《Chemistry & Biodiversity》：Integrated Computational Pipeline Combining Metabolomics and Network Pharmacology for Bioactive Scaffold Discovery: Application to Antarctic Moss Chorisodontium aciphyllum
编辑推荐：
从复杂天然基质中发现先导化合物传统上需要资源密集的分离步骤。将计算生物学与非靶向代谢组学整合为快速靶点预测与筛选提供了更高效的替代方案。本研究提出了一套整合LC–MS/MS代谢组学、网络药理学与分子对接的计算流程，用于识别生物活性骨架。研究人员将该方法应用于南
从复杂天然基质中发现先导化合物传统上需要资源密集的分离步骤。将计算生物学与非靶向代谢组学整合为快速靶点预测与筛选提供了更高效的替代方案。本研究提出了一套整合LC–MS/MS代谢组学、网络药理学与分子对接的计算流程，用于识别生物活性骨架。研究人员将该方法应用于南极藓类Chorisodontium aciphyllum的甲醇提取物作为模型基质。对生物活性组分（Fr.3）进行谱图分析，鉴定出17种次级代谢产物，主要以脂肪酸和甾体骨架为特征。网络药理学与功能注释预测ERBB2和AKT1为抗肺癌活性的关键蛋白靶点。分子对接支持了这些预测，显示甾体和开环甾体化合物如5α-ergosta-7,22-diene-3β,5-diol和25-hydroxyvitamin D2与这些靶点具有高结合亲和力。作为对计算预测通路的初步体外验证，研究人员发现Fr.3显著增加了细胞内活性氧（ROS）水平，并在LLC1小鼠肺癌细胞中诱导了凋亡介导的细胞死亡（IC50 ≈ 45.79 μg/mL）。研究结果表明，将非靶向代谢组学与计算分析相结合可有效简化从未经表征的天然提取物中发现治疗先导化合物的过程。
研究背景：癌症以不受控的细胞增殖和组织侵袭为特征，仍是全球主要死因之一。传统化疗和手术等治疗手段常受限于严重副作用和获得性耐药等显著局限性。因此，天然产物作为具有增强疗效和降低毒性的有前景的治疗候选物而受到关注。南极是地球上最严酷的环境之一，具有极寒、干旱、强紫外线辐射和营养匮乏等特点。尽管条件严苛，由微生物、地衣和藓类组成的独特生态系统仍得以存续。这些生物为生存进化出特殊的生化适应机制，驱动这些环境响应的次级代谢产物因其抗氧化、抗菌和抗肿瘤等强生物活性而引起科学界的广泛兴趣。藓类形态在超过4亿年间几乎未变，全球分布于从极地到热带的多样气候带。尽管缺乏维管组织，其对干旱、冰冻温度和紫外线辐射表现出显著耐受性，使其甚至能在南极等严酷生境中繁茂生长。虽然这些适应被认为与独特次级代谢产物的生物合成密切相关，但苔藓植物中这些化合物的研究显著落后于被子植物和真菌，其化学多样性和生物活性知识仍然有限。Chorisodontium aciphyllum表现出极长的寿命，能够在冰川下持续存在数百年。近期其完整线粒体基因组已完成测序，阐明了其系统发育地位并鉴定了适应严酷条件生存的遗传特征。然而，C. aciphyllum的代谢谱尚未被研究，其生理和化学特征在很大程度上仍未被探索。传统化学分离技术需要大量生物量，对于南极藓类等极端微生物植物而言，由于样本可用性严重受限而往往不切实际。相比之下，非靶向代谢组学能够从微量样本中捕获完整的代谢谱。随着计算技术的进步，计算机模拟方法已成为补充体外、体内和临床发现的有力方法。其中，网络药理学被广泛用于阐明生物活性天然产物的分子机制。本研究旨在建立一套整合非靶向LC–MS/MS代谢组学、网络药理学和分子对接的计算流程，以高效识别复杂天然基质中的生物活性骨架和治疗靶点。作为概念验证，该方法被应用于南极藓类C. aciphyllum的生物活性组分（Fr.3）。通过绕过资源密集的分离步骤，研究人员绘制了代谢物谱图并进行了全面的计算机模拟分析，包括蛋白-蛋白相互作用（PPI）、化合物-基因网络和GO/KEGG富集分析，阐明了提取物中特定甾体和脂肪酸骨架抗肺癌活性的潜在机制。研究结果表明，将非靶向代谢组学与计算网络分析相结合可以克服传统筛选的局限性，填补天然产物药物发现中的关键空白。
关键技术方法：研究人员采集南极乔治王岛（南设得兰群岛）的C. aciphyllum样本（凭证标本注册号An-MS04，保存于韩国极地研究所KOPRI植物标本馆），以甲醇提取后进行LC–MS/MS非靶向代谢组学分析（Thermo Fisher UHPLC系统耦合Q-Exactive Plus Orbitrap质谱仪，正离子全扫描/ddMS2模式），通过ChemSpider、HRAM、MassList等数据库进行化合物注释。采用MTT法评估细胞活力，Annexin V/PI染色和DCFDA探针结合流式细胞术检测凋亡和ROS水平。网络药理学分析通过STRING数据库构建PPI网络并导入Cytoscape 3.8.0进行拓扑分析，利用ShinyGo进行GO和KEGG富集分析，GEPIA和UALCAN数据库进行基因表达和生存分析。分子对接使用AutoDock Vina 1.1.2对ERBB2（PDB ID: 3PP0）和AKT1（PDB ID: 4EJN）与17种化合物进行对接分析。
