《Drug Testing and Analysis》：Detection of Lower Molecular Mass Peptides, Steroid Esters, and Multi-Class Substances in a Single Dried Blood Spot for Comprehensive Initial Testing in Doping Control
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干血斑（DBS）已成为反兴奋剂检测中日益重要的基质，其优势之一在于可直接获取循环中的原型化合物。然而，单个干血斑可获得的血液量有限，构成显著的分析挑战，尤其是在世界反兴奋剂机构（WADA）干血斑检测指南纳入低分子质量肽之后。现有分析方法主要专用于肽类分析，未能
干血斑（DBS）已成为反兴奋剂检测中日益重要的基质，其优势之一在于可直接获取循环中的原型化合物。然而，单个干血斑可获得的血液量有限，构成显著的分析挑战，尤其是在世界反兴奋剂机构（WADA）干血斑检测指南纳入低分子质量肽之后。现有分析方法主要专用于肽类分析，未能在常规反兴奋剂工作流程中实现其他禁用物质的同时检测。本研究旨在开发并验证一种综合的液相色谱-高分辨串联质谱（LC-HRMS/MS）工作流程，用于从单个干血斑中同时检测低分子质量肽、蛋白同化类固醇酯及无最低报告水平（MRL）的禁用非阈值物质，干血斑分别采集于Tasso-M20装置和纤维素基DMPK-C卡片。方法验证依据现行WADA初始检测程序要求进行，包括选择性、可靠性、检测限、提取物稳定性、残留和稳健性的评估。所开发方法在两种干血斑采集装置上均满足所有验证标准，并实现了对所有研究的完整肽类以及类固醇酯和多类别禁用物质的灵敏检测。该工作流程首次实现了从单个干血斑同时检测低分子质量肽、类固醇酯和多类别禁用物质。这一整合策略减少了样本消耗，简化了实验室工作流程，并保留额外的干血斑材料用于确证或补充分析，为常规干血斑反兴奋剂检测提供了实用且灵活的策略。
研究背景方面，干血斑（DBS）已成为运动药物检测中日益重要的基质，并近期被世界反兴奋剂机构（WADA）纳入常规反兴奋剂计划。与传统静脉采血相比，DBS采样具有运输和储存简化、采集微创以及分析物稳定性可能改善等实用优势。此外，基于血液的检测可直接获取循环原型化合物，从而补充传统尿液分析所得信息。然而，DBS中有限的样本体积仍是显著的分析挑战，尤其当需要监测多类别禁用物质时。目前可用的DBS采集装置包括纤维素基卡片和聚合物支持物，每份运动员样本通常仅可获得三至四个斑点，须同时支持初始检测程序（ITP）和潜在的确证程序（CP）。随着WADA DBS检测技术文件（TD2026DBS）的实施，该挑战愈发突出，该文件涵盖广泛特性的禁用物质，包括无适用最低报告水平（MRL）的非阈值物质、蛋白同化类固醇酯以及近期纳入的低分子质量肽。该亚组禁用物质包括多种肽类药物和肽模拟物，如生长激素释放肽（GHRPs）和胃饥饿素受体激动剂、生长激素片段、促性腺激素释放激素（GnRH）类似物、生长因子、抗利尿激素类似物及相关化合物。大多数此类肽无人体医用批准，药代动力学数据匮乏，其检测主要依赖尿液分析，但若干肽代谢迅速、稳定性有限或尿检窗口较短，使血液中完整原型化合物的检测成为有吸引力的补充方法。然而，仅有有限方法涉及DBS中大量肽类的LC-HRMS/MS同时筛查，且所有已发表方法主要将肽分析作为独立分析手段。此前研究报道了利用单斑点同时检测多类别禁用物质和类固醇酯的LC-HRMS/MS筛查方法。