《Developmental Dynamics》：A single base-pair variation in a limb-specific Lhx9 cis-regulatory region modulates HAND2-associated posterior repression
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LIM同源盒9（Lhx9）是一个参与脊椎动物肢体发育的转录因子。尽管其前部表达具有保守性，但其远端表达具有物种特异性。在鸡中，远端表达局限于前部中胚层；在小鼠中，远端表达延伸至后部中胚层。研究人员鉴定并表征了一个肢体特异性Lhx9相关顺式调控模块（CRM），L
LIM同源盒9（Lhx9）是一个参与脊椎动物肢体发育的转录因子。尽管其前部表达具有保守性，但其远端表达具有物种特异性。在鸡中，远端表达局限于前部中胚层；在小鼠中，远端表达延伸至后部中胚层。研究人员鉴定并表征了一个肢体特异性Lhx9相关顺式调控模块（CRM），LARR9A。在鸡肢体生物检测中，鸡LARR9A在远端前部肢体中胚层中具有活性，而小鼠LARR9A在前部和后部均有活性。HAND2是一个在后部表达的转录因子，与鸡LHX9的前部表达互补。在鸡肢体中异位表达Hand2可抑制LHX9表达和鸡LARR9A活性。研究人员在鸡LARR9A中鉴定了一个额外的小鼠中缺失的HAND2结合位点（E-box 5′C）。该E-box的存在与否由一个核心核苷酸的单碱基变异（A/C）所致。将E-box引入小鼠LARR9A后，在鸡肢体生物检测和转基因小鼠中均使活性从Hand2结构域中排除。尽管小鼠LARR9A在鸡生物检测中表现出后部活性，但在转基因小鼠中并未如此，表明需要额外的后部调控才能完全解释物种特异性Lhx9表达。尽管如此，研究人员的数据表明LARR9A中的单碱基变异与差异性的Hand2调控抑制相关。
**研究背景与意义**
在脊椎动物肢体发育过程中，三个LIM同源域转录因子——Lmx1b、Lhx2和Lhx9——协同协调沿三个发育轴的发育与模式化。LIM同源域蛋白的特征在于具有一个DNA结合域和两个LIM蛋白结合域，赋予其连接伴侣蛋白和调控区域以协调时空基因表达的能力。Lmx1b表达于背侧中胚层，是背腹轴的主要调控因子。Lhx2表达于顶外胚层嵴（AER）下方的远端中胚层，在调控近远轴生长和模式化中发挥作用。Lhx9沿前部边界表达，被认为在调控前后轴和近远轴模式化中发挥作用。尽管鸡和鱼的Lhx9表达局限于肢体/鳍的前部边界，但小鼠的Lhx9表达还向远端延伸至后部中胚层，与Lhx2表达域及分泌关键信号分子Shh的极化活性区（ZPA）重叠。物种间表达模式的差异可能既与功能改变有关，也与调控变化有关。例如，在果蝇某一亚种中，雄性翅膀上黑斑的出现是由色素基因的异位表达所致，该基因的表达由一个翅膀特异性增强子中的核苷酸变异驱动，该变异增加了两个新的结合位点。因此，评估相关调控模块可以揭示基因如何被招募用于额外的功能。本研究通过鸡和小鼠模型探索了调控物种特异性Lhx9表达的机制。研究人员鉴定并表征了一个Lhx9的肢体特异性顺式调控模块（CRM）。该Lhx9相关CRM在鸡中具有一个Hand2结合位点，而由于单碱基改变在小鼠中缺失。研究人员进一步确定Hand2负责鸡中LHX9的限制性表达。
