乳腺癌中与M1型巨噬细胞浸润及糖酵解相关的候选基因分析与鉴定

《Chemical Biology & Drug Design》：Analysis and Identification of Candidate Genes Associated with M1 Macrophage Infiltration and Glycolysis in Breast Cancer

　　

摘要 巨噬细胞极化与糖酵解重编程共同参与乳腺癌（breast cancer，BC）微环境的塑造。然而，与上述特征相关的基因及其临床意义仍不明确。研究人员利用免疫解卷积、单样本基因集富集分析及加权基因共表达网络分析对乳腺癌转录组数据集进行了分析，鉴定出101个为M1型巨噬细胞相关基因集、糖酵解相关基因集与差异表达基因集所共有的基因。其中8个基因显示出与BC风险相关的提示性遗传预测关联。机器学习筛选出7个共识基因。在TCGA-BRCA中，6个基因在肿瘤与正常组织间存在显著差异，但仅5个基因的变化方向与GSE65194一致。在56例配对临床组织中，ADAM15、PPP1R14B和XPO5在肿瘤中上调，而FAM172A和PPM1M下调。ADAM15、PPP1R14B和XPO5优先表达于M1样肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages，TAMs），而FAM172A和PPM1M在M2样TAMs中表达较高。在骨髓来源巨噬细胞（bone marrow-derived macrophages，BMDMs）中，过表达ADAM15、XPO5或PPP1R14B，以及敲低PPM1M或FAM172A，均增加了CD80阳性细胞比例以及ATP、葡萄糖摄取和乳酸生成。5个基因与总生存期呈显著关联。功能富集分析提示免疫调节、细胞外基质组织及代谢通路参与其中。

研究背景　乳腺癌（BC）仍是全球女性最常见的恶性肿瘤及主要癌症死亡原因，2022年全球新发病例约230万。尽管早期筛查、分子分型和系统治疗不断进步，但疾病异质性和免疫抑制性肿瘤微环境（TME）使临床结局仍不均衡。TME由恶性细胞、基质成分、细胞外成分及浸润免疫细胞构成，其中肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）是实体瘤中最丰富的免疫细胞群体之一。M1样巨噬细胞多与促炎细胞因子产生和抗肿瘤免疫活性相关，M2样巨噬细胞则常与免疫抑制、组织重塑和肿瘤生长相关；但TAMs并非两个固定互斥的群体，M1/M2框架仅描述宽泛的功能倾向。M1样与M2样特征比值较高与包括BC在内的多种恶性肿瘤预后较好相关。M1样巨噬细胞常表现有氧糖酵解增强，该代谢程序受HIF-1α及PI3K/Akt/mTOR通路影响；BC细胞亦常呈糖酵解增强的Warburg表型，乳酸堆积可抑制细胞毒性免疫功能并改变巨噬细胞行为。然而，连接肿瘤糖酵解与M1样巨噬细胞程序的基因在BC中仍不明确，且批量组织分析难以判断表达改变来源于肿瘤细胞还是巨噬细胞亚群。因此，研究人员假设与糖酵解及M1样巨噬细胞浸润共同相关的基因可能标志一种与BC状态及临床结局相关的免疫代谢状态，并据此整合多层面分析开展研究。

研究方法　研究人员整合转录组分析、免疫细胞解卷积、共表达网络分析、基于孟德尔随机化（MR）的遗传学优先级排序及机器学习特征筛选，并在公共队列、配对临床组织、分离的原发肿瘤细胞、M1样与M2样TAMs及BMDMs中评估候选基因。主要关键技术方法包括：CIBERSORT与xCell免疫浸润评估；加权基因共表达网络分析（WGCNA）；单样本基因集富集分析（ssGSEA）；两样本孟德尔随机化分析（以GTEx表达数量性状位点及GWAS数据集ebi-a-GCST90018799为数据来源）；LASSO回归与支持向量机递归特征消除（SVM-RFE）机器学习特征筛选；受试者工作特征（ROC）曲线、列线图、决策曲线与校准曲线分析；以及qRT-PCR、流式细胞术分选与检测、ATP、葡萄糖摄取和乳酸测定。样本队列来源包括：GEO数据库GSE65194数据集（130例BC及11例癌旁正常乳腺样本）、TCGA-BRCA队列（1095例BC及113例正常乳腺样本）以及山东省妇幼保健院56例经病理确诊并手术的BC患者配对肿瘤与癌旁组织（伦理批号2025-031）。

研究结果

3.1 肿瘤浸润免疫细胞组成与M1型巨噬细胞相关基因鉴定　CIBERSORT分析显示BC与癌旁正常组织22种免疫细胞组成差异明显，M1与M2巨噬细胞呈最强负相关（r=?0.48），M1巨噬细胞在肿瘤中增幅最大。以xCell来源M1巨噬细胞丰度为表型，WGCNA确定turquoise模块关系最密切，按模块成员度（MM）>0.3、基因显著性（GS）>0.3获得2374个M1巨噬细胞相关基因。

3.2 差异表达与富集分析　GSE65194中鉴定3267个差异表达基因（DEGs），包括1662个上调和1605个下调基因；KEGG富集涉及细胞周期、p53信号、谷胱甘肽代谢、坏死性凋亡、IL-17信号、TNF信号及糖酵解通路，GO富集主要为染色体分离、有丝分裂核分裂和细胞外基质组织。

