光适应状态叶绿素荧光特征作为植物叶片相对含水量指标的研究

《Applications in Plant Sciences》：Characteristics of chlorophyll fluorescence in the light-adapted state as indicators of plant leaf relative water content

　　

光适应状态下的叶绿素荧光（ChlF）是植物水分状态的便捷指标，但严重依赖于非光化学淬灭（NPQ）。通过降低NPQ效应可增强ChlF作为指标的实用性。研究人员以拟南芥（Arabidopsis thaliana）和菠菜（Spinacia oleracea）叶片为材料，在叶片样品逐步失水过程中测定ChlF和相对含水量（RWC），随后重新构建ChlF特征并通过回归分析检验其作为RWC指标的可行性。结果表明，测定的NPQ存在变异，其本身并非植物叶片RWC的一致指标。以NPQ作为ChlF光化学效率指标的缩放因子，得到两个经NPQ校正的ChlF特征作为RWC指标：光系统II光化学淬灭（PSII PQ）和NPQ缩放的光系统II光化学效率（Y(II)′）。该结果在拟南芥中实验验证，随后在不同光照强度下于拟南芥中验证，最终在另一种植物（S. oleracea）中验证。进一步分析揭示了在不同RWC条件下稳态叶绿素荧光（Fs）与最大荧光（Fm′）之间的线性相关性，以及一个用于解释NPQ效应的时间常数。本研究表明，ChlF特征在失水过程中受NPQ影响，基于NPQ调整PSII效率指标可增强其指示植物水分状态的有效性。

**研究背景与问题**

水分在植物生长发育中具有不可替代的作用，尤其在光合代谢中扮演关键角色。叶片组织水分状态可通过减少气体交换、改变叶绿素含量和降低酶活性等途径显著影响光合作用。叶绿素荧光（ChlF）技术因快速、低成本而被广泛用于评估植物对水分亏缺胁迫的响应。在光系统II（PSII）性能分析中，常用基于三条能量路径的ChlF特征：光化学淬灭、非光化学淬灭（NPQ）和荧光发射。暗适应状态下的最大量子效率（Fv/Fm）在短期干旱中往往保持不变，且其与干旱胁迫的相关性密切关联于叶绿素含量，近期研究还发现Fv/Fm不能有效代表PSII光化学效率，这指向了光适应状态测量的必要性。光适应状态下的PSII量子效率Y(II)随水分亏缺胁迫增加而下降，但NPQ、光化学淬灭和ChlF共同分配总吸收光能，NPQ的程度必然影响ChlF特征及其作为光化学反应指标的有效性。NPQ与组织含水量之间的相关性可能并不持续稳定，尤其在干旱持续较长时间后，NPQ水平可能因叶绿素含量降低而下降。叶片发育阶段也是NPQ的影响因素。NPQ的变异若未被考虑，会直接增加ChlF特征的变异并降低Y(II)和ETR(II)等基于ChlF的指标作为植物水分状态指标的实用性。因此，研究人员在证明NPQ存在显著样品间变异使其成为RWC不一致指标之后，展示了在基于ChlF的PSII量子效率指标中考虑NPQ影响可增强其作为植物叶片水分状态指标的有效性。

**关键技术方法**

研究人员以拟南芥（Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.，生态型IS3731）和菠菜（Spinacia oleracea 'Correnta'）为材料，拟南芥在生长室培养（温度18°C，光照200 μmol/m²/s每天8 h，相对湿度30%），菠菜在温室11月至12月培养（温度16–21°C，自然光照3.5–3.9 kWh/m²/d每天10–11 h，相对湿度15–20%），每种植物5株作为5个重复。使用叶绿素荧光仪（OS5p+，Opti-Sciences）进行脉冲振幅调制（PAM）测量，所有样品每次测量前暗适应30 min。离体叶片经脱水处理逐步降低RWC，测定ChlF和叶片质量，RWC按（样品重量?干重）/（饱和重量?干重）×100%计算。采用回归分析评估ChlF特征与RWC的依赖性或相关性，以R²值作为度量，回归p值小于0.05视为显著依赖，方差分析显著性水平α=0.05。

**研究结果**

**样品间NPQ变异**：在相同生长条件和相同RWC下，5个拟南芥样品的ChlF响应和NPQ值存在差异。NPQ值在相同生长条件的样品间差异显著，Y(II)同样存在显著差异。NPQ与RWC的优化回归为线性但不显著（p=0.22），R²=0.05。

**构建变异降低的ChlF-RWC指标**：Y(II)随失水显著下降（R²=0.18，p=0.01），是可行的候选指标。由于NPQ是Y(II)的组分且样品间变异与RWC无一致关系，其增加了Y(II)的变异性。通过将Y(II)定义中的分母Fm′替换为Fs（基于Fs与Fm′的强线性相关），并乘以（1+NPQ）消除NPQ，推导出等同于传统定义的光化学淬灭（PQ）。PQ与RWC回归的R²=0.42（p<0.01），较Y(II)散点减少、R²增大。以NPQ作为乘数得到Y(II)′=Y(II)×NPQ，即NPQ缩放的光PSII量子效率，其R²=0.58（p<0.01），较Y(II)单独时散点减少、R²增大。需注意乘以NPQ并不使Y(II)′成为PQ的机制性准确表示，而是有效缩放以降低NPQ影响的指标。

