《Neuroscience Research》：Auditory-vocal mirror-like properties of basal ganglia neurons for learned song in Bengalese finches
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习得性发声行为依赖于将听觉信息与发声运动活动联系起来的神经机制，但这种对应关系在基底节中如何表征尚不清楚。在鸣禽中，听觉-发声镜像神经元已在HVC（前运动鸣唱核团）中被描述。HVC投射到X区（Area X），一个鸣唱特化的基底节核团，但X区是否包含具有类似特性
习得性发声行为依赖于将听觉信息与发声运动活动联系起来的神经机制，但这种对应关系在基底节中如何表征尚不清楚。在鸣禽中，听觉-发声镜像神经元已在HVC（前运动鸣唱核团）中被描述。HVC投射到X区（Area X），一个鸣唱特化的基底节核团，但X区是否包含具有类似特性的神经元尚不清楚。本研究通过在成年斑胸草雀（Lonchura striata var. domestica）中进行单单位记录（single-unit recordings），在X区鉴定出两种具有听觉-发声对应的神经元。这些神经元在鸣唱期间和播放鸟自身鸣唱（BOS）期间均表现出相应的放电率变化。一种类型在特定音节时间点表现出发射率的相位性（phasic）变化，而另一种类型在鸣唱和聆听过程中表现出发射率的紧张性（tonic）变化。这些发现提示，听觉-发声镜像样特性可能超越前运动核团延伸至基底节，且习得性鸣唱在听觉和发声过程中的对应表征分布于鸣唱系统的多个层级，可能有助于感觉运动整合（sensorimotor integration）。
**研究背景与问题**
人类能够通过感觉运动学习获得广泛的复杂运动行为，包括言语以及运动和音乐表演等技能行为。这些行为的成功执行依赖于整合感觉表征与运动命令的神经系统。鸣禽因其通过模仿导师习得鸣唱，为研究感觉运动整合的神经机制提供了优良模型。鸣禽鸣唱学习与人类婴儿语言习得高度平行，两者均需要将听觉信息与再现该信息所需的发声运动命令进行整合。鸣唱学习背后的神经环路已被广泛表征：发声运动通路中，前运动核团HVC投射到弓状皮质大细胞核（RA），后者将前运动命令 relay 到下游脑干环路控制发声；前脑通路（AFP）中，HVC投射到X区（鸣唱特化的基底节核团），后者最终经丘脑背外侧核内侧部（DLM）和前脑皮质大细胞核外侧部（LMAN）投射到RA。与发声运动通路不同，AFP是发声学习和可塑性所必需的，该环路与哺乳动物（包括人类）的皮质-基底节环路在功能和组构上具有相似性。
在鸣唱环路中，多个成年鸣禽物种（包括斑胸草雀）的HVC中已鉴定出具有听觉-发声镜像特性的神经元，这些神经元在鸣唱和播放鸟自身鸣唱（BOS）期间在对应音节时间点放电。此类神经元被称为听觉-发声镜像神经元，已在投射到X区的HVC神经元中被鉴定，可能有助于整合鸣唱学习和维持所需的听觉与发声运动信息。值得注意的是，HVC中的这些投射神经元对鸣唱学习至关重要，损毁研究也表明X区本身在幼年发育期间以及某些情况下成年期对精炼鸣唱结构和音节特征具有关键作用。这些观察引出一个假设：X区包含具有对应听觉反应和鸣唱相关活动的神经元，可能在AFP内整合听觉和发声运动信息。为确定此类神经元是否存在，研究人员在成年斑胸草雀X区进行了细胞外单单位记录。
