《Ecology and Evolution》：Envenomation Leads to Venom Protein Reduction and a Recovery Period in Bumblebee Workers
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动物毒液系统的演化与部署对其生态成功至关重要，但并非没有代价。对于社会性蜜蜂而言，毒液在巢穴防御中发挥关键作用；然而对于蜜蜂等物种，螫刺行为通常导致个体死亡。但对于熊蜂等其他社会性蜜蜂物种，螫刺显然不致命，这引发了关于毒液使用（排毒）是否伴随后果的问题。本研究
动物毒液系统的演化与部署对其生态成功至关重要，但并非没有代价。对于社会性蜜蜂而言，毒液在巢穴防御中发挥关键作用；然而对于蜜蜂等物种，螫刺行为通常导致个体死亡。但对于熊蜂等其他社会性蜜蜂物种，螫刺显然不致命，这引发了关于毒液使用（排毒）是否伴随后果的问题。本研究通过蛋白质组学方法，探究了熊蜂（Bombus terrestris）工蜂在排毒后短时间进程内毒液囊（毒液储存的主要储库）中发生的分子层面变化。分析揭示了三个关键发现：（1）排毒导致毒液囊蛋白质组发生变化，受影响蛋白质在熊蜂毒液囊中普遍减少，提示存在分子层面的代价；（2）排毒后传统毒液相关蛋白的定量减少表明个体毒液蛋白丰度在使用后发生变化；（3）熊蜂排毒后需要恢复期以恢复至非排毒状态，进一步表明毒液使用相关的潜在分子层面代价。总体而言，研究结果为熊蜂毒液使用的分子后果提供了新见解。
研究背景方面，捕食与竞争对个体施加选择压力，促使适应性策略和性状演化以增强生存能力。毒液作为一种演化创新，已在众多生物中演化以辅助捕食和防御，通过诱导疼痛、瘫痪甚至死亡对捕食者和骚扰者形成强烈威慑。毒液是含有大量小肽、蛋白质、毒素以及多胺、有机分子和盐类的高复杂度生物活性化合物混合物。有毒动物通过排毒过程主动将自身合成的毒液注入目标，扰乱正常生理或生化过程，在捕食和防御中发挥关键作用。毒液在动物谱系中至少独立演化了101次，凸显其演化与生态重要性。然而，尽管毒液使用在捕食和防御中具有明显优势，维持和使用毒液系统可能在能量上代价高昂，既涉及产物合成也涉及使用后再生。例如，蛇、蜘蛛和蝎子在毒液再生期间代谢率增加，再生可能持续数天至数周。这表明毒液使用在能量上代价高昂，因此不应浪费性使用。有毒动物已演化出通过生理、形态和行为适应 favoring 保守性毒液使用的策略，如毒液优化假说所假设。对于社会性昆虫如蜜蜂，毒液主要用于防御，但使用毒液的代价在生态背景下的研究有限。蜜蜂中研究最充分的西方蜜蜂（Apis mellifera）凸显了巢穴防御中个体自我牺牲的代价——螫刺后因螫针器官自切而死亡。然而，熊蜂等其他螫刺蜜蜂不具备蜜蜂工蜂的倒钩结构，可反复螫刺无脊椎动物和脊椎动物威胁。与蜜蜂数千只的群体相比，熊蜂群体较小（约150–300只工蜂），工蜂对群体生产力和防御可能更为重要。熊蜂表现出多种情境依赖性行为 repertoire，但关于熊蜂工蜂毒液使用相关潜在分子代价的认识目前尚不清楚。此类分子代价可能反映在毒液蛋白丰度变化中，对再生提出能量需求，并限制毒液的重复使用或效力。为理解排毒是否导致熊蜂毒液蛋白丰度变化及毒液再生时间，研究人员采用基于质谱的蛋白质组学方法，研究了熊蜂工蜂排毒后短时间进程（1、24、168小时）内毒液囊蛋白质组的变化。选择毒液囊是因为其作为毒液蛋白储存的储库，毒液蛋白主要在相连的管状毒液腺中产生。因此，毒液囊蛋白质组的蛋白质变化可提供排毒后分子响应和恢复的见解。由于毒液再生潜在能量代价高昂，研究人员预测排毒导致：（1）毒液囊蛋白质组变化；（2）已知毒液蛋白丰度降低；（3）与对照蜂非排毒水平相比毒液相关蛋白丰度降低的时期。
