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摘要
鸡胚胎窗口模型通过蛋壳上的窗口直接观察发育中的胚胎，这一独特方法在发育生物学、血管生成、肿瘤生长等领域取得了重要发现。传统上，通常在孵化第3天（D3）沿蛋的长轴切割窗口，这种方法称为“侧窗法”，以便对胚胎进行化学或物理操作。最近，鸡胚胎越来越多地被用于涉及晚期发育阶段
摘要
鸡胚胎窗口模型通过蛋壳上的窗口直接观察发育中的胚胎，这一独特方法在发育生物学、血管生成、肿瘤生长等领域取得了重要发现。传统上，通常在孵化第3天（D3）沿蛋的长轴切割窗口，这种方法称为“侧窗法”，以便对胚胎进行化学或物理操作。最近，鸡胚胎越来越多地被用于涉及晚期发育阶段操作的肌肉骨骼发育研究。不幸的是，采用侧窗法处理的胚胎随着时间的推移活力迅速下降，发育状况也发生显著变化，这可能是由于需要取出蛋清并停止摇动以防止蛋清通过窗口溢出。值得注意的是，侧窗法必须在D3之前完成，以避免损伤之后附着在蛋壳上的绒毛尿囊膜。而“气室窗口”模型则是在更晚的发育阶段通过气室切割窗口，且在过程中不需要去除蛋清，有可能克服这些缺点。我们证明了在较晚发育阶段实施气室窗口法的可行性，并发现其与正常对照组相比在活力和肌肉骨骼发育方面没有显著差异。因此，晚期气室窗口模型适用于需要在更高发育阶段进行操作的鸡胚胎研究。
引言
鸡胚胎是一种成熟的模型，适用于研究早期发育事件，近年来也逐渐被用于晚期发育阶段的研究。鸡胚胎的独特优势包括快速发育（在孵化第21天即可孵化）以及可以通过其蛋壳上的窗口直接进行卵内观察。相比之下，哺乳动物胎儿的观察需要复杂的子宫内手术。鸡胚胎窗口模型已在发育生物学[1]、[2]、[3]、[4]、[5]、血管生成[6]、肿瘤生长与转移[7]等领域取得了许多重要发现。
在晚期胚胎阶段对鸡胚胎的研究对肌肉骨骼研究尤为重要。晚期窗口培养技术允许进行胚胎处理、靶向注射、手术，甚至使用生物反应器在发育过程中控制肢体运动，从而在肌肉骨骼发育和愈合方面取得了新的发现[10]、[11]、[12]、[13]、[14]。
传统上，窗口切割是在D3之前沿蛋的长轴进行的，此时绒毛尿囊膜（CAM）尚未附着在蛋壳上。这种“侧窗法”（SW）处理的蛋随后会继续孵化以完成胚胎发育。该模型最早于1749年通过实验报道[15]。然而，随着发育阶段的推进，胚胎的活力会显著下降，到D17时活力可能降至33%[12]。此外，晚期胚胎还存在器官和组织异常的问题，尽管这个问题尚未得到全面研究。
侧窗法的低活力部分原因在于需要去除蛋清（总体积的10%或更多），以便在蛋壳下创造空间，避免损伤胚胎、绒毛尿囊膜或蛋黄，同时防止蛋清通过窗口溢出[10]、[12]。蛋清为胚胎提供必需的营养物质，维持其生存环境，并形成抵御病原体的屏障[16]。然而，即使只去除10%的蛋清也会导致器官发育异常[17]、[18]，胚胎质量下降，孵化率仅维持在10%[16]、[19]。一种无需去除蛋清的窗口模型有望提高胚胎活力，促进更正常的发育。
母鸡在孵化期间会定期翻转受精蛋以促进胚胎正常发育[20]。然而，尽管有数据表明D3至D8期间的静态孵化会导致孵化率下降75%[20]、[21]、[22]，但实际操作中仍常常采用静态孵化方式。在D8之前摇晃蛋壳可能有助于提高胚胎活力，促进正常发育。
为了解决侧窗法的缺点，我们提出使用“气室窗口”（AW）模型，在更晚的发育阶段直接在气室上切割窗口，无需去除蛋清。与传统侧窗法相比，AW模型可以保留蛋清量，并延长窗口切割前的摇动时间。尽管AW模型最早在1749年被描述[15]，但相关研究较少[11]、[23]、[24]、[25]、[26]、[27]。目前仍缺乏关于AW对胚胎器官和肌肉骨骼组织发育影响的系统研究。本文基于活力及器官和肌肉骨骼组织的发育情况，全面评估了AW和侧窗法的优缺点。
部分摘要
动物模型
实验用的受精白来航鸡卵由马里兰大学动物科学系提供。所有实验均遵循马里兰大学机构动物护理和使用委员会的法规及批准（参考编号R-DEC-24–38）。卵子以钝面朝上的方式在37.5°C和50%的湿度下孵化，并每小时摇动一次（设备来自GQF Manufacturing Company, GA）。在D3时随机选择一些卵子进行侧窗处理（SW-D3）。
AW-D9组的活力与对照组相似，而SW-D3组的活力在D18时显著降低
SW-D3组的活力低于NW-Rock组和NW-NR-D3组，而NW-NR-D3组的活力与NW-Rock组相近（图2A，S1A）。AW-D6组的活力也低于NW-Rock组和NW-NR-D6组，但NW-NR-D6组的活力与NW-Rock组相近（图2B，S1B）。SW-D3组和AW-D6组的活力低于各自的NW-NR组，表明除了摇动与否之外，还有其他因素影响了它们的活力。AW-D9组的活力与NW-Rock组和NW-NR-D9组相近（图2C，S1C）。
讨论与结论
我们发现，在较晚发育阶段进行窗口处理后，胚胎的活力更高，发育差异也比其他处理方法更小。AW模型无需去除蛋清，减少了损伤绒毛尿囊膜的风险，并允许延迟窗口切割时间，从而延长摇动时间，同时减少了胚胎暴露于外界空气和潜在污染的时间。AW组的发育阶段和肌肉骨骼组织发育情况与正常对照组相似。
资金支持
本研究得到了美国国立卫生研究院（R01AR072886项目）的支持，资助对象为CKK。
作者贡献声明
Christoph Hart：概念提出、方法设计、实验实施、数据分析、初稿撰写及审稿编辑。Kamryn Henderson：方法设计、实验实施。Ruth Efrem：实验实施。Philip L.F. Johnson：数据分析。Catherine K. Kuo：概念提出、方法设计、资金申请、实验监督、初稿撰写及审稿编辑。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
术语表
- ANOVA
- 方差分析
- AW
- 气室窗口
- AW-D6
- D6时制作的气室窗口
- AW-D9
- D9时制作的气室窗口
- CAM
- 绒毛尿囊膜
- D
- 发育日
- GAG
- 糖胺聚糖
- H&E
- 苏木精和伊红
- NW-NR-D3
- D3开始时未进行窗口处理且未摇晃的实验组
- NW-NR-D6
- D6开始时未进行窗口处理且未摇晃的实验组
- NW-NR-D9
- D9开始时未进行窗口处理且未摇晃的实验组
- NW-Rock
- D18为止进行窗口处理并摇晃的实验组
- PSR
- Picrosirius红荧光染料
- SW
- 侧窗法
- SW-D3
- D3时制作的侧窗
Christoph Hart | Kamryn Henderson | Ruth Efrem | Philip L.F. Johnson | Catherine K. Kuo马里兰大学Bioengineering系，美国马里兰州College Park市
