《International Journal of Genomics》：Transcriptomic Identification of Candidate Biomarkers Associated With Vascular Calcification-Related Signaling Pathways in Immunoglobulin A Nephropathy
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背景：免疫球蛋白A肾病（IgAN）是全球最常见的原发性肾小球疾病之一。本研究旨在鉴定与IgAN中血管钙化相关信号通路相关的候选生物标志物，并探讨其潜在的生物学关联。方法：本研究为基于公共转录组数据集的观察性生物信息学研究。血管钙化相关基因（VCRGs）根据选定
背景：免疫球蛋白A肾病（IgAN）是全球最常见的原发性肾小球疾病之一。本研究旨在鉴定与IgAN中血管钙化相关信号通路相关的候选生物标志物，并探讨其潜在的生物学关联。方法：本研究为基于公共转录组数据集的观察性生物信息学研究。血管钙化相关基因（VCRGs）根据选定的KEGG信号通路定义。数据来源于公共数据库。通过差异分析、机器学习以及跨肾室外部表达评估鉴定候选生物标志物。富集分析、免疫浸润、调控网络、计算药物预测以及计算N6-甲基腺苷（m6A）位点预测被用于探索候选生物标志物的潜在生物学背景。结果：差异分析鉴定了348个差异表达基因（DEGs）。通过将这些DEGs与VCRGs取交集，获得30个候选基因。JUN、FOS和COL1A2最终被鉴定为候选生物标志物，这些基因主要与"Nagashima EGF信号通路"和"Nagashima NRG1信号通路"相关。六种差异免疫细胞类型（如M2巨噬细胞）在IgAN组与对照组之间差异显著。Spearman分析显示COL1A2与静息自然杀伤（NK）细胞呈负相关（cor = ?0.57，p < 0.05）；FOS与静息NK细胞呈正相关（cor = 0.72，p < 0.01）。BRD4、MAZ和CTCF被计算预测为共享候选转录因子（TFs）。还预测了涉及hsa-miR-139-5p和FOS的调控关联。曲格列酮被预测靶向JUN。在所有三个候选生物标志物中计算预测了高置信度m6A修饰位点。这些发现被认为是探索性的和假设生成性的。结论：JUN、FOS和COL1A2被鉴定为与血管钙化相关信号通路基因相关的IgAN相关候选生物标志物，为IgAN与钙化相关信号之间的潜在分子联系提供了探索性生物学见解。
**研究背景与问题**
免疫球蛋白A肾病（IgAN）以肾小球系膜毛细血管中IgA-IgG沉积为特征，是全球最常见的原发性肾小球疾病，也是慢性肾脏病（CKD）和终末期肾病（ESRD）的主要病因之一。当前诊断金标准仍为肾活检，糖皮质激素虽可减少蛋白尿但长期获益存疑且伴有严重不良反应。血管钙化是CKD患者常见且重要的心血管危险因素，根据部位分为内膜性、中膜性和瓣膜性钙化，涉及Wnt、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/Akt等多条信号通路。目前尚无临床可行的血管钙化治疗和预防手段，也缺乏经验证的早期生物标志物。值得注意的是，IgAN患者血管钙化的分子机制尚未阐明。越来越多的证据表明血管钙化与IgAN进展共享多种潜在病理生理机制，包括慢性炎症状态、氧化应激升高、肾素-血管紧张素系统激活以及Wnt/β-catenin和BMP/Smad等共享细胞信号通路的失调。这种共同的机制基础提示，在IgAN中失调的血管钙化相关基因（VCRGs）可能不仅是心血管合并症的标志物，还可能在IgAN固有的肾损伤和纤维化中发挥直接作用。因此，系统研究VCRGs在IgAN中的表达模式和功能，有望从新视角理解疾病进展并鉴定对肾脏和心血管结局具有潜在预后价值的候选生物标志物。本研究核心假设是：利用转录组数据和机器学习（ML），可鉴定与血管钙化相关信号通路相关的关键基因作为IgAN患者的新型候选生物标志物。
