焦亡巨噬细胞来源细胞外囊泡经miR-103a-3p靶向MFN2与BCL2L13诱导线粒体功能障碍促进卵巢储备功能减退

《Aging Cell》：Pyroptotic Macrophage Extracellular Vesicles Drive miR-103a-3p Mediated Mitochondrial Dysfunction in Granulosa Cells in Diminished Ovarian Reserve

　　

为明确焦亡巨噬细胞来源的细胞外囊泡（EVs）在卵巢储备功能减退（DOR）中的作用，并阐明EVs介导的miR-103a-3p转运是否驱动颗粒细胞线粒体功能障碍，研究人员分析了公共GEO数据集的单细胞RNA测序数据，以刻画不同年龄组卵巢巨噬细胞中与焦亡相关的特征。研究人员从焦亡巨噬细胞中分离EVs并作用于颗粒细胞（KGN），以评估线粒体功能、氧化应激和凋亡；通过miRNA测序鉴定EVs富集的miRNA；进一步检测DOR患者卵泡液EVs中miR-103a-3p的表达，并分析其与卵巢储备标志物的相关性；采用体外实验和体内小鼠模型开展机制研究。结果显示，焦亡特征随衰老在卵巢巨噬细胞中富集；焦亡巨噬细胞来源的EVs富集miR-103a-3p，并诱导颗粒细胞线粒体功能障碍，表现为ATP降低、ROS升高和凋亡增强，而抑制miR-103a-3p可减轻上述效应。临床上，DOR患者卵泡液EVs中miR-103a-3p升高，并与抗苗勒管激素（AMH）和窦卵泡计数（AFC）呈负相关。机制上，miR-103a-3p靶向MFN2和BCL2L13，破坏KGN细胞线粒体稳态；恢复上述靶点可减轻KGN细胞功能障碍。体内实验中，腺相关病毒（AAV）介导的miR-103a-3p抑制改善了卵泡发育和卵巢功能。因此，焦亡巨噬细胞可能通过EVs介导的miR-103a-3p递送促进DOR进展，该miRNA通过靶向MFN2和BCL2L13损害颗粒细胞线粒体稳态。

研究背景：卵巢储备功能是女性生殖潜能的关键指标，主要反映可用卵泡数量与卵母细胞发育质量。卵巢储备功能减退（DOR）在育龄女性中的发生率逐年上升，并呈年轻化趋势，临床以基础促卵泡激素（FSH）升高（>10 mIU/mL）、窦卵泡计数（AFC）减少（<5–7）和抗苗勒管激素（AMH）降低（<0.5–1.1 ng/mL）为特征。DOR患者因卵泡池减少和卵母细胞质量受损，自然妊娠率较低，辅助生殖技术（ART）中卵巢反应不良、获卵数有限和胚胎质量欠佳仍是限制妊娠成功的主要因素。卵泡正常发育与颗粒细胞功能完整性密切相关，颗粒细胞为卵母细胞提供代谢能量，并通过分泌激素和调控关键信号通路参与卵母细胞发育、成熟与排卵。近年来，微小RNA（miRNA）作为卵巢生理与病理过程中细胞行为的关键表观调控因子受到关注，其通过结合信使RNA（mRNA）的3′-非翻译区（3′-UTR）调控靶基因表达，影响凋亡、增殖和应激反应等过程。已有研究报道miR-484、miR-145-5p和miR-6881-3p等通过调控颗粒细胞凋亡与增殖维持卵巢功能，但这些研究主要关注卵巢细胞自身表达的miRNA，免疫细胞来源EVs相关miRNA在卵巢衰老中的作用尚不清楚。氧化应激（OS）是卵巢功能衰竭尤其是DOR发生发展的关键致病因素，活性氧（ROS）过度积累可直接破坏线粒体膜电位、损害呼吸链功能，诱导颗粒细胞线粒体介导的凋亡，加速卵泡闭锁与耗竭。卵巢不仅是生殖器官，也是重要的免疫调节微环境，巨噬细胞在维持组织稳态、清除凋亡细胞和调节炎症反应中发挥核心作用；随年龄增长，卵巢免疫微环境逐渐失调，促炎活性增强。单细胞转录组分析显示，衰老过程中卵巢巨噬细胞焦亡相关通路显著激活，推动局部微环境由免疫稳态向促炎状态转变；巨噬细胞还可分泌EVs递送包括miRNA在内的生物活性分子，调控靶细胞线粒体功能、增殖与凋亡。研究人员前期研究发现，DOR女性卵泡液颗粒细胞中miR-103a-3p表达显著上调，卵泡液中高表达miR-103a-3p与体外受精-胚胎移植（IVF-ET）胚胎质量较差相关；在帕金森病模型中，miR-103a-3p通过抑制Parkin/Ambra1信号通路加重神经元损伤、损害线粒体自噬。然而，致病性miRNA能否来源于免疫细胞并通过EVs介导的通讯转移至卵巢体细胞尚不清楚，焦亡巨噬细胞对miRNA驱动的卵巢功能障碍的贡献尚未被研究。基于此，研究人员提出假说：miR-103a-3p不仅作为细胞内调控因子，也可能作为来源于炎症巨噬细胞的细胞外信号分子；本研究整合公共单细胞RNA测序分析与体内外实验，明确焦亡巨噬细胞来源EVs是否将miR-103a-3p递送至颗粒细胞，并阐明该免疫-卵巢信号轴促发线粒体功能障碍与DOR进展的下游机制。