研究人员开展的研究方面，熊蜂（Bombus terrestris）群体（n=5）购自Koppert Biological Systems（荷兰），在28°C恒定条件和红光照明下饲养，随意提供糖水（Apiinvert，德国）和花粉（Biobest，比利时）。从每个来源群体中，在羽化后48小时内收集新羽化工蜂（因色泽较亮和翅膀折叠可区别于较老工蜂），以控制年龄潜在效应。收集后转移至随机分配的处理箱（对照或排毒；15 cm×15 cm×15 cm），饲养约72小时以成熟。在处理箱引入新羽化工蜂前，每箱还含有子脾和糖水，以及四只相关成熟工蜂（因剪翅可区分）以模拟群体样环境。为诱导排毒，使用石蜡膜覆盖的0.2 mL管填充100 μL高压灭菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）从每只工蜂收集毒液。每次收集时暂时约束蜜蜂并将收集管靠近螫针，通过石蜡膜上孔的存在视觉确认螫刺。对照蜂经历相同处理程序但不收集毒液。排毒后工蜂返回箱中直至指定采样时间点（处理后1、24或168小时（1周））。在每个指定收集时间点，工蜂转移至个体冷冻管，在液氮中速冻，-80°C保存后解剖。共收集25只工蜂（排毒组：1小时（n=5）、24小时（n=4）、168小时（n=3）；对照组：1小时（n=5）、24小时（n=4）、168小时（n=4））。每个处理组和时间点使用来自不同群体各一只个体。还使用Qubit蛋白检测试剂盒评估收集毒液的蛋白质含量。对于每只蜂，提取毒液囊组织和囊内液体，同时移除相关腺体（毒液腺和Dufour腺）。随后毒液囊在PBS中匀浆。为确定差异丰度蛋白质，进行质谱分析。毒液囊样品的蛋白质数量使用相同Qubit蛋白检测试剂盒测量，每样品5 μg蛋白质在4%–12% NuPAGE Bis-Tris梯度凝胶中短暂分离，考马斯蓝染色并切成小凝胶块，随后在50%乙醇/25 mM碳酸氢铵中脱色。之后蛋白质在10 mM DTT中56°C还原，50 mM碘乙酰胺室温暗处烷基化。使用胰蛋白酶在50 mM碳酸氢铵中37°C过夜酶解。依次使用30%和100%乙腈提取肽后，在离心蒸发器中减少样品体积以去除残留乙腈。肽溶液通过C18 StageTips固相萃取纯化。肽在EASY-nLC 1000系统上通过内装30 cm分析柱（内径75 μm；ReproSil-Pur 120 C18）经105分钟1.6%–32%乙腈非线性梯度（含0.1%甲酸）以225 nL/min纳流率在线反相色谱分离。洗脱肽直接通过电喷雾电离喷入Q Exactive Plus Orbitrap质谱仪。质谱以数据依赖采集模式使用top10方法进行，一次全扫描后10次碎片扫描通过高能碰撞解离（HCD）。MS/MS数据使用MaxQuant（v.1.6.10.43）分析，激活运行间匹配。质谱图搜索针对目标-诱饵数据库，包含从基因组组装（Bter_1.0）预测的熊蜂蛋白质组正向和反向序列（来自Ensembl Metazoa release 53）以及默认污染物列表。由于某些毒液相关蛋白如bombolitin在熊蜂基因组组装中具有截短基因模型，研究人员纳入了双斑熊蜂（Bombus impatiens）中两个melittin同源物的蛋白质。采用MaxLFQ算法进行蛋白质定量，使用默认归一化选项并要求最小LFQ比率计数为1。检测蛋白质过滤反向结合物和污染物。缺失值分两步插补。由于已知毒液相关蛋白预期在毒液囊分析中检测到，研究人员将数据集中鉴定的蛋白质列表与先前描述的熊蜂毒液相关蛋白进行比较。为确保先前鉴定毒液相关蛋白的高置信度，下载Van Vaerenbergh et al.（2015）数据并基于高肽谱匹配（PSM值≥20）过滤鉴定蛋白质，保留43个高置信度毒液相关蛋白。然后检查这些蛋白质在毒液囊蛋白质组数据集中的存在，以鉴定其存在并检查排毒后丰度是否变化。在所有样品中，毒液囊蛋白质组合计含2031种蛋白质，包括28种先前描述的熊蜂毒液蛋白。