TD2026DBS纳入低分子质量肽推动了开发能够处理该额外类别禁用物质的分析方法的需求，更重要的是创造了将肽分析整合到已用于同时检测多类别禁用物质和类固醇酯的同一分析策略中的机会。因此，本研究旨在开发并验证一种综合LC-HRMS/MS方法，实现从纤维素基（DMPK-C）和聚合物基（Tasso-M20）DBS采集装置获得的单个斑点中同时检测无适用MRL的禁用非阈值物质、蛋白同化类固醇酯（睾酮、诺龙和勃地酮酯）及三十三种低分子质量肽及其相关代谢物。由于研究面板还包括肽模拟物（relamorelin）和选定非肽分子（anamorelin、capromorelin和ibutamoren），文中"肽"一词统称所有这些分析物。此外，研究旨在建立分析工作流程，通过统一策略最大化单个DBS样本所获信息，同时最小化样本消耗、保留材料用于潜在确证分析，并根据兴奋剂检测要求提供分析过程的灵活性。
研究人员开展的研究方面，方法验证所用全血和DBS样本采集自十名健康成年志愿者（男女均有），其在采样前48小时内未服用任何药物。静脉血采集于EDTA管，DBS样本使用Tasso-M20装置和DMPK-C卡片采集。所有参与者在参与前签署书面知情同意书。研究经当地伦理委员会批准（DSHS No. 139/2021）。样本制备程序适用于Tasso-M20聚合物装置和纤维素基DMPK-C卡片（8 mm打孔）采集的DBS样本。提取前，样本加入20 μL内标（ISTD）溶液，除用于多类别禁用物质和类固醇酯同时检测的ISTDs外，还含有d3-GHRP-2 (1–3)-OH（20 ng/mL）和[13C6,15N]-Leuprolide（20 ng/mL）。样本用500 μL甲醇/水（80:20, v/v）在室温超声浴中提取20 min，随后以13,300 rpm离心5 min。所得提取物分为两个250 μL等分试样，转移至含5 μL 0.3 M HCl的独立管中。两等分试样在约45°C真空离心机中蒸干1 h。对于低分子质量肽分析，一份等分试样用80 μL H2O/ACN（9:1, v/v）复溶，涡旋并以13,000 rpm离心10 min，上清液转移至HPLC小瓶，同一小瓶用于多类别物质筛查。对于类固醇酯分析，另一份等分试样经肟衍生化后用80 μL 8 mg/mL甲氧胺溶液（溶于80%甲醇）复溶，涡旋后80°C孵育30 min促进肟形成，以13,000 rpm离心10 min后上清液转移至HPLC小瓶进行LC-HRMS/MS分析。对于低分子质量肽分析，采用两套互补LC-HRMS/MS系统。大多数目标肽使用Vanquish UHPLC系统与Orbitrap Exploris 480质谱仪联用分析，色谱分离采用包含在线捕获步骤的双泵配置，分析物首先保留在Accucore Phenyl-Hexyl捕获柱（3 × 10 mm, 2.6 μm）上，捕获流动相为0.1%甲酸水溶液（A1）和0.1%甲酸ACN溶液（B1），捕获步骤中分析物在99%溶剂A1初始条件下保留2 min，随后流路切换至Poroshell EC-C18分析柱（3 × 50 mm, 2.7 μm），色谱分离采用线性梯度，总运行时间20 min。分离流动相为含1% DMSO的0.1%甲酸水溶液（溶剂A）和含2% DMSO的0.1%甲酸ACN溶液（溶剂B），初始流动相组成为1% B，流速350 μL/min，溶剂B比例从2至15 min线性增至40%，随后0.5 min内增至90%并保持1.5 min，之后恢复初始条件再平衡3 min，进样体积20 μL。质谱检测采用正电喷雾电离（ESI）模式，电离电压4000 V，传输管温度320°C，全扫描质谱在m/z 230–1500范围内以60,000 FWHM分辨率采集。