研究人员开展的研究与结论：研究结合公共单细胞RNA测序数据、体外细胞实验、临床卵泡液样本和体内小鼠模型，证实焦亡巨噬细胞来源EVs通过递送miR-103a-3p抑制颗粒细胞MFN2和BCL2L13表达，破坏线粒体稳态，诱导颗粒细胞凋亡、衰老和雌激素分泌受损，进而促进DOR进展；抑制miR-103a-3p可减轻上述损伤并改善小鼠卵巢功能。其重要意义在于揭示了既往未被认识的免疫-卵巢通讯轴，拓展了对免疫细胞来源EVs-miRNA参与卵巢衰老与DOR机制的理解，并提示EVs相关miR-103a-3p可作为卵泡液候选指标和治疗靶点。

主要关键技术方法：研究纳入2019年1月1日至5月31日在山东中医药大学附属医院生殖与遗传中心接受IVF/ICSI的30例年龄≥38岁DOR患者和30例因男方因素不孕接受ICSI的正常卵巢储备（NOR）对照，研究经伦理批准并注册于中国临床试验注册中心（ChiCTR1800019798）；采用公共GEO数据集（GSE267315）单细胞RNA测序分析、超速离心法分离EVs并结合透射电镜（TEM）、纳米颗粒跟踪分析（NTA）和Western blot鉴定、miRNA测序与转录组测序、双荧光素酶报告基因实验、氧化应激与线粒体功能检测、凋亡与细胞衰老检测、qRT-PCR与Western blot，以及AAV9介导的卵巢miR-103a-3p抑制小鼠模型。

研究结果：

3.1 单细胞分析揭示衰老卵巢巨噬细胞焦亡增强并鉴定富集miR-103a-3p的EVs：单细胞RNA测序显示，与育龄女性（32/34岁）相比，高龄女性（42岁）卵巢组织巨噬细胞焦亡相关特征显著增强，IL18、NLRP3和NLRP1差异表达。体外将THP-1细胞诱导分化为巨噬细胞样细胞（M0）并刺激形成焦亡巨噬细胞表型（Pyr），cleaved caspase-1（p20）、cleaved GSDMD表达升高，培养上清中IL-1β、IL-18和乳酸脱氢酶（LDH）分泌增加，证实焦亡巨噬细胞模型建立成功。分离的EVs经Western blot确认EV标志物阳性，NTA显示粒径主要分布于50–150 nm，TEM显示典型圆形囊泡结构；与M0来源EVs相比，Pyr-EVs粒径和浓度显著增加。miRNA测序鉴定Pyr-EVs与M0-EVs间19个差异表达miRNA（11个上调、8个下调），GO富集提示靶基因主要参与线粒体功能与能量代谢、细胞生长与增殖、氧化应激反应、信号转导和表观遗传调控，KEGG富集于细胞衰老、Wnt、MAPK、Hippo、AMPK、mTOR、胰岛素信号、黏附斑和肌动蛋白骨架等通路；qRT-PCR验证miR-103a-3p是Pyr-EVs中富集程度最高的miRNA。

