《Chemical Biology & Drug Design》：Revealing the Action Mechanism of WISP2 in Miscarriage Based Multi-Omic Analysis and Experimental Validation
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复发性流产（RM）是生殖医学中尚未解决的重要问题。尽管已知WISP2参与多种细胞过程，但其在滋养层细胞生物学和妊娠维持中的功能仍不清楚。研究人员对RM患者和正常对照的绒毛膜绒毛组织进行单细胞RNA测序（scRNA-seq），以识别细胞类型特异性转录改变，从而在
复发性流产（RM）是生殖医学中尚未解决的重要问题。尽管已知WISP2参与多种细胞过程，但其在滋养层细胞生物学和妊娠维持中的功能仍不清楚。研究人员对RM患者和正常对照的绒毛膜绒毛组织进行单细胞RNA测序（scRNA-seq），以识别细胞类型特异性转录改变，从而在合体滋养层/绒毛外滋养层（SCT/EVT）亚群中鉴定出WISP2为候选基因。胎儿膜样本（绒毛膜）取自青岛市妇女儿童医院外科门诊：20例RM患者和20例健康对照。采用qRT-PCR、Western blot和免疫组织化学检测基因和蛋白表达。使用HTR-8细胞构建WISP2过表达细胞，并进行MTT、伤口愈合和Transwell实验进行功能验证。单细胞分析鉴定出样本中11种细胞类别，其中包括蜕膜基质细胞（DSCs）和SCT/EVT。RM患者SCT/EVT细胞中WISP2水平较低。在绒毛膜绒毛组织中，RM组WISP2和E-cadherin相对对照组均显著上调（均p < 0.05）。免疫组织化学证实RM绒毛膜绒毛中WISP2和E-cadherin蛋白水平升高（均p < 0.05），分别主要定位于细胞质和细胞膜。在HTR-8细胞中，WISP2过表达抑制增殖（35%，p < 0.01）、迁移（45%，p < 0.01）和侵袭（50%，p < 0.001），上调E-cadherin（p < 0.05），下调Vimentin（p < 0.05），并增加p-ERK（p < 0.05）而不改变总ERK1/2（p > 0.05），提示WISP2促进上皮样表型并伴随ERK通路激活。总之，WISP2在RM中表达失调，并在体外抑制滋养层细胞侵袭和上皮-间质转化（EMT），提示其在RM发病机制中的潜在作用，但仍需体内验证。
复发性流产（RM）是生殖医学领域亟待解决的重大难题，约影响1%–2%的育龄女性，其中40%–60%的病例被归类为不明原因性流产，其发病机制尚未完全阐明。滋养层细胞侵袭不足是RM的公认标志，而WISP2（又称CCN5）作为Wnt/β-catenin通路的下游分泌型基质细胞蛋白，虽已被发现参与多种细胞过程并在蜕膜基质细胞（DSCs）中发挥免疫调节功能，但其在滋养层细胞生物学及妊娠维持中的作用完全未知。基于此，研究人员提出假说：WISP2可能通过调控滋养层细胞侵袭参与流产的发生。研究人员首先利用公共数据库中的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据（GSE214607等）对RM患者与正常对照的蜕膜和绒毛组织进行比较分析，鉴定细胞类型特异性转录改变；随后收集青岛市妇女儿童医院20例RM患者和20例健康对照的绒毛膜绒毛样本，通过qRT-PCR、Western blot和免疫组织化学（IHC）检测WISP2与E-cadherin的表达与定位；最后在HTR-8滋养层细胞系中构建WISP2过表达模型，通过MTT、伤口愈合和Transwell实验评估WISP2对细胞增殖、迁移和侵袭的影响，并采用Western blot检测EMT相关标志物及ERK通路分子的变化。研究结论表明，WISP2在RM胎盘绒毛组织中表达显著升高，其过表达可抑制滋养层细胞生长、迁移和侵袭，并通过上调E-cadherin、下调Vimentin、激活ERK通路促进上皮样表型、阻断EMT过程，提示WISP2过表达可能削弱绒毛外滋养层细胞（EVT）对母体蜕膜的侵袭能力，导致螺旋动脉重塑不足，从而引发不良妊娠结局；抑制WISP2过度表达可能成为RM预防和干预的有效策略。
在技术方法方面，研究人员主要采用了以下关键技术：（1）单细胞RNA测序数据分析，基于GSE214607数据集（5例正常和3例RM患者的蜕膜与绒毛样本）及GSE161969、GSE111974、GSE165004公共数据集，使用Seurat软件进行质控、降维聚类和SingleR细胞注释；（2）临床样本队列来自青岛市妇女儿童医院，纳入20例RM患者（孕6–10周，连续2次及以上自然流产）和20例年龄匹配的健康对照（孕6–10周，至少一次足月妊娠史），采集绒毛膜绒毛组织；（3）qRT-PCR和Western blot检测基因与蛋白表达水平；（4）免疫组织化学检测蛋白定位与半定量分析；（5）HTR-8细胞系WISP2过表达模型构建及MTT增殖实验、伤口愈合迁移实验和Transwell侵袭实验；（6）Western blot检测E-cadherin、Vimentin、ERK1/2、p-ERK蛋白表达。