靶向单离子监测（tSIM）实验采用m/z = 3隔离窗口和45,000 FWHM分辨率，使用包含列表针对表1所列目标肽和ISTDs最丰电荷态进行。由于第一套LC-HRMS/MS系统存在在线捕获柱，若干相对高极性目标肽未被保留而无法检测。为分析这些化合物，同一进样小瓶注入第二套LC-HRMS/MS系统，采用此前发表的多类别禁用物质检测方法。简言之，LC-HRMS/MS分析使用Vanquish Flex UHPLC系统与Orbitrap Exploris 120质谱仪联用，色谱分离使用EC 4/3 Nucleoshell RP 18 plus预柱（5 μm, 4 × 3 mm）和Poroshell 120 EC-C18分析柱（2.7 μm, 3 × 50 mm），流动相为0.1%甲酸水溶液（溶剂A）和0.1%甲酸ACN溶液（溶剂B），质谱仪在正ESI模式下操作，电离电压3500 V，离子传输管温度350°C，正ESI采集方法包括m/z 100–1200范围全扫描谱图，分辨率60,000 FWHM，这些全扫描数据可实现表1所列额外目标肽和ISTDs的检测。值得注意的是，同一次进样还用于正ESI模式结合数据独立分析（DIA）的多类别禁用物质同时筛查。另一次负ESI模式DIA进样用于检测优先在负模式下电离的多类别化合物。此外，相同仪器配置、色谱柱和流动相用于从另一小瓶分析类固醇酯，采用此前报道的靶向MS/MS方法。数据处理使用Thermo Xcalibur软件（版本4.0.27.10, 2015）和Thermo TraceFinder软件（版本5.2, 2022）。方法验证依据现行WADA初始检测程序（ITP）指南进行，评估选择性、检测限（LOD）、可靠性、提取物稳定性、残留和稳健性等主要验证参数。选择性使用十名健康志愿者（五男五女）采集的DBS样本研究，每种采集装置分析十个DBS样本以评估目标肽保留时间处潜在内源性干扰。可靠性使用十名健康志愿者（五男五女）采集于EDTA收集管的静脉血样本评估，全血在制备DBS样本前加入所有目标肽至20 ng/mL浓度，该浓度选为验证水平，对应WADA TD2026DBS中低分子质量肽确立的最低必需性能水平（MRPL）。LOD分别对Tasso-M20装置和DMPK-C卡片测定，通过评估六个独立制备的DBS样本在10、5和2 ng/mL浓度下的检测率，分别对应MRPL的50%、25%和10%。提取物稳定性通过处理样本在自动进样器中10°C储存五天后重新分析评估。残留通过在注射80 ng/mL加标DBS样本后分析空白样本评估。稳健性通过不同日期和不同分析人员分析独立制备的样本评估。
研究结果方面，方法开发部分，最初目标是开发专用于DBS中低分子质量肽检测的LC-HRMS/MS筛查方法，方法开发聚焦于优化提取程序以最大化肽回收率，同时保持适合常规反兴奋剂检测的简单稳健工作流程。优化过程中发现，对所研究肽提供满意性能的提取条件与此前建立的多类别禁用物质和类固醇酯同时检测DBS工作流程完全兼容，这些发现使低分子质量肽直接纳入现有工作流程成为可能，而非开发单独分析程序。具体而言，为优化肽提取，评估了不同甲醇/水混合物（0:100、20:80、40:60、50:50、60:40、80:20和100:0, v/v），富水溶剂提取导致相对较差的肽回收率，而随甲醇含量增加观察到显著改善，最佳总体分析性能在含50%至80%甲醇的提取溶剂中获得，而100%甲醇提取导致若干目标肽响应降低。尽管所选甲醇/水（80:20, v/v）提取溶剂未对每个单独肽提供最高响应，但在所研究分析物中产生满意回收率，同时对应于此前的多类别禁用物质和类固醇酯验证工作流程的提取条件，因此维持该溶剂组成以在不修改提取程序的情况下实现肽分析直接整合到现有分析工作流程中。