**关键技术方法**
研究人员通过比较基因组学分析Lhx9启动子上游和下游各500Kb（共1Mb）的非编码区域，利用Multiz Alignments鉴定保守区域，并结合公共染色质标记ChIP-seq数据（RNAP2、Med12、P300、H3K27ac、H3K4me2、H3K27me3）、ATAC-seq数据和Hi-C数据筛选候选CRM。利用JASPAR数据库预测转录因子结合位点。功能验证采用鸡胚肢体局限微电穿孔（CMEP）生物检测、定点诱变、全胚胎原位杂交（WMISH）、视黄酸（RA）珠植入实验以及转基因小鼠（H11位点整合LacZ报告构建体）模型。荧光活性通过FIJI软件定量并以单因素方差分析和Tukey's HSD检验进行统计分析。Hi-C数据分析使用了公共数据集GSE116791（小鼠E11.5肢芽）和GSE96037（鸡胚胎成纤维细胞）。
**研究结果**
**Lhx9位点内潜在顺式调控模块区域的鉴定**：通过比较基因组学分析，在Lhx9上下游约1Mb范围内鉴定了23个潜在CRM。经染色质标记筛选，9个候选区域（CRM 1、5、?1、?3、?6、?10、?11、?13和?16）与四个或以上活跃标记相关。Hi-C分析显示所有9个候选区域与Lhx9启动子均有强相互作用，且位于Lhx9拓扑关联域（TAD）内的两个亚TAD区域中。ATAC-seq数据显示CRM（?11）是该区域可及性最高的位点。综合保守性、染色质特征、TAD域内预测相互作用和可及性，CRM（?11）被选为功能测试的主要候选。
**CRM（?11）活性反映Lhx9的物种特异性表达**：在HH23期鸡胚肢体中，鸡CRM（?11）在前部肢体中显示一致且强烈的活性，后部无活性（n=30/34前部；n=29/31后部）。而相应的小鼠CRM（?11）在前部和后部远端肢体中胚层中均显示强烈活性（n=31/31前部；n=25/29后部），与Lhx9的物种特异性表达模式一致。CRM（?11）随后被重命名为LARR9A（Lhx9相关调控区域—前部）。LARR9A位于Dennd1b基因第12内含子中。鸡LARR9A为378bp区域，位于LHX9启动子上游135kb处；小鼠LARR9A为375bp区域，位于上游262kb处。
**LARR9A中单碱基突变调控鸡后部肢体中胚层活性**：通过JASPAR分析发现，LARR9A含有多个肢体发育相关转录因子（如Meis、Pbx、Ets）的结合基序，但这些位点在鸡和小鼠序列间无变异。相比之下，E-box（basic helix-loop-helix转录因子如Hand2的结合位点）数量存在差异。小鼠LARR9A含有三个E-box基序（5′-CANNTG-3′），其序列在鸡中保守。两个位于5′区域（E-box 5′A和E-box 5′B），第三个位于3′端（E-box 3′）。然而，鸡LARR9A在5′区域含有一个额外的E-box（E-box 5′C）。进一步分析揭示，基序核心核苷酸的单碱基变异（A/C）分别导致该E-box的存在或缺失。通过定点诱变将E-box（C>A）引入小鼠LARR9A后，后部肢体中胚层活性消失而前部活性维持（n=16/18前部；n=20/21后部）。同样，去除鸡LARR9A中的E-box（A>C）使活性延伸至后部肢体中胚层（n=10/10前部；n=22/27后部），但活性强度不如小鼠LARR9A在后部中胚层中的活性。对额外脊椎动物的分析发现，所检测的哺乳动物缺乏该E-box，而非哺乳动物脊椎动物保留该E-box（包括腔棘鱼），通过所鉴定的“A”变异实现。
**Hand2抑制LHX9表达和鸡LARR9A活性**：在早期肢体发育中，LHX9的前部限制与另一个转录因子HAND2的后部表达互补。Hand2在后部肢体轴建立和ZPA维持中发挥关键作用，通过调控Shh表达实现。通过CMEP在鸡前部肢体边缘过表达Hand2，WMISH显示异位Hand2导致LHX9表达显著降低（n=12/12），且在SHH诱导之前（n=5/5）。