3.3 与M1巨噬细胞相关的糖酵解相关DEGs鉴定　BC样本糖酵解ssGSEA评分显著升高，软阈值β=4时WGCNA构建共表达模块，turquoise模块与糖酵解评分关系最强；按MM>0.8、GS>0.5获得5182个糖酵解相关基因，与M1巨噬细胞相关基因及DEGs取交集得到101个MMG-DEGs。

3.4 候选基因的MR分析　101个MMG-DEGs中8个基因与BC风险呈提示性关联：ADAM15、ALAS1、FAM172A、PPM1M、PPP1R14B、TP53BP2、XPO5和ZNF318；PPM1M的MR估计为正向，其余7个为负向。

3.5 诊断生物标志物筛选　LASSO回归保留7个基因，SVM-RFE选出8个基因，交集得到7个共识候选基因：ADAM15、ALAS1、FAM172A、PPM1M、PPP1R14B、XPO5和ZNF318。

3.6 诊断性能与模型构建　训练数据集中7个基因区分BC与非癌样本的曲线下面积（AUC）均大于0.7；构建7基因列线图，偏倚校正校准曲线在较低预测概率处偏离理想线，决策曲线分析显示7基因模型在较宽阈值概率范围内净获益高于全治或全不治策略。

3.7 验证与免疫相关性　GSE65194中7个候选基因在肿瘤与正常组织间均差异显著；TCGA-BRCA中ADAM15、FAM172A、PPM1M、PPP1R14B和XPO5变化方向与GSE65194一致，ALAS1显著但方向相反，ZNF318无显著差异；后续分析的5个基因均与M1巨噬细胞浸润正相关。

3.8 预后关联　Kaplan–Meier分析显示ADAM15、FAM172A或XPO5高表达者总生存期较短，而PPM1M或PPP1R14B高表达者总生存期较长；据此选择5个基因进一步实验验证。

3.9 调控网络与通路分析　构建5个枢纽基因的miRNA–转录因子（TF）–mRNA调控网络，包含27个转录因子和68个miRNA；单基因GSEA显示ADAM15与ECM–受体相互作用和黏着斑相关，FAM172A与氧化磷酸化相关，PPM1M与ECM–受体相互作用相关，PPP1R14B与黏着斑相关，XPO5与三羧酸循环及蛋白酶体相关通路相关。

3.10 BC组织中候选基因表达验证　56例配对组织中，ADAM15、PPP1R14B和XPO5在肿瘤中表达升高，FAM172A和PPM1M降低；同队列ROC分析AUC分别为ADAM15 0.8559、PPP1R14B 0.6827、XPO5 0.6014、FAM172A 0.7286、PPM1M 0.7698。

3.11 56例队列的临床关联　按各基因中位表达分组，肿瘤分期与ADAM15（p=0.0058）、PPP1R14B（p=0.0170）、XPO5（p=0.0103）、PPM1M（p=0.0375）和FAM172A（p=0.0006）表达相关；FAM172A表达还与雌激素受体（ER）状态相关（p=0.0363）；未见与年龄、孕激素受体（PR）状态或人表皮生长因子受体2（HER2）状态的显著关联。

3.12 候选基因的细胞群体特异性表达　ADAM15、PPP1R14B和XPO5在M1样TAMs中表达最高；FAM172A和PPM1M在M1样TAMs中较低、在M2样TAMs中较高。

3.13 BMDMs中候选基因调控的功能效应　过表达ADAM15、XPO5或PPP1R14B，以及敲低PPM1M或FAM172A，均较相应对照组增加CD80阳性细胞比例，并伴随ATP生成、葡萄糖摄取和乳酸生成升高。

3.14 总生存期的Cox回归分析　对5个候选基因进行单因素和多因素Cox比例风险回归分析，风险比（HR）、p值及置信区间以森林图呈现。

讨论与结论　研究人员认为，BC样本中M1样巨噬细胞信号升高应解释为M1样转录信号的增加，而非均一M1巨噬细胞群体的直接证据；101个基因应视为研究免疫–代谢关系的候选基因池，而非已确认的分子特征或机制通路。MR结果仅用于候选基因优先级排序，属假设生成性质，不能证明生物学因果。7基因模型为发现阶段分类器，尚需独立、前瞻性、多中心队列验证；由于多因素Cox模型未充分校正肿瘤分期、分级、受体状态、年龄和治疗史等主要临床病理变量，生存关联不应视为独立预后因素证据。细胞实验支持候选基因与巨噬细胞的功能相关性，但CD80仅为一种活化标志，ATP、2-NBDG摄取和乳酸为间接代谢读数，且缺乏肿瘤细胞共培养、回补实验及体内验证。研究局限性包括公共队列为回顾性、平台不同、未进行亚型分层生存分析、免疫细胞组成由批量转录组估算、M1/M2标记定义不能完全代表巨噬细胞连续混合表型、BMDM为鼠源模型且为终点实验、MR依赖工具变量假设等。结论为：本研究整合转录组、遗传学与实验分析，鉴定出BC中与M1样巨噬细胞特征相关的糖酵解相关基因；7个入选基因均能在GSE65194中区分肿瘤与正常组织，其中5个在TCGA-BRCA中呈一致表达变化；5个候选基因在配对临床组织、分离细胞群体和BMDMs中进一步检验，组织与细胞 findings 及基因操作后CD80和糖酵解相关代谢读数变化为这些基因与巨噬细胞免疫–代谢表型的关联提供初步支持；但现有数据尚不能确立组织特异性因果性、肿瘤–巨噬细胞串扰的中介作用或独立预后价值，临床转化前需开展亚型分层前瞻性验证及涉及肿瘤–巨噬细胞共培养、直接代谢通量测定、回补实验和体内模型的机制研究。