**研究内容与结论**
研究人员利用公共转录组数据，结合血管钙化相关基因，通过差异表达分析、ML和表达水平验证，鉴定IgAN中与血管钙化相关的候选生物标志物，并进一步探究这些候选生物标志物参与的生物学功能、与免疫微环境的关联、涉及的分子调控网络以及潜在治疗药物预测。研究最终鉴定JUN、FOS和COL1A2为与血管钙化相关信号通路基因相关的IgAN候选生物标志物，为IgAN与钙化相关信号之间的潜在分子联系提供了探索性生物学见解，为IgAN治疗提供了新思路。
**关键技术方法**
研究从基因表达综合数据库（GEO）获取GSE93798数据集（20例IgAN患者和22例对照者的肾小球样本）作为训练数据集，GSE175759数据集（46例IgAN患者和22例对照者的肾小管间质样本）用于跨肾室外部表达评估。从KEGG数据库基于hsa04020、hsa04270、hsa04978、hsa04933、hsa04350和hsa05417通路获取709个VCRGs。采用limma包鉴定DEGs，通过STRING数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络并用Cytoscape可视化，利用cytoHubba插件进行网络拓扑分析。采用最小绝对收缩和选择算子（LASSO）回归、支持向量机-递归特征消除（SVM-RFE）和随机森林（RF）三种ML算法筛选特征基因。使用CIBERSORT算法评估免疫细胞浸润，通过CHIPBase和hTFtarget数据库预测转录因子，miRDB和ENCORI数据库预测microRNA（miRNAs），DSigDB进行药物预测，CB-DOCK2进行分子对接，SRAMP数据库预测m6A位点。
**研究结果**
*3.1 获取30个候选基因*
在GSE93798数据集中鉴定348个DEGs，其中107个基因上调、241个基因下调。通过整合DEGs与VCRGs，鉴定30个候选基因。候选基因显著关联167个基因本体论（GO）术语和45个KEGG通路，GO术语包括"以NAD(P)H为供体、以氧为受体的氧化还原酶活性"、"细胞因子产生的正向调控"和"NADPH氧化酶复合物"等，KEGG通路主要包括"脂质与动脉粥样硬化"和"MAPK信号通路"。
*3.2 鉴定JUN、FOS和COL1A2为候选生物标志物*
在PPI网络中鉴定30个相互作用蛋白。通过五种网络拓扑分析鉴定9个关键基因（JUN、FN1、FOS、COL1A2、IL1B、COL1A1、SERPINE1、MMP2和AGT）。LASSO回归获得6个特征基因1（lambda.min = 0.0004332147），SVM-RFE算法鉴定3个特征基因2，RF算法（ntree = 6）鉴定3个特征基因3。整合三种方法获得3个关键基因。在GSE93798和GSE175759数据集中进一步表达分析显示，JUN和FOS在IgAN组显著下调，COL1A2在IgAN组显著上调，因此将JUN、FOS和COL1A2归类为候选生物标志物（p < 0.05）。
*3.3 IgAN中的多条信号通路*
基因集富集分析（GSEA）显示JUN富集于1480条通路包括"Nagashima EGF信号通路"；FOS富集于1528条通路包括"Nagashima NRG1信号通路"；COL1A2富集于1722条通路包括"Nagashima EGF信号通路"。三种候选生物标志物共同富集的通路包括"Nagashima EGF信号通路"和"Nagashima NRG1信号通路"等。富集结果代表统计学关联，不确立直接通路激活或因果参与。
*3.4 候选生物标志物与免疫微环境的关联*
免疫浸润分析显示21种免疫细胞类型的比例，6种免疫细胞类型评分显示显著差异包括M2巨噬细胞（p < 0.05）。Benjamini-Hochberg校正后仅静息NK细胞在IgAN组与对照组之间显示显著差异（校正p < 0.05），IgAN组估计比例较低。Spearman相关分析显示COL1A2与静息NK细胞相关性最强（cor = ?0.57，p < 0.05），FOS与静息NK细胞相关（cor = 0.72，p < 0.01）。这些发现提示候选生物标志物可能与IgAN推断的免疫景观改变相关。