未检测到LHX9降低区域中SHH的上调。利用视黄酸（RA）作为替代方法支持HAND2与LHX9抑制之间的关系：RA应用后18h首先检测到HAND2，21h时LHX9抑制明显，而SHH诱导在24h才可见（n=2/7），进一步支持HAND2而非SHH是LHX9的抑制因子。共转染鸡LARR9A报告构建体与Hand2表达载体，异位Hand2表达导致鸡LARR9A活性显著降低（p<.05；n=24/26鸡LARR9A；n=21/21鸡LARR9A+Hand2共转染；n=7/7阴性对照tk-eGFP）。
**小鼠LARR9A活性在转基因小鼠中局限于前部肢体**：研究人员构建了鸡LARR9A、小鼠LARR9A和小鼠LARR9A+E-box的LacZ-H11报告构建体并创建了转基因小鼠。在E11.5期，鸡LARR9A活性与鸡生物检测结果一致，远端前部边界与Hand2的前部边界对应（n=7/7）。小鼠LARR9A+E-box的远端边界模拟了鸡LARR9A的模式（n=3/4）。然而，天然小鼠LARR9A在E11.5期远端后部肢体中未显示活性，尽管在鸡生物检测中表现出强烈的后部活性。但其活性确实延伸超过了Hand2边界至中线，与指射线2–3一致（n=4/5）。
**肢体特异性CRM的比较分析**：鉴于小鼠LARR9A在鸡和小鼠生物检测中后部活性的意外差异，研究人员对LARR9A与两个已知在鸡和小鼠中具有一致后部活性模式的肢体特异性CRM（LARM1和ZRS）进行了比较性计算机分析。LARM1调控Lmx1b在后部背侧肢体中胚层中的表达，含有四个保守E-box，其中三个位于Hox结合位点5bp范围内，另一个与Ets结合位点相关，还有一个距离E-box、Hox或Ets结合位点超过50bp的单个Tcf7结合位点。ZRS调控ZPA内Shh的表达，含有三个鸡和小鼠间保守的E-box，两个位于Hox结合位点5bp范围内，另一个位于Ets位点20bp范围内，还含有四个Tcf7结合位点。相比之下，LARR9A没有预测的Hox或Tcf7结合位点，但三个保守E-box之一（E-box 3′）距离Ets结合位点9bp。三个CRM共享的模式是一个E-box与相邻Ets结合位点，这可能构成远端肢体调控语法的一部分。LARM1和ZRS具有与Hox结合位点相邻的E-box和孤立的Tcf7结合位点，而LARR9A中均缺失，这些差异特征可能编码了肢体特异性CRM中后部与前部的调控语法。尽管进行了比较分析，仍未鉴定出LARR9A中可解释后部中胚层物种相关活性差异的变异。
**讨论与结论**
在脊椎动物肢体发育中，Lhx9是参与前后轴模式化的基因网络中一个一致的成员。尽管Lhx9的参与具有保守性，但其表达模式在哺乳动物与非哺乳动物物种间存在差异，表明尽管遗传景观高度保守，调控存在差异。鸡和小鼠模型很好地代表了这种对比：在鸡中，LHX9维持尖锐的前部限制性表达域；在小鼠中，Lhx9延伸至远端后部中胚层，与其旁系同源基因Lhx2的表达域重叠，包括分泌Shh的ZPA。物种特异性基因调控和表达差异并不罕见，可以揭示基因功能的转变。例如，Kvon等人评估了Shh的肢体特异性调控区域ZRS，鉴定了一个与蛇类四肢丢失相关的17bp缺失，该ZRS改变也导致Shh表达缺失。同样，研究人员推测序列变异可能解释Lhx9表达模式的物种特异性差异。研究人员鉴定了LARR9A，一个位于Dennd1b基因第12内含子中的肢体特异性Lhx9相关CRM。在鸡肢体生物检测中，鸡LARR9A活性局限于前部肢体中胚层；小鼠LARR9A在前部中胚层也有活性，但在鸡后部中胚层中也强烈活跃，该模式与预期的Lhx9表达物种特异性差异一致。