3.2 Pyr-EVs经miR-103a-3p及其下游靶点诱导KGN细胞线粒体功能障碍与凋亡：M0-EVs和Pyr-EVs均可被KGN细胞内化；Pyr-EVs处理升高miR-103a-3p水平，并可被miR-103a-3p抑制剂逆转。与M0-EVs相比，Pyr-EVs处理组KGN细胞凋亡增加，线粒体功能受损（ROS和丙二醛（MDA）升高，线粒体膜电位、ATP和谷胱甘肽（GSH）降低），细胞衰老增强；联合miR-103a-3p抑制剂可显著减轻上述功能损伤；转染miR-103a-3p抑制剂的巨噬细胞来源Pyr-EVs诱导KGN细胞凋亡、线粒体功能障碍和衰老的能力明显减弱。转染miR-103a-3p模拟物的KGN细胞RNA-seq显示9558个差异表达mRNA（6160个上调、3398个下调），下调基因的GO富集涉及蛋白翻译与核糖体生物发生、细胞周期与有丝分裂调控、DNA复制与损伤修复及线粒体能量代谢，KEGG富集于核糖体、细胞周期和DNA复制通路。将DIANA、miRDB和TargetScan预测的285个miR-103a-3p下游基因与下调差异表达mRNA及MitoCarta3.0线粒体基因取交集，得到MFN2和BCL2L13两个潜在靶点。

3.3 人卵泡液EVs中miR-103a-3p水平与卵巢储备及ART结局相关：DOR组卵泡液EVs粒径显著大于NOR组、浓度更高，与Pyr-EVs相似；DOR组卵泡液EVs和颗粒细胞中miR-103a-3p表达显著升高；DOR患者颗粒细胞ATP降低，ROS和MDA升高，MFN2和BCL2L13 mRNA及蛋白表达显著降低，BCL2、FSH和CYP11A1降低而BAX和LHCGR升高，衰老相关分泌表型（SASP）标志物IL6、IL8 mRNA及p16、p21蛋白升高。多因素线性回归显示仅研究分组与miR-103a-3p表达独立相关，Gn剂量和年龄无显著关联；校正年龄后，miR-103a-3p与血清AMH、AFC和高品质胚胎数呈负相关，与获卵数、受精卵数和胚胎数呈负相关，与扳机日血清雌二醇（E₂）水平呈正相关；基础FSH、基础黄体生成素（LH）、基础E₂、扳机日LH和孕酮与miR-103a-3p无独立关联。ROC曲线分析显示卵泡液EVs来源miR-103a-3p可有效区分DOR与NOR，曲线下面积（AUC）为0.9667（95% CI：0.9298–1.000，p<0.001）。

3.4 miR-103a-3p通过靶向抑制MFN2和BCL2L13诱导颗粒细胞线粒体功能障碍：双荧光素酶报告基因实验显示，miR-103a-3p显著降低MFN2-WT和BCL2L13-WT构建体的荧光素酶活性，而结合位点突变后活性不变；过表达miR-103a-3p显著降低MFN2和BCL2L13 mRNA及蛋白水平，抑制miR-103a-3p则显著升高其表达，证实二者为miR-103a-3p直接下游靶点。miR-103a-3p模拟物显著促进颗粒细胞凋亡，加重氧化应激损伤，表现为线粒体长宽比降低（提示线粒体碎片化增强）、ROS、线粒体ROS（mtROS）和MDA升高，线粒体膜电位、ATP和GSH降低；抑制剂组呈相反趋势。模拟物组细胞衰老增加，细胞上清E₂浓度显著降低而抑制剂组升高，SASP因子IL6、IL8 mRNA及p16、p21蛋白升高，类固醇生成相关因子CYP11A1、FSHR、LHCGR表达改变。上述结果提示miR-103a-3p过表达诱导颗粒细胞凋亡、线粒体功能障碍、E₂分泌受损和细胞衰老。

