《Cell Death Discovery》：Transcriptional alterations in SKAP1-associated inside-out signaling in CNS-infiltrated pediatric T-cell acute lymphoblastic leukemia
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提高T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）患儿疗效和长期生存的主要障碍在于对中枢神经系统（CNS）浸润相关分子特征的认识有限。迁移至CNS的白血病细胞可逃避全身治疗，导致疾病进展和复发。深入了解与CNS浸润相关的转录组图谱可能为白血病细胞迁移所涉及的分子程序提
提高T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）患儿疗效和长期生存的主要障碍在于对中枢神经系统（CNS）浸润相关分子特征的认识有限。迁移至CNS的白血病细胞可逃避全身治疗，导致疾病进展和复发。深入了解与CNS浸润相关的转录组图谱可能为白血病细胞迁移所涉及的分子程序提供线索。因此，研究人员旨在鉴定表征CNS浸润性儿童T-ALL患者的转录改变。RNA测序分析显示，在CNS浸润性和CNS复发性儿童T-ALL中，与T细胞受体（TCR）信号相关的基因富集，包括SKAP1——TCR介导的inside-out信号通路中的关键衔接蛋白。尽管inside-out信号通路调控正常T细胞的黏附和迁移，但其在恶性白血病细胞迁移中的作用尚不明确。此外，暴露于甲氨蝶呤（MTX）并与脑膜细胞共培养的T-ALL细胞表现出TCR下游基因的改变。敲低SKAP1导致T-ALL细胞活力和增殖能力降低。综上所述，这些发现定义了与儿童T-ALL CNS浸润相关的转录谱，包括TCR信号改变和SKAP1表达变化。这些改变是否直接促进白血病细胞向CNS迁移仍有待确定。
研究背景：T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）是一种侵袭性血液恶性肿瘤，以未成熟淋巴细胞异常增殖为特征。过去数十年间，儿童T-ALL的5年总生存率已大幅提升至约90%，但复发风险仍然显著，部分原因在于白血病细胞迁移进入并滞留于中枢神经系统（CNS）。浸润CNS的白血病细胞可逃避全身化疗，因此鞘内注射甲氨蝶呤（MTX）被纳入常规治疗方案。然而，CNS定向治疗虽显著改善了生存结局，却可能引起严重的神经毒性和远期不良反应。为优化现有治疗方案并减少不良反应，亟需深入理解白血病细胞如何浸润并在CNS中存活。白血病浸润的主要部位是脑膜——包裹脑和脊髓的保护层，其中含有脑脊液（CSF）。白血病细胞进入CNS的潜在途径包括血-软脑膜屏障和血-CSF屏障。正常T细胞可通过趋化因子梯度、细胞骨架重塑和整合素介导的黏附等多种机制迁移。LFA1是一种关键整合素，通过与黏附分子ICAM1结合参与T细胞黏附和迁移。LFA1的激活可通过称为inside-out信号通路的途径诱导，该通路主要由T细胞受体（TCR）启动，涉及衔接蛋白SKAP1（又称SKAP55），其将TCR信号与下游RAP1激活及随后的LFA1活化联系起来。尽管inside-out信号通路在正常T细胞中已被充分表征，但其在恶性T细胞迁移和CNS浸润中的调控及潜在作用仍不清楚。因此，研究人员旨在通过分析儿童T-ALL患者的RNA测序数据（TARGET计划公开数据）来探究与CNS浸润相关的转录特征。
关键技术方法：研究人员利用TARGET计划公开的180例儿童T-ALL骨髓（BM）来源RNA测序数据（诊断样本按CNS1/CNS2/CNS3分类，复发样本按CNS或BM复发部位分组），并在Kids First独立队列（n=799）中进行验证；采用EnrichR和clusterProfiler进行功能富集分析和过表征分析（ORA）；使用四种T-ALL细胞系（SUP-T1、KARPAS45、CCL-119和MOLT16）进行慢病毒介导的SKAP1敲低实验；建立T-ALL细胞与永生化人脑膜细胞（IM-HMCs）的共培养模型并给予MTX处理；通过RT-qPCR检测基因表达，通过台盼蓝染色评估细胞活力和计数。
研究结果：
CNS浸润性和CNS复发性T-ALL表现出ECM组织和SKAP1表达的转录改变：对180例儿童BM来源T-ALL样本的RNA测序分析显示，与CNS1样本相比，CNS3和CNS复发样本中分别有超过400个基因差异表达，其中66个基因在两组中共同失调。富集分析揭示这些共同失调基因与细胞外基质（ECM）组织和降解相关，包括COL9A3、TMPRSS6和MMP11的上调。值得注意的是，衔接蛋白SKAP1是66个共同改变基因之一，在CNS3和CNS复发样本中均上调。在Kids First大队列（n=799）的BM和血液来源样本中验证了SKAP1在CNS3患者中表达高于CNS1患者，且该差异在诊断和复发样本中均可观察到。