在寻找可能导致物种特异性活性模式的因素、结合位点和/或序列差异时，研究人员在鸡中鉴定了一个小鼠中不存在的额外E-box（5′C）。第二核心核苷酸（CANNTG）的单碱基变异（A或C）分别导致该E-box的存在或缺失。鸡生物检测中LARR9A的评估显示，小鼠LARR9A中的单碱基改变（C>A）引入E-box足以消除后部活性，表明该结合位点在调控其空间表达模式中发挥功能性作用。先前报道暗示Shh在非哺乳动物脊椎动物中调控Lhx9。虽然Lhx9理论上可在Shh信号阈值水平被抑制，但LARR9A的计算机分析未鉴定到传递Shh调控的Gli转录因子的结合位点。此外，这些报道中从Shh应用到评估的延长孵育时间（72h）不能排除Shh的中间靶标作为Lhx9抑制的近端调控因子。Hand2在Shh之前建立后部肢体极性，是一个优秀的替代候选。Hand2通过ZRS在后部中胚层上调Shh表达，但也通过正反馈维持环路被Shh上调。Shh对Hand2的上调也可以解释为什么Shh能够在延长的孵育期内抑制Lhx9表达。多条证据支持HAND2是鸡肢体中LHX9的近端调控因子：HAND2和LHX9的远端表达模式在肢体发育过程中密切互补；Hand2异位表达在SHH诱导之前抑制LHX9表达；Hand2与鸡LARR9A共表达导致增强子活性丧失。总体而言，这些数据表明HAND2而非SHH是前部LHX9限制的近端调控因子。与预期一致，小鼠LARR9A+E-box的活性在转基因小鼠中被Hand2边界限制，模拟了鸡LARR9A活性模式。相应地，研究人员预期天然小鼠LARR9A活性会延伸至后部结构域与ZPA重叠，但出乎意料的是并未如此。尽管天然小鼠LARR9A未延伸至后部结构域，但其活性确实延伸超过了Hand2边界。总体而言，这些发现表明LARR9A调控前部Lhx9表达。E-box 5′C赋予对Hand2增加的敏感性，确保LARR9A活性在鸡中不延伸超过远端前部结构域。在小鼠中，E-box 5′C可能不是必需的，因为Lhx9的表达不需要严格限制于前部结构域。研究结果还表明，与鸡相比，小鼠后部肢体中胚层需要额外的CRM来实现Lhx9后部表达与ZPA重叠。Hand2通过E-box 5′C介导调控的差异可能为先前研究报道Shh可在鸡和鱼中下调Lhx9而在小鼠中不能提供解释。与鸡中的表达类似，鱼中Lhx9表达局限于发育中胸鳍的前部。由于某些鱼类基因组注释稀少，难以鉴定相应的LARR9A区域，但A. burtoni的Dennd1b第12内含子序列含有相同的E-box 5′C基序。值得注意的是，斑马鱼序列编码的是D-box而非E-box，但斑马鱼中存在的序列先前已在EMSA实验中表征为结合Hand2。因此，未来在鱼和其他非哺乳动物模型中对Hand2和E-box 5′C的研究可能产生超出当前Shh研究的进一步机制见解。果蝇基因apterous在翅膀生长和模式化中的功能在脊椎动物肢体中由三个相关的LIM同源域转录因子完成。Lmx1b表达于背侧中胚层，控制背腹轴模式化。Lhx2表达于邻近AER的远端中胚层，调控肢体生长。Lhx9沿前部肢体边缘表达，参与前后轴模式化。然而，Lhx9的精确作用一直难以进行功能表征，部分原因是大多数研究在小鼠中进行，而小鼠将Lhx9招募为备份LIM同源域转录因子。在小鼠中，有证据表明ZPA内的Lhx9和Lhx2对于将ZRS锚定到Shh启动子至关重要，这一在哺乳动物中似乎具有足够优先级的功 Necessitated了额外LIM同源域转录因子的招募。需要进一步工作来解开Lhx9在前部肢体模式化中的作用与Lhx9和Lhx2之间的冗余功能。研究人员的发现表明鸡和/或鱼可能是揭示这一前部作用的更好模型。