**不同光照强度验证**：在不同光化光强度（750、1250、1750 μmol/m²/s）下，qP在所有三种光照强度下均不随RWC变化（R²<0.1，p>0.56），但平均qP值随光照强度增加从0.66降至0.48再降至0.41，Y(II)和Y(II)′值在较高光照强度下更低，指向较高光照下光抑制概率增加。PQ和Y(II)′在所有三种光照水平下均较Y(II)与RWC回归产生更大的R²值。

**不同物种适用性验证**：在菠菜中，NPQ单独与RWC无显著相关（R²=0.047，p=0.37），Y(II)与RWC呈显著正趋势（R²=0.56，p<0.01），PQ和Y(II)′均产生更强的R²值（均为R²=0.65，p<0.01）。拟南芥结果在菠菜中的可重复性表明PQ或Y(II)′具有评估不同植物物种叶片RWC的潜力。

**其他NPQ相关ChlF特征分析**：Fm′与Fs在失水过程中呈线性正相关，拟南芥和菠菜的线性回归R²均≥0.9，但斜率不同（拟南芥0.43，菠菜0.81），表明Fs-Fm′关系在物种内稳健但斜率具有物种依赖性。将ChlF从峰值下降近似为一阶指数曲线，主导时间常数τ从峰值后达到总衰减至Fs的63%所需时间估算。τ与NPQ呈适度但显著（p<0.05）的负相关，表明NPQ升高与ChlF下降加速及PSMT阶段较小时间常数相关。以τ除Y(II)得到Y(II)/τ作为Y(II)′的替代形式，其与RWC回归的R²从0.45提高至0.78。

**讨论与结论**

研究结果表明，同一时间相同条件下生长的植物NPQ存在相当大的变异，降低了ChlF特征作为叶片RWC指标的实用性。叶片RWC影响NPQ，但部分样品NPQ下降始于约90% RWC，而其他样品在RWC低至60%时才出现初始下降，这与田间测量中NPQ下降伴随5天干旱且RWC约60%至80%的观察一致。NPQ与RWC相关性不稳健提示该相关性取决于个体叶片特征，表明NPQ本身不是植物RWC的良好指标。其他研究亦证实ChlF行为的重大变异与氮或色素含量、叶片解剖特征和光学特性相关。栅栏叶肉厚度、叶绿体堆积密度、叶绿体分布和通过栅栏层的光程长度变化可改变PSII有效吸收截面并修改热耗散速率常数k_N，导致NPQ的幅度和动力学在样品间大幅变异。叶片发育阶段是栅栏叶肉厚度、叶绿体密度、色素浓度和叶黄素循环能力的已知决定因素，样品发育阶段的不均匀性影响k_N和NPQ。使用NPQ（常规测量或由其他相关变量如主要时间常数指示）构建NPQ缩放/调整的PSII量子效率指标如PQ、Y(II)′和Y(II)/τ，可在光照下降低变异并改善与RWC的相关性。qP与RWC相关性极小，尽管其随辐射水平增加而下降，表明光抑制程度在很大程度上不受RWC影响，这强调了在不同光照强度下利用Y(II)′或Y(II)/τ作为RWC指标的可行性。Fs与Fm′之间存在强线性相关但斜率在两种研究物种间不同，此斜率差异可能与各物种特定的解剖性状相关。研究还指出Equation 5的公式可能并非最优，因所用时间常数仅是对NPQ诱导的ChlF动力学变化的初步表征。本研究结果支持并印证了研究人员早期基于ChlF频域动态分析的工作，其中低频增益与NPQ强负相关而高频增益与RWC显著相关，从高频增益中减去低频增益以去除或降低NPQ变异影响可改善五种不同植物回归vs.RWC的R²值。本研究使用两种C3真双子叶植物测试所提出的NPQ调整ChlF指标，基于速率常数的分析普遍适用，因水分亏缺主要影响C3植物PSII光化学，但某些C4禾草对水分亏缺的响应可能以气孔限制和CO₂可利用性为主而非PSII光化学的直接损伤，且C4物种的Kranz解剖、光捕获与碳固定的空间分离、叶绿体分布差异和叶黄素循环活性改变可改变光化学与非光化学能量耗散之间的相对贡献，因此需进一步验证以将这些指标扩展至C4植物。还需注意本研究的脱水方案与整株植物土壤介导的干旱不同，离体叶片在受控室内条件下失水以生成广泛RWC范围，此方法减少环境变异并实现样品间直接比较，但不能完全复现整株植物干旱发展的生理复杂性。因此本研究结果应解释为NPQ调整ChlF指标在受控叶片脱水条件下有效性的证明，需在整株植物和田间干旱条件下进一步测试以确定这些指标在干旱评估中的广泛适用性。

研究结论：本研究证明NPQ改变光适应状态下的ChlF测量，以NPQ缩放ChlF特征可增强其作为植物叶片相对含水量指标的实用性。结果为开发有用且便捷的基于ChlF的干旱指标提供了潜在方法，需进一步田间测试这些特征作为干旱指标的可行性。