CNS浸润性和CNS复发性T-ALL中TCR复合物和SKAP1的改变：ORA分析显示CNS3和CNS复发样本中TCR复合物相关的细胞组分（CC）基因富集，许多编码TCR α链和β链可变区的基因上调。然而，inside-out信号通路的其他组分如ITGAL、ITGB2、ADAP1、RAP1（RAP1A和RAP1B）、ICAM1以及SKAP1旁系同源物SKAP2在CNS3或CNS复发患者中与CNS1相比无显著改变。相关性分析显示CNS3患者中SKAP1与ICAM2、NFATC1和HINT2呈正相关，而CNS复发患者中SKAP1与ICAM1和CD44呈负相关。
CNS相关转录特征包括整合素信号改变和SKAP1表达：与脐血来源造血干/祖细胞（HSPCs，n=5）比较，1573个基因在CNS3和CNS复发样本中共享差异表达但不在CNS1中差异表达，提示与CNS疾病相关的转录程序。这些CNS相关基因的ORA分析确定整合素信号为顶级富集的KEGG通路之一。SKAP1表达从HSPCs到CNS1再到CNS3和CNS复发样本逐步升高。在1573个CNS相关基因中，仅CAPZA2、GLIPR2和HINT2这3个基因同时在CNS3和CNS复发样本中与CNS1样本相比差异表达。
T-ALL细胞中SKAP1敲低降低细胞增殖和活力：使用四种T-ALL细胞系进行慢病毒敲低SKAP1（MOLT16因敲低不足被排除），结果显示SKAP1表达降低的T-ALL细胞生长速率显著低于 scramble 对照，以成簇生长的细胞系（SUP-T1和KARPAS45）抑制更为明显。转导后第9天观察到群体倍增和细胞活力的最大损失。RT-qPCR分析显示SKAP1敲低导致ICAM2上调和细胞周期调控因子Cyclin B1（CCNB1）的适度降低。
T-ALL细胞在HMC共培养中暴露于MTX表现出inside-out信号丢失：T-ALL细胞与HMC共培养未显著影响SKAP1、ADAP、ITGAL、NFATC1或ICAM2的表达，但LFA1配体ICAM1和黏附分子ALCAM在黏附于HMC的T-ALL细胞中上调。当T-ALL细胞暴露于2 μM MTX时，共培养细胞中inside-out信号通路多个组分表达改变，包括ITGAL和ADAP1表达降低。MTX处理的共培养T-ALL细胞中ICAM2和NFATC1下调，而HINT2上调。共培养T-ALL细胞暴露于MTX后，SKAP1与HINT2之间以及SKAP1与ICAM2之间呈正相关。
讨论部分总结：研究人员通过研究CNS浸润性和CNS复发性样本中的转录改变，鉴定出ECM组织、TCR信号和inside-out信号相关基因的改变，包括SKAP1上调。敲低SKAP1导致T-ALL细胞增殖和活力降低。此外，与脑膜细胞共培养的T-ALL细胞在暴露于MTX时表现出inside-out信号通路组分的丢失。ECM是控制细胞迁移和转移的一个因素，必须被调节才能使细胞浸润其他组织。本研究鉴定出ECM组织和降解相关基因的转录富集，包括COL9A3和MMP11。另一种可能的机制是整合素介导的黏附，通过TCR和inside-out信号通路调控，导致LFA1-ICAM1结合。研究揭示CNS浸润性和CNS复发性T-ALL中TCR复合物和下游衔接蛋白SKAP1的富集，并在更大的T-ALL队列中验证了SKAP1上调。由于分析基于BM来源样本，这些发现仅提供与CNS疾病的间接关联，其与白血病细胞迁移的功能相关性仍有待确定。SKAP1在恶性发展中的具体作用仍不明确，其在胃癌和结肠癌中过表达并与肿瘤进展和免疫逃逸相关。鉴于其在T细胞生物学中的突出作用，异常SKAP1表达可能在T细胞恶性肿瘤如T-ALL中特别相关。敲低SKAP1导致增殖和活力降低，伴随Cyclin B1适度下调和ICAM2表达增加。然而，实验未确立SKAP1在白血病细胞向CNS迁移中的作用，需要专门的迁移实验和体内模型来确定其功能意义。研究局限性在于使用BM来源样本可能无法完全捕获CNS微环境中白血病细胞的分子景观，但鉴于儿童患者CSF样本获取的挑战，BM是实用且临床相关的材料来源。BM来源白血病样本保留了与CNS疾病相关的转录特征，支持使用BM样本鉴定CNS疾病相关转录特征，但未来整合配对BM和CSF样本的研究对进一步验证这些发现很重要。
研究结论翻译：综上所述，研究人员的发现确定SKAP1以及改变的TCR和黏附相关信号是与儿童T-ALL中CNS疾病相关的转录特征。这些发现为T-ALL中与CNS浸润相关的转录程序提供了新见解，并突出了值得进一步功能研究的分子过程。
