《Aging Cell》：Constitutive Activation of Skeletal Muscle mTORC1 Drives Pro-Inflammatory Gene Expression in Skeletal Muscle of Aged Mice
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骨骼肌中mTORC1活性随衰老而升高，并被认为是年龄相关肌肉健康下降的潜在驱动因素。虽然药理学抑制mTORC1可改善寿命和健康寿命，但慢性mTORC1激活是否足以加速骨骼肌衰老仍不清楚。研究人员旨在利用肌肉特异性敲除Depdc5（编码含DEP结构域蛋白5，DE
骨骼肌中mTORC1活性随衰老而升高，并被认为是年龄相关肌肉健康下降的潜在驱动因素。虽然药理学抑制mTORC1可改善寿命和健康寿命，但慢性mTORC1激活是否足以加速骨骼肌衰老仍不清楚。研究人员旨在利用肌肉特异性敲除Depdc5（编码含DEP结构域蛋白5，DEPDC5，mTORC1的负调控因子）的可诱导模型来解决这一问题。在27月龄小鼠中，Depdc5敲除诱导炎症和免疫相关基因的强烈上调，并伴随代谢和血管生成通路的改变。此外，Depdc5敲除小鼠表现出TNF-α蛋白表达增加。然而，这些转录和蛋白质变化与巨噬细胞表型改变或肌肉毛细血管密度变化无关。饮食中添加雷帕霉素部分逆转了mTORC1信号传导及部分转录变化（包括与血管生成相关的变化），但未抑制炎症相关转录本或蛋白质表达。这些发现表明，mTORC1的组成性激活足以驱动老年骨骼肌的促炎变化，加剧了衰老过程中已经发生的炎症。
**研究背景与问题**
骨骼肌中雷帕霉素机制靶点复合物1（mTORC1）是生长、代谢和蛋白质周转的核心调控因子。在进食状态下骨骼肌mTORC1活性升高，禁食期间降低，这种振荡性活动对细胞稳态至关重要。然而在衰老过程中，基础mTORC1活性升高，被认为在年龄相关肌肉健康下降中发挥关键作用。虽然已知药理学抑制mTORC1可改善肌肉健康以及整体健康寿命和寿命，但衰老过程中mTORC1活性升高是否足以加速骨骼肌衰老表型尚不清楚。研究人员此前报道，肌肉特异性敲除Depdc5（编码含DEP结构域蛋白5，DEPDC5）可增加mTORC1信号传导，伴随轻度肌肉肥大，但肌肉力量或运动能力并未改善。这些发现提出了一个问题：慢性mTORC1激活（如衰老中所观察到的）是否会诱导肌肉中的适应不良变化，从而抵消持续合成代谢的潜在益处。鉴于衰老与低度慢性炎症（常称为"炎症衰老"，inflammaging）之间已确立的联系，研究人员假设Depdc5敲除（KO）小鼠的骨骼肌会表现出类似衰老肌肉的炎症转录谱。此前发表在9月龄小鼠中的工作显示，Depdc5敲除增加了炎症和免疫反应相关基因表达，增加了促炎细胞因子IL-6和TNF-α的蛋白表达，并使巨噬细胞向M2样表型偏移。在本研究中，研究人员试图将这些发现扩展到27月龄小鼠，将可诱导性Depdc5敲除与饮食雷帕霉素治疗相结合，以确定雷帕霉素是否能逆转老年骨骼肌中组成性活跃mTORC1驱动的炎症基因表达特征。为进一步评估这些发现与生理性衰老的相关性，研究人员还检查了年轻和老年普通狨猴骨骼肌中的炎症转录特征，包括长期接受雷帕霉素治疗的老年队列。