研究结果：
3.1 细胞活力实验：通过MTT法评估C. aciphyllum甲醇提取物及其组分（Fr.1–Fr.3）对四种小鼠癌细胞系（LLC1肺癌、HCA-1肝癌、bEnd.3脑癌、4T1乳腺癌）和正常肝细胞系AML12的细胞毒性。粗提物和Fr.1–Fr.3对HCA-1、bEnd.3和AML12细胞处理后细胞活力保持在约80%–100%，表明无可测量的细胞毒性。Fr.2选择性降低4T1细胞活力，在125 μg/mL时完全丧失活力（IC50 = 68.20 μg/mL）。Fr.3表现出最强的响应，LLC1细胞活力在62.5–125 μg/mL之间接近0%（IC50 = 45.79 μg/mL），4T1细胞活力约40%（IC50 = 107.95 μg/mL）。由于Fr.3在小鼠肺癌细胞中表现出更强的效力，因此被选用于LLC1细胞的后续机制研究。
3.2 C. aciphyllum的LC–MS/MS分析：基于细胞毒性实验结果，对Fr.3进行非靶向LC–MS/MS代谢组学分析，检测到17种化合物，主要为脂肪酸和甾体骨架。据研究人员所知，这是该藓类物种次级代谢产物的首次综合报道。
3.3 肺癌中的植物化学物与可成药靶点：PPI网络分析：在10 000个与肺癌相关的关键基因中，177个显示与Fr.3化合物相关。201个共同靶点上传至STRING数据库获得PPI数据，网络包含173个节点和1338条边，平均度15.468，聚类系数0.455。选取度值最高的30个主要节点进行可视化，其中14个节点AKT1、ESR1、ERBB2、AGTR1、MAPK3、CYP3A4、ABCB1、CYP19A1、AR、APP、HDAC1、MAPK14、CYP17A1和MTOR度值超过20。构建的化合物-靶点-疾病网络包含239个节点和380条边，平均度3.274。5α-Ergosta-7,22-diene-3β,5-diol（度值99）、3β-hydroxy-4β-methyl-5α-cholest-7-ene-4α-carboxylic acid（度值92）和ergosterol peroxide（度值46）表现出高度值。
3.4 C. aciphyllum基因靶点的功能与通路富集分析：GO富集分析将基因功能分类为MF、BP和CC三类。KEGG富集分析鉴定出多个显著富集的通路（校正p < 0.05），包括催乳素信号通路、非小细胞肺癌、化学致癌作用、神经活性配体-受体相互作用和癌症通路。在非小细胞肺癌中，ERBB2、MET、PIK3CA、EML4-ALK、JAK3、STAT3/5、AKT、PKC、cyclin D1、ERK、RXR和CDK4/6等关键致癌基因和蛋白富集于癌症相关信号通路。
3.5 基于GEPIA和UALCAN的ERBB2肺癌分析：GEPIA分析显示ERBB2在肺腺癌中较正常细胞显著高表达，但ERBB2过表达患者与未过表达患者的总生存期无统计学显著差异（p = 0.74）。UALCAN分析显示ERBB2在LUAD中较正常肺组织统计学显著高表达，且从I期到IV期各阶段一致过表达，与临床疾病进展无关。此外，TP53突变与ERBB2高表达相关。
3.6 分子对接分析：选择ERBB2（3PP0）和AKT1（4EJN）作为核心靶点与Fr.3中所有17种化合物进行分子对接。在17种化合物中，2种化合物（ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-one和5α-ergosta-7,22-diene-3β,5-diol）表现出比Lapatinib（结合能：?8.11 kcal/mol）更强的结合亲和力。虽然没有化合物严格超过MK-2206的结合亲和力（?10.37 kcal/mol），但25-hydroxyvitamin D2和5α-ergosta-7,22-diene-3β,5-diol表现出与对照高度可比的结合亲和力（分别为?10.07和?10.02 kcal/mol）。
3.7 C. aciphyllum Fr.3诱导的凋亡和ROS产生：通过Annexin V/PI染色评估凋亡，Fr.3处理增加了LLC1细胞凋亡比例。通过流式细胞术测量DCFDA氧化评估细胞内ROS产生，Fr.3处理的LLC1细胞显示出比对照更高的ROS水平。这些结果表明C. aciphyllum Fr.3在LLC1细胞中诱导伴随细胞内ROS增加的凋亡性细胞死亡，支持其抗癌活性。