研究结果如下：（1）正常与RM样本的单细胞分析：对单细胞数据进行质控筛选后获得112,528个符合标准的细胞，t-SNE无监督聚类结合SingleR注释确认了11种细胞类型，其中包括DSCs和SCT/EVT细胞，二者均为母胎界面关键细胞群。（2）核心基因WISP2的功能探索：WISP2主要表达于DSCs，在SCT/EVT细胞中表达相对较低；按WISP2高/低表达分组进行差异分析获得1372个差异表达基因，GO和KEGG富集分析显示这些基因主要富集于核糖核蛋白复合物生物合成、染色体区域细胞组分、cadherin结合分子功能以及细胞周期调控、MAPK信号通路和黏附连接相关通路；在三个独立数据集（GSE161969、GSE111974、GSE165004）中进一步验证发现WISP2在RM患者中显著高表达。（3）qRT-PCR检测RM与正常对照绒毛膜中E-cadherin和WISP2 mRNA表达：RM组绒毛组织中WISP2 mRNA表达显著高于正常对照（p < 0.0001），E-cadherin mRNA水平亦显著升高（p < 0.01）。（4）Western blot检测RM与正常对照绒毛膜中E-cadherin和WISP2蛋白表达：RM组绒毛膜绒毛中WISP2蛋白表达较正常妊娠组显著升高（p < 0.01），E-cadherin蛋白表达显著上调（p < 0.0001）。（5）IHC检测RM与正常对照绒毛膜中WISP2和E-cadherin蛋白表达与定位：WISP2阳性染色见于合体滋养层和细胞滋养层的细胞质与细胞核，以细胞质阳性最强；E-cadherin阳性见于合体滋养层和细胞滋养层细胞的细胞膜、细胞质和核区，以细胞膜阳性最强；RM组WISP2平均光密度（AOD）显著高于正常对照组（p < 0.05），E-cadherin AOD亦显著升高（p < 0.05）。（6）WISP2过表达抑制细胞生长：Western blot证实转染WISP2 cDNA后HTR-8细胞中WISP2水平显著升高（p < 0.01），MTT实验显示WISP2过表达使HTR-8细胞增殖抑制约35%（p < 0.0001）。（7）WISP2过表达延缓细胞迁移与侵袭：伤口愈合实验显示24 h时WISP2 cDNA组与对照cDNA组细胞迁移能力无统计学差异（p > 0.05），但48 h时WISP2 cDNA组迁移能力显著降低（p < 0.0001），较对照组减少约65%；Transwell侵袭实验表明WISP2高表达显著抑制细胞侵袭能力，较对照cDNA组下降约40%（p < 0.01），提示WISP2可抑制细胞迁移与侵袭过程。（8）WISP2过表达激活ERK并上调E-cadherin：HTR-8细胞过表达WISP2后，E-cadherin蛋白表达大幅增加（p < 0.05），总ERK1/2表达无显著变化（p > 0.05），但磷酸化ERK（p-ERK）显著升高、Vimentin蛋白表达下降（p < 0.05），提示WISP2过表达促进滋养层细胞上皮样表型并伴随ERK信号通路激活。
讨论部分总结：迄今为止，WISP2在流产过程中的作用仍处于探索阶段，但其在多种癌症中的功能已被较为清晰地阐明。WISP2对细胞增殖具有双向调控作用，其效应受细胞类型和周围环境共同影响，如在前列腺癌细胞中抑制生长，而在MCF-7细胞中促进增殖；WISP2可通过ERK信号通路调控MMP9和MMP-2表达介导EMT过程，从而影响胃癌细胞的增殖、侵袭和转移。然而，WISP2与流产的关系仍需深入研究。在早期妊娠中，细胞滋养层（CTB）融合形成合体滋养层（STB），锚定绒毛增殖形成滋养层细胞柱并分化为EVT，EVT可侵袭并重塑子宫螺旋动脉以确保胎盘获得充足血供；若滋养层侵袭能力不足，螺旋动脉将保留收缩功能，导致绒毛间隙血流过多、胚胎和胎盘氧分压升高，进而引发复发性自然流产、妊娠期高血压、胎儿宫内生长受限等疾病。EMT在胚胎植入和胎盘建立过程中具有重要意义，使滋养层细胞柱得以侵入蜕膜基质，植入完成后EVT恢复上皮表型。研究人员检测了未及时终止妊娠的胎盘样本中WISP2和E-cadherin的表达，发现二者均升高，提示未及时终止的绒毛膜可能呈现侵袭性较低的上皮形态；使用HTR-8/SVneo细胞系作为早期EVT侵袭迁移模型，构建WISP2过表达细胞模拟RM的EVT，发现高水平WISP2可有效抑制EVT的增殖、迁移和侵袭能力，机制上WISP2高表达激活EVT中ERK1/2通路，下调Vimentin表达、上调E-cadherin表达，共同促进EVT恢复上皮细胞特征。研究局限性包括：样本量相对较小可能限制统计效能和结论普适性，需要更大独立队列验证；功能研究仅限于体外细胞模型，虽HTR-8/SVneo是公认的人EVT替代模型，但未来仍需滋养层特异性条件性敲除或过表达小鼠模型或人源化胎盘异种移植系统进一步巩固WISP2在流产中的体内病理生理作用；虽然E-cadherin被选为评估临床组织EMT状态的代表性标志物，但更全面的EMT相关调控因子组合（包括N-cadherin、Vimentin、Snail及ERK通路组分）将提供更完整的机制图景，未来需扩大标志物Panel以全面阐明WISP2调控滋养层侵袭的分子通路。
研究结论部分翻译：在流产过程中，胎盘绒毛组织中WISP2和E-cadherin的表达显著增加，该过程主要依赖于WISP2的作用。WISP2过表达可抑制滋养层细胞生长、迁移和侵袭；因此，滋养层细胞中p-ERK、Vimentin和E-cadherin水平受WISP2调控，从而阻止EMT过程。这提示WISP2过表达可能降低绒毛外滋养层细胞对母体蜕膜的侵袭能力，导致螺旋动脉重塑不足和不良妊娠结局。研究人员的发现表明，抑制WISP2过度表达可能成为复发性流产预防和干预的有效途径。