**主要技术方法**
研究人员在22月龄雌性和雄性C57BL/6j小鼠中通过他莫昔芬诱导敲除Depdc5，继续饲养5个月至27月龄，期间部分小鼠喂食含14 ppm雷帕霉素的饮食。采用蛋白质印迹法检测mTORC1下游靶点磷酸化及炎症相关蛋白表达；对腓肠肌进行mRNA测序及基因集富集分析（GSEA）；采用免疫组织化学（IHC）检测巨噬细胞标志物F4/80和CD206以及毛细血管密度；另外对年轻、老年及雷帕霉素治疗的老年普通狨猴（来源：UT Health San Antonio Barshop研究所）骨骼肌进行转录组分析。
**研究结果**
*Depdc5敲除增加老年小鼠mTORC1下游靶点磷酸化，雷帕霉素部分恢复*：研究人员观察到Depdc5敲除后mTORC1下游靶点磷酸化明显增加，雷帕霉素部分逆转了这一变化。同时观察到KO后部分自噬蛋白表达改变，雷帕霉素治疗部分逆转。骨骼肌重量方面，仅在趾长伸肌（EDL）中观察到组间统计学差异，其余肌肉未达显著性。
*Depdc5敲除增加炎症、免疫反应和肌肉适应相关基因表达，降低血管生成相关表达，雷帕霉素部分逆转*：mRNA测序显示Depdc5敲除引起基因表达大幅变化。在KO小鼠中差异调控的238个基因中，89个被雷帕霉素逆转。GSEA分析表明KO小鼠炎症和免疫反应相关表达增加，与先前在9月龄小鼠中的报道相似。值得注意的是，尽管雷帕霉素是已知的免疫抑制剂，炎症谱并未被雷帕霉素强烈逆转。同时观察到Depdc5敲除后血管生成相关基因表达降低，雷帕霉素治疗逆转了这一变化。
*Depdc5敲除增加TNF-α蛋白表达，但不改变肌肉切片中巨噬细胞浸润或表型*：研究人员未观察到IL-6蛋白表达的显著变化，但KO小鼠总TNF-α显著增加，且雷帕霉素未逆转。17 kD TNF-α条带（裂解产物及活跃分泌的细胞因子）也 apparent增加。Il6和Tnf的mRNA水平组间无差异，提示蛋白表达差异以转录后方式调控。通过免疫组织化学使用F4/80（全巨噬细胞标志物）和CD206（M2样巨噬细胞标志物）测量总巨噬细胞含量和M2样巨噬细胞含量，尽管mRNA和蛋白水平炎症标志物发生变化，巨噬细胞数量或表型未见变化。这与先前9月龄小鼠中Depdc5敲除后向M2样表型偏移的报道相反。
*Depdc5敲除不改变骨骼肌切片中毛细血管密度*：尽管KO后内皮细胞相关mRNA表达明显降低（如Pecam1，编码内皮细胞标志物CD31），且雷帕霉素给药可逆转，但毛细血管密度未见变化。这表明在老年小鼠中，mTORC1活性变化不足以驱动毛细血管化改变，尽管基因表达发生了改变。
*生理性衰老和mTORC1抑制对狨猴骨骼肌炎症的影响*：对年轻和老年普通狨猴（包括长期雷帕霉素治疗的老年队列）骨骼肌的转录组分析显示，衰老与炎症和免疫反应相关基因表达增加相关，雷帕霉素治疗降低了炎症通路表达。这些发现提供了额外证据表明炎症转录变化伴随生理性衰老，且mTORC1抑制可在衰老背景下改善炎症。
**讨论与结论**
众所周知，降低mTORC1活性是改善小鼠寿命和健康寿命的潜在靶点，且降低mTORC1活性通常与炎症减少相关。然而，降低mTORC1活性并不总是与炎症减少相关，表明mTORC1的作用是微妙的。在骨骼肌中，mTORC1活性随年龄增加，提示其可能是年龄相关肌肉健康变化的潜在驱动因素。大多数先前研究仅关注mTORC1抑制作为改善健康和长寿的潜在靶点，很少有研究测试增加mTORC1活性是否足以驱动或加剧衰老表型。
