的比例。这些结果表明，通过高通量全基因组筛选鉴定出了包括CTSF在内的多个候选基因，其敲除可增加PRKN敲除多巴胺能神经元中应激诱导的TOLLES/YPet比值，CTSF可能成为帕金森病治疗干预的潜在候选靶点。

基于全基因组CRISPR筛选鉴定多巴胺能神经元中PRKN非依赖性线粒体自噬调控因子的研究解读

一、研究背景与目的

帕金森病是一种晚发性神经退行性疾病，临床特征包括静止性震颤、运动迟缓和肌肉强直，病理基础为黑质多巴胺能神经元的进行性变性及随后的多巴胺耗竭。约10%的患者具有遗传形式，其中PRKN和PINK1是重要的致病基因，二者通过线粒体自噬途径共同介导线粒体质量控制。然而，90%的患者为特发性病例，且PRKN/PINK1患者的突变属于功能丧失型，因此通过经典的PRKN-PINK1通路激活线粒体自噬面临困难。近年来研究发现，线粒体自噬可以独立于PRKN和PINK1发生，这为开发针对遗传性和特发性帕金森病的小分子药物提供了新的思路。基于此，研究人员旨在利用人诱导多能干细胞分化的多巴胺能神经元模型，结合荧光探针技术和全基因组CRISPR筛选，系统性鉴定能够调控PRKN非依赖性线粒体自噬的基因，从而发现潜在的药物靶点。

二、主要关键技术方法

研究人员采用的主要技术方法包括：利用健康对照和PRKN敲除的人诱导多能干细胞系，通过改良底板祖细胞法定向分化为多巴胺能神经元；采用mito-SRAI双荧光蛋白探针系统监测线粒体自噬活性，该探针由YPet和TOLLES串联融合构成，定位于线粒体，在线粒体被递送至溶酶体后因pH变化导致YPet降解而显现TOLLES荧光；通过慢病毒转导建立稳定表达Cas9的PRKN敲除诱导多能干细胞系；使用Edit-R crRNA阵列文库对19027个基因进行全基因组CRISPR敲除筛选，每基因4条crRNA混合转染；采用高内涵成像分析系统检测TOLLES/YPet比值作为线粒体自噬指数；利用百草枯处理模型评估多巴胺能神经元存活。

三、研究结果

3.1 诱导多能干细胞分化为多巴胺能神经元及其表征

研究人员成功将PRKN敲除和对照诱导多能干细胞系分化为表达酪氨酸羟化酶的多巴胺能神经元，并通过毛细管蛋白质印迹证实了PRKN蛋白的缺失。氧消耗速率测定显示两系细胞总体呼吸相似，但PRKN敲除多巴胺能神经元的质子漏显著降低。在百草枯处理后，PRKN敲除多巴胺能神经元中酪氨酸羟化酶阳性细胞的比例下降程度大于对照组，表明PRKN缺失改变了线粒体应激反应。

3.2 建立PRKN敲除多巴胺能神经元的高通量线粒体自噬检测体系

研究人员建立了基于mito-SRAI探针的荧光检测体系。CCCP处理在对照细胞中显著升高TOLLES/YPet比值，但在PRKN敲除细胞中未见明显升高，证实了PRKN依赖性线粒体自噬的缺失。去铁胺处理在两系细胞中均升高了该比值，表明存在PRKN非依赖性的替代线粒体自噬机制。外源引入PRKN mRNA后，CCCP诱导的TOLLES/YPet比值恢复，进一步确认了体系的可靠性。

3.3 建立Cas9表达多巴胺能神经元和CRISPR敲除系统

研究人员从PRKN敲除mito-SRAI诱导多能干细胞中建立了稳定表达Cas9的细胞系，分化后经毛细管蛋白质印迹确认Cas9表达。致死crRNA转染实验证实了CRISPR系统的功能性，PPIB和HPRT1位点的T7EI切割效率分别为55%和60%，表明获得了足够的基因敲除效率。

3.4 全基因组CRISPR筛选鉴定诱导线粒体自噬的基因

对19027个基因进行单孔初筛，以1.86倍变化为严格阈值，结合1.74倍的宽松阈值，共421个基因进入二次验证筛选。经重复验证和基线条件分析后，128个基因被确认为重现性阳性，其中67个基因的CCCP处理与基线TOLLES/YPet比值超过1.5，被确定为本研究的命中基因。富集分析显示这些基因主要涉及氧化磷酸化和线粒体蛋白降解等线粒体功能。CTSF因其筛选特征和作为药物靶点的潜力被选作后续研究对象。

3.5 CTSF敲低对线粒体自噬和多巴胺能神经元保护的影响

研究人员通过siRNA敲低CTSF表达，RT-qPCR确认了敲低效果。CCCP处理在CTSF siRNA组中显著升高了TOLLES/YPet比值，数值上高于对照组，但统计未达显著性。CTSF敲低对基线或去铁胺诱导的比值无明显影响。在百草枯暴露模型中，CTSF siRNA处理部分保留了酪氨酸羟化酶阳性细胞的比例，表明CTSF敲低可能具有神经保护作用。

四、讨论与结论

研究人员指出，筛选获得的67个基因中多数参与线粒体功能，其敲除导致线粒体功能障碍，进而通过代偿反应激活线粒体自噬。CTSF编码组织蛋白酶F，是一种溶酶体半胱氨酸蛋白酶，虽然关于CTSF与线粒体自噬的直接关联报道较少，但其与急性线粒体应激和凋亡的相关性支持了研究人员的观察结果。研究人员强调，CTSF敲低对酪氨酸羟化酶阳性神经元的保护作用可能不仅限于线粒体自噬恢复，还可能涉及其他通路的间接调节。值得注意的是，CTSF突变是CLN13型神经元蜡样脂褐质沉积症的致病基因，因此在靶向CTSF的药物开发中需充分理解治疗剂量和安全剂量范围。

研究存在若干局限性：筛选报告的是溶酶体递送而非线粒体自噬本身，尤其对于CTSF这一溶酶体蛋白酶，其对报告蛋白的处理可能存在直接影响；百草枯和CCCP使用了不同的应激源，两者之间的关系有待进一步验证；需要通过正交的线粒体自噬检测方法和独立的实验体系进行确认。

研究结论：通过高通量全基因组筛选，研究人员鉴定了多个候选基因，其敲除可增加PRKN敲除多巴胺能神经元中应激诱导的TOLLES/YPet比值，其中CTSF可能成为帕金森病治疗干预的潜在候选靶点。