**主要技术方法**
研究人员使用4只成年雄性斑胸草雀（Lonchura striata var. domestica，购自商业繁殖者，日龄超过150天）进行实验。在异氟烷麻醉下，依据先前斑胸草雀研究估计的坐标（前5.1 mm，距矢状窦分叉外侧1.7 mm）将四极管（镍铬合金丝，直径12.5 μm）植入X区目标区域，使用16通道记录系统在自由活动条件下记录神经活动。记录期间通过扬声器播放BOS和两只不熟悉的同种成年鸣唱（CON）作为听觉刺激（声强55–70 dB，刺激间隔10或15 s）。采用Offline Sorter进行离线 spike sorting，通过不应期违反率和L-ratio评估单位隔离质量，并通过鸣唱与播放会话间平均 spike 波形的Pearson相关确认同一神经元。鸣唱分析独立于神经数据，音节分割依据Tachibana et al.（2014），音节类型通过Python（v3.12）半自动分类（UMAP嵌入结合HDBSCAN聚类）。紧张性变化通过比较测试期与基线期放电率评估（Wilcoxon符号秩检验），相位性变化采用观察者无关程序（Goldberg and Fee, 2010）基于音节对齐放电的peri-stimulus time histogram（PSTH）与替代PSTH比较评估。听觉-发声对应在紧张性和相位性尺度上分别评估，相位性对应通过交叉相关检验 singing 和BOS播放的PSTH时间模式是否匹配。BOS与CON反应比较使用d′。细胞类型依据自发放电率分类：低于15 Hz为推定中型多棘神经元（medium spiny neurons），高于70 Hz为推定苍白球样神经元（pallidal-like neurons），15–70 Hz未分类。记录完成后通过电解损毁标记记录位点并进行组织学验证。
**研究结果**
**鸣唱相关活动和听觉反应**：研究人员从4只成年鸟的120个神经元记录了鸣唱和听觉播放期间的单单位活动。120个神经元中75个（63%）检测到鸣唱相关活动（40个紧张性变化，62个相位性变化）；32个（27%）对BOS有反应（8个紧张性，31个相位性）；30个（25%）对CON有反应（12个紧张性，23个相位性）。16个神经元对BOS和CON均有反应，16个仅对BOS有反应，14个仅对CON有反应。随后分别针对紧张性和相位性变化评估听觉-发声对应，鉴定出X区神经元中存在相位性和紧张性听觉-发声对应。
**相位性听觉-发声对应**：7个神经元（来自3只鸟）表现出相位性对应，在鸣唱期间特定音节时间点相位性放电，多数（7个中的5个）还伴有整个鸣唱片段中放电率的紧张性增加。BOS播放期间，这些神经元在对应音节时间点表现出相位性反应，两种条件下放电的时间模式显著相关（13个音节类型，每个神经元1–4个），但刺激期间无紧张性放电率增加。因此，鸣唱和BOS播放之间共享的反应特征仅限于相位性、音节对齐的放电率变化。所有这些神经元中，鸣唱和BOS播放期间的相位性变化方向相同。鸣唱相关放电与BOS相关放电之间的滞后（每个神经元一个音节类型，取相关性最大者）在3个神经元中为0 ms，4个中为+10至+50 ms（中位数+10 ms，n=7），即鸣唱相关放电与听觉反应同时或稍早出现。相位性变化的幅度（PSTH峰值减均值）在所有13个具有相位性对应的音节类型中鸣唱期间均大于BOS播放期间；以每个神经元一个音节类型计，鸣唱期间中位数79.6 Hz，BOS播放期间30.3 Hz（7/7神经元，Wilcoxon符号秩检验，P=0.016，n=7）。7个神经元中6个也对CON有相位性反应，但所有6个中BOS反应强于CON（d′=0.49–2.61，中位数1.06）；剩余1个神经元仅对BOS有反应。
**紧张性听觉-发声对应**：3个具有紧张性对应的神经元在鸣唱期间整个鸣唱片段中表现持续放电率增加，BOS播放期间整个刺激期间表现可比拟的持续增加。