马铃薯蛋白肽作为MDCK细胞培养基血清减量补充剂的研究

《Food Science & Nutrition》：Potato Protein Peptides as a Serum-Reducing Supplement for MDCK Cell Culture Medium

　　

由酶解产生的食物源肽作为细胞培养的功能性生物材料已引起关注。本研究采用Flavorzyme对马铃薯蛋白进行酶解制备马铃薯蛋白肽（PPPs），并通过水解度、SDS-PAGE、游离氨基酸分析以及基于LC–MS/MS的肽段鉴定对其进行表征。在鉴定出的101条肽序列中，66条（65.35%）的分子量范围为500–1000 Da。随后评估了PPPs对MDCK细胞生长、代谢及冷冻保存的影响。MDCK培养的最适PPPs浓度为1 g/L。在第9代时，PPPs+5% NBS组的CCK-8估算细胞密度最高（9.11 × 10⁴ cells/mL），倍增时间为15.71 h，比生长速率为0.0163 ± 0.0002 h^?1。这些数值显著高于5%新生牛血清（NBS）对照组（p < 0.05），并与10% NBS对照组相当（p > 0.05）。PPPs+5% NBS组在培养过程中表现出与5%和10% NBS对照组不同的葡萄糖和乳酸浓度谱。在短期冷冻保存试验中，第10代细胞维持了正常的增殖和形态。在含血清冷冻保存液中补充PPPs也与良好的解冻后细胞恢复相关。总体而言，这些结果表明PPPs可作为MDCK细胞培养和冷冻保存中具有前景的血清减量补充剂。

**研究背景与意义**

马铃薯是全球重要的粮食作物和工业加工蛋白资源的主要来源。马铃薯淀粉加工过程中会产生富含蛋白质的副产物，如马铃薯果汁（PFJ），这激发了对马铃薯来源蛋白回收与增值利用的研究兴趣。酶解可通过生成具有潜在生物活性的低分子量肽来进一步改善马铃薯蛋白的功能特性。血清广泛用于哺乳动物细胞培养，因其提供细胞增殖所需的生长因子、激素、附着蛋白和其他营养物质。然而，血清的高经济负担、批次间变异性、伦理考量以及固有的外源污染风险等问题日益受到关注，推动了低血清和无血清培养策略的发展。蛋白水解物和富含肽的补充剂因其可提供 readily available 营养物质并可能发挥促生长生物效应而受到特别关注。

MDCK细胞因其特征性上皮形态、贴壁生长行为以及在流感疫苗生产中的既定应用而被选为实验模型。因此，开发在减少血清补充的同时维持MDCK细胞生长的培养策略对于提高疫苗相关细胞培养工艺的一致性并降低其对动物源成分的依赖具有重要意义。本研究旨在确定补充PPPs能否在减血清条件下支持MDCK细胞生长，并为未来开发更明确的低血清培养系统提供实验基础。

**关键技术方法**

研究人员采用Flavorzyme对马铃薯蛋白分离物进行酶解制备PPPs，通过水解度测定、SDS-PAGE、游离氨基酸分析仪检测以及LC–MS/MS肽段鉴定对产物进行表征。以MDCK细胞（ATCC CCL-34，来源于西北民族大学甘肃省动物细胞培养技术创新中心）为模型，设置10% NBS、5% NBS及PPPs+5% NBS三组，通过CCK-8法评估细胞增殖并计算倍增时间和比生长速率，采用结晶紫染色法测定细胞克隆率，利用多参数临床化学分析仪检测培养上清中葡萄糖和乳酸浓度，运用logistic生长模型进行生长动力学拟合，并通过短期冷冻保存与解冻复苏实验评估PPPs对细胞冻存效果的影响。

**研究结果**

3.1 马铃薯蛋白水解度：马铃薯蛋白的水解度达到42.83%。

3.2 PPPs分子量：SDS-PAGE分析显示，与未水解马铃薯蛋白相比，PPPs中高分子量条带变浅消失，低分子量区域出现弥散或新条带，表明蛋白酶成功将大分子蛋白切割为小肽片段。PPPs中蛋白完全水解，分子量均小于17 kDa。

3.3 PPPs游离氨基酸：PPPs共含24种游离氨基酸，总氨基酸（TAA）含量为38.44%，必需氨基酸（EAA）含量为13.22%（占总量34.4%），非必需氨基酸（NEAA）含量为25.22%（占总量65.9%）。

3.4 PPPs肽序列分析：共鉴定出101条肽序列，其中2条分子量大于3000 Da，2条在2000–3000 Da，31条在1000–2000 Da，66条在500–1000 Da。其中15条分布在900–1000 Da范围。质谱鉴定结果表明PPPs主要由分子量集中在500–1000 Da的短肽组成。

3.5 解冻后恢复：解冻后培养48 h，活细胞密度为8.31 × 10⁵ cells/mL，活率为92.8%。随后以5 × 10⁴ cells/cm²的接种密度连续传代三代，所有传代代次活率均维持在95%以上，证实了冷冻保存后稳健的恢复和增殖能力。