本工作为mTORC1在炎症和衰老骨骼肌中的作用提供了新见解。Depdc5敲除驱动炎症的假设是合理的，因为先前工作已显示同时种系敲除Tsc1和Depdc5足以驱动早期骨骼肌肌病、心脏和膈肌功能障碍以及自噬抑制，伴随肌肉炎症大幅增加。此外，单独Tsc1敲除足以在12月龄小鼠中驱动骨骼肌萎缩，伴随自噬受损，且雷帕霉素治疗部分可逆。研究人员最近也报道了成年小鼠中Depdc5敲除可驱动炎症。然而，本工作提供了额外证据表明mTORC1激活即使在老年骨骼肌中也可驱动炎症。
关于Depdc5敲除作为激活mTORC1的方法，Depdc5编码的DEPDC5是GATOR1蛋白复合物的组分之一，该复合物通过与Rag GTPases相互作用负调控mTORC1活性。GATOR1在氨基酸不足期间变得活跃，导致mTORC1活性抑制。因此，Depdc5敲除通过营养感知通路激活mTORC1。衰老骨骼肌中mTORC1激活的原因没有单一明确机制。因此，研究不同mTORC1激活模型如何影响衰老和代谢疾病背景下的骨骼肌健康非常重要。研究人员并不认为Depdc5敲除是激活mTORC1的唯一或最佳模型，因为有许多方法可以实现这一点，包括已建立的模型如Tsc1敲除。然而，鉴于Depdc5敲除似乎具有与Tsc1敲除不同的表型，该模型提供了补充现有其他模型所得信息的重要信息。此外，DEPDC5所属的氨基酸感知通路与衰老相关，因为氨基酸限制已被证明可改善啮齿动物和其他模式生物的健康寿命和寿命。
关于衰老背景下mTORC1激活诱导的炎症，衰老本身与骨骼肌炎症增加相关，这种年龄相关炎症状态是骨骼肌衰老和功能下降的重要组成部分。因此，Depdc5敲除在27月龄小鼠中增加炎症基因和蛋白表达的发现可以解释为在已经衰老的肌肉环境中叠加了额外的炎症刺激。实际上，老年小鼠研究已证明骨骼肌中炎症信号增加，而最近的工作进一步将年龄相关炎症与mTORC1活性增加联系起来。研究人员的发现扩展了这些观察，证明实验性增加mTORC1活性超过年龄匹配对照水平足以进一步增加老年骨骼肌中的炎症信号。这一区别很重要，因为它表明升高的mTORC1活性可能有助于放大年龄相关炎症，而不是作为生理性衰老过程中发展出的炎症状态的唯一原因。同时，Depdc5敲除后肌肉大小、毛细血管密度或巨噬细胞丰度没有实质性变化，表明这种额外炎症信号单独可能不足以加剧生理性衰老的更广泛结构后果。
鉴于雷帕霉素的免疫调节作用，研究人员预期用雷帕霉素治疗也会观察到炎症基因的完全或部分逆转。然而，在KO小鼠中未观察到雷帕霉素对炎症基因或蛋白的明显减少。这很有趣，因为研究人员在雷帕霉素治疗的狨猴中观察到炎症明显减少，进一步表明mTORC1在年龄相关肌肉炎症中发挥作用。雷帕霉素可能未逆转KO小鼠炎症的部分原因是雷帕霉素仅部分抑制mTORC1，因为4E-BP1磷酸化未被雷帕霉素降低。这一发现与其他数据基本一致，表明雷帕霉素可能不会同等阻止所有mTORC1靶点的磷酸化。此外，研究人员预期Depdc5敲除增加炎症的部分原因是骨骼肌中巨噬细胞浸润的变化，或巨噬细胞表型向更促炎方向的偏移。