*3.5 探索候选生物标志物的分子调控机制*
JUN共享76个关键TFs，FOS关联40个关键TFs，COL1A2关联4个关键TFs。三种候选生物标志物共享3个关键TFs包括BRD4、MAZ和CTCF。JUN关联16个关键miRNAs，FOS关联17个关键miRNAs，COL1A2关联34个关键miRNAs。hsa-miR-139-5p同时与FOS和JUN关联。识别的调控网络包括hsa-miR-139-5p-FOS和hsa-miR-139-5p-JUN。药物预测显示电刚玉、乙醛和曲格列酮均与候选生物标志物相关。分子对接结果表明COL1A2、FOS和JUN均与曲格列酮展现良好结合亲和力，结合能分别为?8.7、?7.6和?8.1 kcal/mol。
*3.6 候选生物标志物中推定m6A位点的计算预测*
m6A甲基化位点结果显示所有三种候选生物标志物均具有高置信度甲基化位点。
**讨论与结论**
讨论部分指出，本研究采用生物信息学方法整合转录组数据与ML技术鉴定三个IgAN相关候选生物标志物。跨组织验证方法值得特别讨论：尽管肾小球损伤是早期IgAN的特征，但进展为CKD涉及肾小管间质纤维化和血管病理改变，研究发现JUN、FOS和COL1A2在肾小球和肾小管间质两个肾室中表现一致的表达模式。研究局限在于使用不同肾室的数据集进行训练和验证，肾小球和肾小管间质组织在细胞组成和组织特异性转录谱方面存在差异，因此跨数据集观察到的一致表达趋势应被解释为跨肾室支持性证据而非严格独立验证。虽然Zhou等此前报道JUN和FOS可作为区分IgAN患者与对照者的基因，但本研究的附加价值不在于首次鉴定JUN和FOS，而在于将这两个基因置于聚焦血管钙化相关通路的分析框架中，进一步突出COL1A2作为额外的候选生物标志物，并通过免疫细胞浸润关联、TF-mRNA和miRNA-mRNA调控网络构建、计算药物预测、分子对接和m6A位点预测扩展了分析。JUN和FOS是AP-1转录调控系统的组成部分，参与肾脏炎症、细胞损伤和应激反应过程。COL1A2在CKD中与细胞外基质沉积、组织重塑和肾纤维化相关。GSEA结果显示三种候选生物标志物共同与"Nagashima EGF信号通路"和"Nagashima NRG1信号通路"基因集相关，提示可能参与IgAN中EGF和NRG1相关信号过程。免疫浸润分析揭示六种免疫细胞类型在IgAN组与对照组之间显著差异。CIBERSORT从批量转录组数据估计相对免疫细胞比例，因此观察到的差异和关联代表计算推断的免疫特征而非实验证明的细胞-细胞相互作用。药物预测结果中曲格列酮虽因严重肝毒性已退出临床使用，但作为计算预测的工具化合物具有基础研究意义。CTCF被计算预测为与三种候选生物标志物相关的共享候选TF，但此预测关联不确认直接转录调控。m6A RNA修饰参与多种肾脏疾病，可能影响炎症、凋亡、纤维化和足细胞损伤。研究局限包括：所有结果均来自公共转录组数据，需要体外功能实验和体内动物模型验证；公共数据集缺乏血管钙化表型；ML分析基于cytoHubba预选的9个关键基因而非全部30个候选基因，可能存在特征选择偏倚；免疫浸润、GSEA、调控网络、药物预测、分子对接和m6A位点分析完全为计算或基于关联的分析，应被视为探索性和假设生成性的。
结论部分翻译：本研究通过生物信息学方法分析转录组数据（GSE93798和GSE175759）和VCRGs，最终鉴定JUN、FOS和COL1A2为与IgAN中血管钙化相关信号通路基因相关的候选生物标志物。探索性计算分析进一步表明这些候选生物标志物富集于EGF/NRG1信号通路并与差异免疫细胞（如M2巨噬细胞）相关。还预测了TF/miRNA调控网络和高置信度m6A位点。这些发现为所鉴定的候选生物标志物提供了探索性生物学背景，并为未来实验验证产生了假设。