3.6 PPPs对MDCK细胞密度的影响：第7代MDCK细胞培养48 h后呈现浓度依赖性形态响应。0.5–2 g/L PPPs维持了相对紧密的细胞排列、清晰的细胞边界和良好的单层形成；而3–5 g/L PPPs导致细胞伸长、聚集、单层覆盖减少和细胞丰度明显下降。1 g/L PPPs在后期传代中对MDCK细胞生长表现出最有利的效应，确定为最佳浓度。

3.7 PPPs对CCK-8衍生生长参数的影响：第3代时，10% NBS组最大估算细胞密度最高，PPPs+5% NBS组次之，5% NBS组最低；PPPs+5% NBS组倍增时间为22.77 h，与10% NBS组相当且显著短于5% NBS组。第5代时，PPPs+5% NBS组倍增时间显著缩短至16.56 h，比生长速率显著高于两对照组。第7代时，PPPs+5% NBS组倍增时间为16.35 h，与10% NBS组（16.42 h）无统计学差异但显著短于5% NBS组（18.73 h）。第9代时，PPPs+5% NBS组CCK-8估算最大细胞密度达9.11 × 10⁴ cells/mL，倍增时间15.71 h，比生长速率0.0163 ± 0.0002 h^?1，为所有组中最短倍增时间和最高比生长速率。

3.8 细胞克隆率：10% NBS对照组、5% NBS对照组和PPPs+5% NBS组的细胞克隆率分别为43.6%、39.8%和45.1%，PPPs+5% NBS组克隆率高于两对照组。

3.9 PPPs对MDCK细胞培养中葡萄糖和乳酸浓度的影响：各组葡萄糖浓度随时间总体下降，乳酸浓度逐步升高。PPPs+5% NBS组表现出介于两对照组之间的持续葡萄糖下降和最高的乳酸升高幅度。三种培养条件表现出不同的葡萄糖和乳酸浓度谱。

3.10 PPPs对细胞生长动力学的影响：logistic生长模型拟合结果显示，PPPs+5% NBS组的μmax（0.0406 h^?1）和Xmax（3.519 × 10⁵ cells/mL）更接近10% NBS对照组。

3.11 PPPs对短期细胞冷冻保存与复苏的影响：复苏后24 h细胞轮廓清晰，48 h时MDCK细胞基本长满培养瓶表面形成紧密单层，活细胞密度达90%以上，表明含PPPs培养基培养的MDCK细胞在短期冷冻保存和复苏后维持了活力和正常增殖。

3.12 PPPs部分替代血清用于细胞冷冻保存的效果：复苏后24 h和48 h形态学观察显示，C、D、E组复苏后细胞大小和形状与对照组相当，D组形态与对照组无法区分；B组24 h细胞密度低、48 h增殖缓慢、细胞分散拉伸；A组24 h细胞密度极低、贴壁严重受损。表明PPPs单独不能完全替代血清，但在保留一定量血清的冻存配方中可部分减少血清需求。

**讨论与结论**

讨论部分指出，血清减量补充剂和血清替代品的开发已成为哺乳动物细胞培养的重要研究方向，旨在降低动物源血清相关的成本、批次间变异性和潜在生物安全风险。蛋白水解物因含有肽、游离氨基酸和其他可能支持细胞生长的成分而显示出相当大的潜力。本研究通过成分表征、连续传代实验、集落形成实验、细胞外代谢物测定、生长动力学建模和解冻后恢复观察，评估了PPPs用于减血清MDCK细胞培养的潜力。PPPs表现出浓度依赖性效应，1 g/L提供最有利的增殖和形态特征，更高浓度（3–5 g/L）与细胞伸长、聚集和细胞密度降低相关，其机制有待进一步研究。CCK-8校准曲线在10% NBS条件下建立并应用于其他培养条件，因此衍生的细胞密度和动力学参数应解释为相对生长的近似指标而非精确绝对测量。克隆形成实验结果表明PPPs补充可能支持减血清条件下的集落形成。代谢物浓度监测显示PPPs补充与独特的细胞外葡萄糖和乳酸浓度谱相关，但由于采样时补充了新鲜培养基，这些测量代表时间点特异性浓度而非累积消耗或产生速率。冷冻保存实验表明PPPs单独不足以替代血清，而将其与残留血清组合可能有助于维持解冻后细胞恢复。总体而言，本研究为PPPs作为MDCK细胞培养中血清减量补充剂的潜在应用提供了证据，但仍需进一步的定量验证和机制研究，包括鉴定PPPs的生物活性肽组分、阐明其浓度依赖性效应的机制、进行直接细胞计数和定量代谢分析，以及评估PPPs对病毒复制和抗原产量的影响。

结论部分翻译：本研究确定1 g/L为在减血清条件下支持MDCK细胞生长的最佳PPPs浓度。在此浓度下，PPPs改善了细胞增殖并维持了良好的克隆形成和形态学特征。在冷冻保存实验中，含PPPs的减血清配方支持了满意的解冻后恢复，表明PPPs可能有助于减少MDCK细胞培养和冷冻保存中的血清需求。总体而言，PPPs显示出作为MDCK细胞培养和冷冻保存血清减量补充剂的潜力。仍需进一步研究以确立其作用机制、长期培养性能以及疫苗相关应用的适用性。