3.5 过表达MFN2和/或BCL2L13可逆转氧化应激条件下miR-103a-3p诱导的颗粒细胞功能障碍：研究人员用3-硝基丙酸（3-NP，线粒体复合物II抑制剂）诱导颗粒细胞氧化应激，确定最佳浓度为10 mM，模型建立成功，表现为凋亡增加、ATP和GSH降低、线粒体膜电位下降、ROS、mtROS、MDA升高和线粒体肿胀。在氧化应激条件下于miR-103a-3p模拟物转染的颗粒细胞中过表达MFN2、BCL2L13或二者联合（M/B-OE），可有效挽救miR-103a-3p模拟物诱导的不良效应：显著减少凋亡，恢复线粒体形态（长宽比增加、丝状线粒体网络增强），降低ROS、mtROS和MDA并恢复GSH、线粒体膜电位和ATP；联合过表达对线粒体膜电位和ATP的恢复显著优于单基因挽救，而对ROS、mtROS、MDA和GSH无额外改善，提示两靶点的协同作用主要与线粒体生物能量功能相关；上述处理还显著减轻细胞衰老并增加培养上清E₂分泌，线粒体功能、凋亡和类固醇生成相关分子mRNA及蛋白表达相应恢复。结果提示恢复MFN2和BCL2L13可有效对抗miR-103a-3p诱导的线粒体功能障碍和颗粒细胞损伤，二者联合恢复对线粒体生物能量恢复有额外获益。

3.6 抑制miR-103a-3p改善小鼠氧化应激诱导的卵巢损伤：通过腹腔注射AAV9介导的miR-103a-3p抑制剂沉默小鼠卵巢miR-103a-3p，并以3-NP建立氧化应激模型。氧化应激不影响体重，但组织学分析显示OS组原始卵泡、初级卵泡和黄体比例显著降低、闭锁卵泡显著增加，血清E₂和AMH显著降低、FSH和LH升高，动情周期紊乱；AAV-miR-103a-3p抑制剂组E₂、AMH及原始卵泡和初级卵泡比例显著升高，FSH、LH和闭锁卵泡比例显著降低。抑制miR-103a-3p还降低mtROS、ROS和MDA水平，升高ATP和GSH活性，TEM显示线粒体碎片化和肿胀明显减少；TUNEL检测显示AAV抑制剂组凋亡细胞显著减少；miR-103a-3p抑制显著升高MFN2和BCL2L13 mRNA及蛋白表达，并恢复卵巢组织中凋亡、衰老和类固醇生成相关基因与蛋白表达。结果提示抑制miR-103a-3p通过恢复线粒体完整性、减少凋亡和正常化颗粒细胞类固醇激素合成，改善氧化应激诱导的卵巢功能障碍。