与其假设相反，研究人员在老年小鼠中未观察到Depdc5敲除或雷帕霉素对巨噬细胞数量或表型的影响。这与先前发现9月龄KO小鼠相比对照组向M2样巨噬细胞极化显著偏移不同。此外，雷帕霉素抑制mTORC1已被证明可引起向更M1样巨噬细胞表型的偏移。有趣的是，有报道称衰老降低小鼠M1:M2比值，但这在很大程度上与人类中通常发生的情况相反。这种差异的部分原因可能是将巨噬细胞简单分类为M1或M2类别过度简化了这些细胞在生理学中占据的各种角色和生态位。无论如何，在老年小鼠中，研究人员未观察到Depdc5敲除或雷帕霉素对巨噬细胞数量或表型的影响。
关于血管生成和毛细血管密度，研究人员观察到Depdc5 KO小鼠相比WT血管生成和内皮细胞相关基因表达降低，这与先前在9月龄小鼠中的观察一致。此外，雷帕霉素增加血管生成基因表达，提示mTORC1可能是血管生成变化的调控因子。尽管血管生成标志物有明显变化，但研究人员未观察到KO和WT动物之间毛细血管密度的变化，也未观察到雷帕霉素治疗对毛细血管密度的影响。干预持续时间可能不足以驱动毛细血管密度变化，或者基因表达更多与内皮功能相关而不一定与毛细血管含量相关。在人类受试者中，常有报道毛细血管密度随年龄下降，且这些下降与肌肉功能和运动训练反应性下降强烈相关。然而，应注意这一发现并不总是一致，可能部分是由于分析技术的局限性。无论如何，本研究结果表明mTORC1的组成性激活单独可能不足以降低毛细血管密度。
研究结论：研究人员的发现表明，骨骼肌中mTORC1的组成性激活足以在老年骨骼肌中诱导强烈的促炎转录程序。应考虑本工作的几个局限性。首先，免疫细胞动态的评估主要依赖于巨噬细胞丰度和极化的免疫组织化学标志物，可能无法完全捕捉功能异质性或免疫细胞亚群的细微变化。其次，尽管雷帕霉素部分抑制了mTORC1信号传导，但对下游靶点（如4E-BP1磷酸化）的不完全抑制限制了研究人员确定更完全的mTORC1抑制是否会产生不同炎症结果的能力。此外，本研究未具备检测性别差异的统计效力。然而，Depdc5敲除反应中可能存在性别二态性。也可能存在与Depdc5敲除相关的mTORC1非依赖效应，因为DEPDC5已被报道在大脑中具有mTORC1非依赖作用。另一个重要考虑是Depdc5敲除在老年肌肉中诱导的额外炎症信号是否具有功能后果。虽然研究人员观察到Depdc5敲除对骨骼肌质量的微小影响，但肌肉质量本身不一定反映肌肉质量或功能。实际上，研究人员先前使用相同Depdc5敲除模型的工作表明，增加的mTORC1活性和肌肉肥大并未伴随肌肉收缩或身体功能的改善。然而，本研究不包括肌肉功能测量，因此无法确定27月龄KO小鼠中观察到的额外炎症表型是否与肌肉力量、收缩功能或身体表现受损相关。这是解释KO小鼠缺乏明显肌肉萎缩表型时的重要局限性。未来纳入肌肉力量、收缩功能和身体表现测量的研究将有必要确定Depdc5敲除诱导的炎症表型是否有助于老年骨骼肌的功能下降。研究人员也未对不同骨骼肌进行直接比较，这限制了确定Depdc5敲除是否以纤维类型特异性方式改变炎症的能力。最后，年龄和基因型的独立效应在当前实验设计中无法完全区分，未来在相同条件下直接比较年轻和老年敲除小鼠的研究将有必要解决这一问题。尽管存在这些局限性，本工作提供了重要证据表明升高的mTORC1在衰老背景下驱动骨骼肌炎症基因表达。