这些神经元在鸣唱和BOS播放期间也在音节相关时间点表现相位性放电率变化，但两种条件下的相位性模式无显著相关，因此不符合相位性标准。紧张性变化的幅度以调制指数表示，3个神经元中2个在鸣唱和BOS播放之间相似，剩余1个在鸣唱期间更大。3个均未对CON表现紧张性反应。1个神经元表现相反方向的变化，鸣唱期间降低而BOS播放期间升高，无相位性对应，且仅对BOS有反应。最后，1个神经元同时表现相反方向紧张性变化（鸣唱期间升高而BOS播放期间降低）和3个音节类型的相位性对应，被分类为混合型。该神经元是唯一具有紧张性对应且也对CON表现紧张性反应（降低，与BOS相同）的神经元。BOS的抑制弱于CON（两个CON刺激的d′分别为0.59和0.70；此处正值表示降低较小）。需注意BOS期间（而非CON期间）其相位性增加叠加到全刺激放电率上，从而减小了表观降低。
**对应神经元的比例及其推定细胞类型**：在整个群体中，15%的鸣唱相关神经元（75个中的11个）符合听觉-发声对应标准：9个同方向对应（相位性6个，紧张性3个），1个仅相反方向紧张性对应，1个混合型（相位性对应伴相反方向紧张性变化）。为估计推定细胞类型身份，研究人员检查了自发和鸣唱期间放电率。按照方法中描述的标准，自发率低于15 Hz的神经元被分类为推定中型多棘神经元（75个鸣唱相关神经元中的41个），高于70 Hz为推定苍白球样神经元（n=10），中间范围（15–70 Hz；n=24）未分类。11个对应神经元中，4个为推定中型多棘神经元，均表现对齐特定音节的相位性对应，其中1个还表现相反方向紧张性变化。其余7个自发放电率远高于中型多棘神经元范围：4个为推定苍白球样神经元，其中2个表现紧张性对应（1个同方向，1个相反方向），2个表现相位性对应；3个处于未分类中间范围（同方向紧张性对应n=2；相位性对应n=1）。因此，对应神经元存在于所有三个放电率组中，从推定中型多棘神经元到推定苍白球样神经元。
**讨论部分总结**
研究人员在X区鉴定出符合听觉-发声对应操作标准的一个神经元亚群。虽然稀少，但这些神经元在鸣唱和BOS播放期间以对应方式改变放电，或以相位性方式锁定于单个音节，或以紧张性方式跨越鸣唱片段。关于相位性听觉-发声镜像样特性，具有相位性对应的神经元表现出与HVC投射到X区神经元所描述听觉-发声镜像一致的若干特征：鸣唱期间音节锁定活动与BOS播放期间对应活动同时或更早出现（0–50 ms），且鸣唱期间放电率调制更大，两者均提示发声运动贡献。然而，由于听觉反应的潜伏期和幅度本身可能依赖行为状态，本研究数据无法明确区分发声运动成分与对自身产生鸣唱的听觉反应，因此将这些特征描述为听觉-发声镜像样特性。发声运动对鸣唱相关放电的贡献也与X区先前发现一致：7个具有相位性对应的神经元中4个为推定中型多棘神经元，后者是HVC输入的主要靶标，其鸣唱相关活动对听觉反馈的急性扰动具有抗性。Singh Alvarado et al.（2021）使用钙成像未在斑胸草雀X区多棘神经元中检测到对BOS播放的反应；斑胸草雀HVC神经元对BOS的听觉反应在清醒鸟中较弱并在夜间变得更明显，而斑胸草雀X区投射HVC神经元的听觉-发声镜像反应在清醒期存在。因此，此处观察到的相位性对应可能反映从HVC传递的听觉-发声镜像反应。