讨论部分总结：本研究从免疫炎症调控和细胞间通讯角度，为焦亡巨噬细胞如何促进颗粒细胞线粒体功能障碍并参与卵巢衰老提供机制见解。与既往报道的卵巢衰老相关miRNA多在颗粒细胞或卵母细胞内产生并通过细胞自主机制发挥作用不同，本研究证明miR-103a-3p来源于焦亡巨噬细胞并经EVs转移至颗粒细胞，支持存在既往未被认识的免疫-卵巢通讯轴。单细胞分析显示衰老卵巢巨噬细胞焦亡信号显著增强，提示卵巢免疫微环境由稳态向促炎表型转变；焦亡巨噬细胞不仅通过细胞因子分泌介导炎症，还通过释放EVs参与细胞间通讯，可能对卵巢微环境产生更持久的调控作用。但研究未确定巨噬细胞焦亡是DOR进展的始动事件还是继发于卵巢损伤，二者可能构成放大卵巢炎症与功能障碍的正反馈环路；驱动焦亡巨噬细胞中miR-103a-3p富集的上游机制尚待研究，焦亡与炎症小体相关信号通路尤其是NLRP3和NF-κB激活密切相关，miR-103a-3p亦参与NF-κB相关炎症调控，提示炎症驱动的miRNA重编程可能参与EVs介导的细胞间信号传递。机制层面，Pyr-EVs可被颗粒细胞高效内化，导致线粒体功能障碍、凋亡和细胞衰老，miR-103a-3p是Pyr-EVs中的关键效应分子，抑制miR-103a-3p可显著减轻Pyr-EVs诱导的颗粒细胞损伤。氧化应激通过ROS过度积累和抗氧化防御受损参与卵巢衰老和卵泡过早闭锁，颗粒细胞作为支持卵泡发育和卵母细胞成熟的主要体细胞对氧化损伤尤为敏感，氧化还原稳态破坏导致线粒体功能障碍、凋亡通路激活和类固醇生成受损，最终损害卵母细胞质量与发育潜能；本研究提示EVs介导的miR-103a-3p递送加剧氧化应激相关线粒体功能障碍，从而促进颗粒细胞损伤。与miR-484抑制SESN2、miR-642a-5p靶向FOXO1、miR-138-5p通过下调SIRT1促进颗粒细胞凋亡等既往研究不同，miR-103a-3p可能既是细胞内应激反应调控因子，也是免疫来源的信号分子，这种非细胞自主机制拓展了对免疫细胞来源EVs-miRNA参与卵巢衰老与DOR的认识。临床上，DOR患者卵泡液EVs中miR-103a-3p显著升高，与AMH、AFC和胚胎发育结局负相关，支持其作为卵泡液卵巢储备与生殖结局指标的潜力，但作为临床生物标志物仍需更大队列验证。MFN2在维持线粒体动力学和类固醇生成中起重要作用，其表达降低与卵巢功能障碍和卵泡过早衰竭密切相关；BCL2L13作为线粒体自噬受体调控线粒体稳态。功能数据显示，miR-103a-3p过表达通过同时抑制MFN2和BCL2L13促进线粒体碎片化、线粒体自噬受损和ROS过度积累，导致颗粒细胞凋亡、衰老样改变和雌激素分泌减少；联合恢复MFN2和BCL2L13对线粒体膜电位和ATP的恢复优于单基因恢复，支持二者在线粒体生物能量维持中的协同作用，而联合挽救对氧化应激相关参数无额外改善，提示在当前实验条件下恢复任一靶点即可基本重建氧化还原稳态。该机制不同于主要调控凋亡或抗氧化通路的既往卵巢miRNA，miR-103a-3p通过同时靶向MFN2和BCL2L13，将免疫来源EVs信号与线粒体动力学和线粒体自噬联系起来。转化层面，卵泡液EVs可在辅助生殖操作中方便获取且货物相对稳定，EVs相关miR-103a-3p有望作为候选卵泡液指标和治疗靶点，antagomir、AAV介导抑制或EVs递送系统等治疗策略可实现靶向调控，但递送特异性、脱靶效应和长期安全性仍需解决。体内实验显示抑制miR-103a-3p改善小鼠卵巢线粒体结构与功能、恢复卵泡发育并部分正常化激素平衡；与常规抗氧化治疗相比，miRNA靶向干预可能作用于更上游的调控层面，提供更具机制基础的治疗策略。研究局限性包括：系统性AAV递送缺乏细胞类型特异性，可能转导包括卵母细胞在内的其他卵巢细胞类型，因此卵巢功能改善不能完全归因于颗粒细胞；研究未确定巨噬细胞焦亡、EVs介导miR-103a-3p转移与颗粒细胞功能障碍在体内的时序关系，需谱系追踪或时间进程分析；EVs还携带蛋白质和脂质等生物活性分子，其对颗粒细胞功能障碍的潜在贡献尚待阐明；焦亡巨噬细胞的动态变化及其与其他免疫细胞群的相互作用尚不完全清楚；连接MFN2和BCL2L13失调与线粒体动力学和线粒体自噬的下游信号机制未全面研究；研究基于3-NP诱导的急性氧化应激模型，不能完全再现人类DOR的慢性和异质性进展，3-NP主要通过化学抑制诱导线粒体功能障碍，可能不能完全反映体内EVs介导线粒体损伤的复杂病理过程，需在更接近DOR临床病理生理的互补动物模型（如化疗诱导的早发性卵巢功能不全或自然衰老小鼠）中进一步验证。

研究结论翻译：总之，本研究鉴定了一种分子机制，即焦亡巨噬细胞可能通过EVs介导的miR-103a-3p递送，抑制MFN2和BCL2L13并破坏颗粒细胞线粒体稳态，从而促进卵巢功能障碍。这些发现拓展了对DOR中免疫-卵巢通讯的认识，并支持EVs相关miR-103a-3p作为候选卵泡液指标和治疗靶点的潜力，同时需在更多实验模型和临床研究中进一步验证。