提取体积随后通过评估150、250、300、400和500 μL提取溶剂体积优化，250 μL提取体积足以实现肽检测的足够灵敏度，然而最终工作流程选择此前建立的500 μL提取体积，因其允许提取物分为两个等分试样，因此500 μL的选择主要驱动于与现有综合DBS工作流程的兼容性而非肽提取效率。提取溶剂组成和体积优化结果与近期报道的肽专用DBS方法一致。最后，研究了使用0.5 mL Amicon Ultra过滤单元（10 kDa截留分子量）的离心超滤作为替代样本净化策略，该方法产生更清洁的肽提取物并消除LC-HRMS/MS分析前蒸发和复溶的需要，尽管对所研究肽获得满意回收率，但若干多类别禁用物质观察到显著降低的回收率，表明过滤过程中分析物损失，因此该方法被认为与综合多类别筛查目标不兼容而未纳入最终分析工作流程。仪器配置的选择主要指导于将肽分析整合到现有常规筛查工作流程的目标，用于肽分析的LC-HRMS/MS系统利用含DMSO流动相增强肽检测并包含在线捕获柱作为其既定配置的一部分，尽管若干相对极性肽未被捕获柱充分保留，这些化合物可使用已用于多类别和类固醇酯DBS筛查的互补LC-HRMS/MS系统监测，而无需在综合工作流程中额外进样。当肽分析独立请求时，该策略需要两次进样，与专用肽筛查方法相比在仪器时间方面构成限制，然而仅肽请求占常规DBS分析相对较小比例，额外进样被认为比反复修改现有色谱配置及执行相关系统调节和平衡更实用。测定表征部分，所开发方法满足现行WADA ITP要求，证明适用于Tasso-M20聚合物装置和纤维素基DMPK-C卡片采集的DBS中低分子质量肽检测。在十名健康志愿者空白样本中所研究分析物保留时间处未观察到干扰信号，确认方法对两种DBS采集方法的选择性。此外，所有目标肽在所选20 ng/mL验证水平下在Tasso-M20装置和DMPK-C卡片采集的所有十个加标样本中均被检出，检测率100%。所测LOD总结于表1。总体而言，两种DBS采集装置之间观察到分析灵敏度差异，对于DMPK-C卡片，几乎所有目标肽LOD约为2 ng/mL，而对于Tasso-M20装置，LOD范围为2至10 ng/mL，取决于分析物。两种采集方法之间的这些差异与近期发表的多靶标DBS肽筛查方法一致，其中Tasso装置采集的样本同样观察到通常更高的LOD。尽管存在这些差异，所有研究的完整肽均满足现行WADA指南常规初始检测的性能要求。虽然此前DBS肽筛查研究报道了更低的LOD，但由于分析工作流程、样本制备程序（提取物分割）和LOD评估策略的差异，直接比较应谨慎进行，因为本研究未研究低于WADA MRPL 10%的浓度。对于可使用两套LC-HRMS/MS仪器可靠检测的肽，选择提供较低LOD的分析设置用于最终工作流程。整体分析工作流程提供足够灵敏度，使用两种采样方法可检测六十六种目标分析物，包括完整肽及其相关代谢物，从而提供低分子质量肽类的广泛分析覆盖。注射80 ng/mL加标DBS样本后未观察到残留，随后分析的空白样本中未检出任何目标分析物。处理提取物在自动进样器中10°C储存至少五天保持稳定，所有目标分析物对Tasso和卡片均维持100%检测率。方法稳健性通过不同日期和不同分析人员执行的分析进一步证明，对分析物检测无不良影响。尽管验证方法中包含代表性肽代谢物，但分析策略主要靶向完整原型肽，因为肽代谢物通常预期不是血液中的主要分析物。结果评估中观察到的另一个方面是若干低分子质量肽表现出足够丰度的第一同位素峰（M+1），主要源于天然存在的13C同位素体，可在ITP评估中作为第二诊断离子。