关于紧张性对应，具有紧张性对应的神经元在两方面不同于相位性对应神经元：多数自发放电率远高于中型多棘神经元，且其对应在同方向和相反方向均有发现。5个中1个为推定中型多棘神经元且也表现相位性对应；其余4个自发放电率高于35 Hz（2个推定苍白球样，2个未分类）。由于此类高放电率神经元可能接受多个中型多棘神经元的输入，其活动可能反映音节锁定相位信号整合为跨越鸣唱片段的持续变化；类似的整合已被提出用于解释苍白球神经元鸣唱相关活动的背景依赖性变异。与此观点一致，3个同方向紧张性对应神经元在鸣唱和听觉条件下也表现相位性变化，但这些变化不相关。汇聚程度可能因神经元而异：由少数输入主导的神经元可能保留音节锁定结构，这可能解释为何3个高放电率神经元（2个推定苍白球样和1个未分类）表现相位性而非紧张性对应。
紧张性变化的方向也有变异。3个神经元在鸣唱和BOS播放期间均增加放电，而2个表现相反方向变化：1个鸣唱期间降低而BOS播放期间升高，1个（推定中型多棘神经元）鸣唱期间升高而播放期间降低同时保留特定音节的相位性对应。灵长类运动皮层镜像神经元同样不仅包括在执行和观察期间均被易化的细胞，也包括在执行期间被易化而在观察期间被抑制的细胞，此类抑制性镜像神经元被提出用于区分自身产生与观察到的动作。此处观察到的同方向和相反方向紧张性对应与哺乳动物镜像神经元中发现的两种对应类型相似。类比而言，同方向紧张性对应可能将鸣唱的听觉和发声运动表征联系起来，而相反方向变化可能发出鸣唱正在被产生还是被听到的信号。相反方向变化因此不反映经典镜像神经元意义上的共享表征，但它们表明鸣唱与聆听状态在X区被表征。
关于清醒基底节中的听觉-发声对应，X区作为支持鸣唱学习的皮质-基底节环路的中心组分已被广泛研究，特别是在强化学习和使用听觉反馈维持鸣唱的背景下。X区的鸣唱相关活动已在清醒行为鸟中被研究，而听觉反应已在麻醉或睡眠下被检查。因此，两个条件是否在单个神经元内对应尚未被直接检验。本研究在清醒自由行为鸟中的记录允许在同一神经元内比较鸣唱相关活动和听觉反应，并揭示了相位性和紧张性对应。这些发现证明了X区单神经元水平的听觉-发声对应，提示其在将鸣唱的听觉表征与发声产生联系起来中的可能作用。
关于基底节中的感觉运动对应，镜像神经元最初在猴前运动皮层中被描述，主要已在灵长类和其他哺乳动物的皮层区域中被描述。最近，单神经元记录在猕猴壳核中鉴定了感觉-运动镜像样对应。在灵长类壳核中，这些对应依赖社会互动，并包括动作观察期间被易化和被抑制的神经元，这种二分法与本文观察到的同方向和相反方向紧张性对应平行。相比之下，X区神经元在非社会环境中对鸟自身习得鸣唱有反应，且不仅存在于推定纹状体神经元中，也存在于推定苍白球样神经元中。这些发现支持听觉-发声对应不限于皮层环路的观点。尽管哺乳动物皮层镜像神经元传统上在高级社会认知功能（如动作理解和意图识别）背景下被讨论，但其在感觉运动学习中的作用仍是重要研究课题。鸣禽基底节关键参与发声学习，为研究听觉-发声镜像样活动与感觉运动整合及习得性发声行为获得的关系提供了机会。
关于局限性，研究人员指出：第一，记录来自4只鸟，听觉-发声对应神经元在3只中被鉴定，11个中7个来自单只鸟，样本小且在各鸟间分布不均，因此神经元数量不应被视为独立重复的数量。第二，尽管鸣唱期间相对时序和更大的相位性调制提示发声运动贡献，但本研究中未实验性扰动听觉反馈，因此不能排除听觉贡献。第三，细胞类型分类仅基于自发放电率，是暂定的。第四，研究是相关性的。需要大规模记录结合听觉反馈扰动和环路特异性操作来将这些观察扩展到群体水平，并确定X区相位性对应是继承自HVC、局部产生还是两者兼有。
**研究结论翻译**
总之，本研究 findings 提供了X区听觉-发声对应的单神经元证据，提示听觉-发声镜像样特性可能超越HVC延伸至鸣禽基底节。这些结果提示，习得性鸣唱在听觉和发声期间的对应表征分布于鸣唱系统的多个层级，包括基底节本身之内。