讨论部分总结：MTT法评估显示C. aciphyllum甲醇提取物及其组分对不同小鼠癌细胞系表现出明显的抗癌效果。Fr.3对LLC1肺癌细胞表现出显著强效活性（IC50 = 45.79 μg/mL）。LC–MS/MS分析初步鉴定出17种化合物，多数为甾体骨架或脂肪酸相关化合物。植物中甾体参与维持细胞膜稳态和响应紫外线辐射、低温、干旱等环境胁迫。南极严酷环境可能促进甾体产生。脂肪酸在细胞膜中的积累在南极生物中已被广泛报道。传统药物发现主要关注单一分子靶点，但癌症等复杂疾病常源于复杂分子信号通路和多因素病因，单靶点方法存在固有局限性。网络药理学将基因、蛋白质和代谢通路建模为网络并理解药物对整个网络的效果。PPI结果显示AKT1、ESR1、STAT1、MTOR、PTGS2、HDAC1、PPARG、MDM2、MAPK8、MAPK3、JAK2和ERBB2具有高连接度评分。KEGG富集分析提示Fr.3可能参与催乳素信号通路、非小细胞肺癌、化学致癌作用、神经活性配体-受体相互作用和癌症通路。GO富集分析中，BP类别显示甾体代谢过程、脂质代谢过程调节、对有机环状化合物的响应和细胞对含氧化合物的响应等高富集值。CC类别中“突触前膜整合组分”、“质膜区域”和“质膜内在组分”等术语密集聚类，提示Fr.3中化合物可能直接与膜蛋白相互作用。MF类别中信号受体活性和分子转导活性显著富集，ERBB2是该类别的代表性受体分子。AKT1、MTOR、MAPK3和MAPK8作为从受体传递信号的分子转导物表现出强关联。ERBB2（HER2）作为受体酪氨酸激酶参与肿瘤形成和增殖。AKT1是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在NSCLC的细胞存活、迁移、增殖和凋亡抵抗中起关键作用。GEPIA分析证实ERBB2在LUAD中显著过表达。UALCAN分析证实tp53突变肺癌中ERBB2高表达。ERBB2在I期至IV期各阶段一致高表达，提示其可能参与从肿瘤起始最早阶段到进展的整个过程。分子对接显示对ERBB2结合亲和力最高的化合物为5α-ergosta-7,22-diene-3β,5-diol（?8.35 kcal/mol），其次为ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-one（?8.12 kcal/mol），均高于Lapatinib（?8.11 kcal/mol）。对AKT1，25-hydroxyvitamin D2（?10.07 kcal/mol）和5α-ergosta-7,22-diene-3β,5-diol（?10.02 kcal/mol）表现出强结合效力，均超过?10 kcal/mol阈值，与MK-2206（?10.37 kcal/mol）性能相当。与ERBB2和AKT1相互作用最高的三种化合物中有两种具有甾体骨架。基于网络药理学分析，AKT1和ERBB2被鉴定为关键调控节点，两者均是肺癌细胞存活、增殖和抗凋亡信号的核心。研究人员假设Fr.3介导的这些靶点抑制将破坏必要的存活通路，从而触发级联反应导致程序性细胞死亡和氧化应激。Fr.3处理显著促进凋亡性细胞死亡并升高ROS水平，与预测和观察到的细胞活力降低一致。这些结果表明Fr.3通过抑制AKT1/ERBB2相关信号发挥细胞毒性作用，有效将细胞平衡转向凋亡。本研究首次鉴定C. aciphyllum的强效特异性抗肺癌活性。通过将非靶向代谢组学与网络药理学相结合，本研究超越了传统的一般性筛选，精准定位特定生物活性候选物及其分子靶点。
研究结论翻译：总之，本研究成功建立并验证了一套整合非靶向LC–MS/MS代谢组学、网络药理学和分子对接的计算流程，用于简化从复杂天然基质中发现生物活性骨架的过程。通过将该框架应用于极端微生物C. aciphyllum作为模型提取物，研究人员以计算方式绘制了其未经表征的代谢组，并鉴定出17种候选代谢产物，主要以甾体和脂肪酸骨架为特征。基于网络的系统分析有效预测了AKT1和ERBB2作为抗肺癌活性的主要治疗靶点。这些计算预测得到了分子对接模拟的有力支持，揭示特定开环甾体和甾体衍生物（如25-hydroxyvitamin D2和5α-ergosta-7,22-diene-3β,5-diol）具有与临床抑制剂相当的的高结合亲和力。关键的是，初步体外验证显示LLC1细胞中细胞内ROS增加和凋亡， corroborated了计算机模拟机制预测。最终，本研究凸显了将数据驱动的化学谱图分析与计算网络分析相结合以克服传统分离依赖型生物勘探瓶颈的稳健性。未来工作将优先对已鉴定的骨架进行体内实验验证，以确认计算预测的生理稳健性并探索其在联合治疗中的潜力。