由于该同位素体与单同位素前体具有相同电荷态并出现在理论预期同位素间距处，其检测为高分辨质谱评估中的分析物身份提供补充证据。常规工作流程部分，所提出工作流程通过首次在单一综合分析策略中实现低分子质量肽、类固醇酯和多类别禁用物质的联合检测，最大化单个DBS样本的分析潜力。提取后样本分为两个等分试样，允许在两套质谱平台上执行最多四次LC-HRMS/MS进样：一次用于肽分析，一次用于类固醇酯，两次用于正负ESI模式的多类别禁用物质，选定肽在正电离采集中间时监测。尽管有如此广泛的分析覆盖，仍有两至三个斑点（取决于采样装置）可用于后续确证分析。重要的是，第二个单斑点也可用于跨所有这些物质类别的多项发现的确证，而非需要为每项确证单独斑点。因此，即使需要多项确证，仍有更多DBS材料可用于补充分析（如需要时的EPO检测），优于单独筛查工作流程。因此，所提出策略最大化单个DBS样本所获分析信息，同时最小化样本消耗。除综合工作流程外，所开发平台提供 considerable灵活性，可根据分析请求调整而维持共同提取程序。取决于所需检测范围，低分子质量肽、类固醇酯和多类别禁用物质可从同一DBS样本单独或不同组合分析。对于靶向单一物质类别的常规应用，基本工作流程仅需一次500 μL提取溶剂提取而无需样本分割，从而最小化样本处理同时维持所需分析性能。当请求两类物质同时分析时，可采用高级工作流程。取决于所选组合，提取物可直接分析（多类别禁用物质与肽）或分为两个等分试样（含类固醇酯的组合）。这些策略使得从已制备提取物执行额外分析而无需二次提取程序。此外，近期引入的通过Thermo Fisher Stellar质谱仪LC-MS3无衍生化分析类固醇酯的可能性提供了替代工作流程，进一步增强所提出分析平台的灵活性。所有常规工作流程概述于表2。
讨论部分总结，所开发并验证的综合LC-HRMS/MS工作流程首次实现从单个DBS同时检测低分子质量肽、类固醇酯和广泛无MRL非阈值禁用物质，DBS采集于聚合物基和纤维素基采样装置。该方法满足现行WADA ITP要求，展示足够的选择性、灵敏度、可靠性、稳健性、提取物稳定性和无残留。通过将低分子质量肽分析整合到此前建立的类固醇酯和多类别禁用物质DBS工作流程中，所提出策略在不增加样本消耗的情况下大幅扩展DBS反兴奋剂检测的分析能力。除综合工作流程外，所开发平台提供灵活分析策略，可适应不同检测请求而维持共同提取程序。最重要的是，所提出工作流程首次实现从单个DBS斑点同时检测低分子质量肽、类固醇酯和多类别禁用物质，同时保留额外DBS材料用于潜在确证或补充分析。因此，所提出工作流程为反兴奋剂实验室提供实用、灵活且可扩展的分析平台，支持DBS检测的持续扩展，因为新类别禁用物质可能将纳入未来WADA法规。研究结论翻译：开发并验证了一种综合LC-HRMS/MS工作流程，用于从聚合物基和纤维素基采样装置采集的单个DBS中同时检测低分子质量肽、类固醇酯和广泛无MRL非阈值禁用物质。该方法满足现行WADA ITP要求，展示足够的选择性、灵敏度、可靠性、稳健性、提取物稳定性和无残留。通过将低分子质量肽分析整合到此前建立的类固醇酯和多类别禁用物质DBS工作流程中，所提出策略在不增加样本消耗的情况下大幅扩展DBS反兴奋剂检测的分析能力。除综合工作流程外，所开发平台提供灵活分析策略，可适应不同检测请求而维持共同提取程序。最重要的是，所提出工作流程首次实现从单个DBS斑点同时检测低分子质量肽、类固醇酯和多类别禁用物质，同时保留额外DBS材料用于潜在确证或补充分析。因此，所提出工作流程为反兴奋剂实验室提供实用、灵活且可扩展的分析平台，支持DBS检测的持续扩展，因为新类别禁用物质可能将纳入未来WADA法规。