为检查处理和 time points 间蛋白质组谱差异，首先仅使用非插补对数转换LFQ强度值进行主成分分析（PCA）。为鉴定每个时间点处理间差异丰度蛋白质，实施两种方法。首先，使用R（v. 4.3.3）和R包limma（v. 3.58.1）为每种蛋白质拟合线性模型（LM）。排毒和对照蜂的插补LFQ值作为响应变量，处理、时间及其交互作为固定效应。作为limma分析的一部分，对线性模型应用经验贝叶斯调节，测试对比以评估排毒组和对照组间蛋白质表达差异。p值使用Benjamini–Hochberg方法多重检验校正，校正p值<0.05的蛋白质视为统计显著。作为额外方法，使用Perseus在每个时间点进行成对Welch t检验比较处理。两种方法鉴定排毒和对照蜂间相似数量的富集蛋白质，limma和Perseus鉴定的差异表达蛋白质高度重叠。由于limma允许生成可纳入多个预测变量的模型，并应用经验贝叶斯方差收缩产生更稳健发现，主要结果仅报告limma鉴定的富集蛋白质。为测试显著差异丰度蛋白质比例是否高于随机预期（即>50%），使用R基础函数对每个时间点进行单侧二项精确检验。为检查受排毒和时间共同影响的显著差异丰度蛋白质是否显示相关丰度变化，使用R基础函数对24和168小时排毒效应和时间效应的log2倍数变化值进行Pearson积矩相关。此外，使用R包eulerr检查跨时间点响应排毒显著升高和降低丰度共享蛋白质的重叠。为确定排毒行为影响的生物过程，使用Fisher精确检验（Benjamini-Hochberg校正p值<0.05）在R中使用topGO包（v. 2.54.0）以"weight01"算法进行基因本体（GO）术语富集分析。由于熊蜂等非模式生物注释匮乏，下载分配给果蝇（Drosophila melanogaster）基因的GO术语，然后转移至熊蜂基因组Bter_1.0同源物。无注释GO术语的基因或编码与果蝇蛋白质缺乏同源性的蛋白质的基因被排除。然后使用生成的数据库测试感兴趣基因的GO术语富集。共进行以下GO术语富集分析：（1）毒液囊中发现的鉴定蛋白质组所有编码基因，以确定与毒液囊中蛋白质相关的生物过程；（2）每个时间点排毒后丰度升高或降低的蛋白质。
研究结果方面，作为初步探索性方法，研究人员进行主成分分析以确定样品是否基于处理或时间点聚类。仅使用所有样品中检测到的蛋白质（即无缺失或插补值），发现在全局水平上样品未基于处理或时间点强烈分离。为进一步理解毒液囊蛋白质组在特定时间点（排毒后1、24和168小时）如何变化，使用limma在每个时间点进行排毒处理与对照熊蜂的成对比较。使用有插补值的蛋白质，发现排毒与毒液囊蛋白质组的中等变化集体相关，三个时间点检查中约9%至14%的总鉴定蛋白质丰度变化。更具体地，在每个时间点鉴定显著差异丰度蛋白质（SDAPs）（适度t检验：BH校正p值<0.05）（1小时：190 SDAPs；24小时：292 SDAPs；168小时：236 SDAPs），所有时间点排毒后毒液囊中显著更高数量SDAPs（约65%–78%所有SDAPs）丰度降低（二项精确检验：p值<0.05；1小时：138 SDAPs，24小时：230 SDAPs，168小时：155 SDAPs），提示特定蛋白质耗竭或翻译活性降低。在此数量中，发现某些蛋白质在时间点间表达也显著变化（24小时=28；168小时=70），但对于这些共享蛋白质，表达负相关（Pearson积矩相关：R≤?0.68，p值<1e?05），表明处理相关表达变化不完全由时间解释。为理解此类蛋白质参与的生物过程，进行GO术语富集分析，发现所有三个时间点后降低的蛋白质编码基因显著富集"细胞质翻译"（GO:0002181），以及24小时后"蛋白质-RNA复合物组装"（GO:0022618）（Fisher精确检验：BH校正p值<0.05）。尽管排毒后毒液囊中个体蛋白质丰度普遍降低模式，也发现毒液使用后丰度增加的蛋白质（1小时：52 SDAPs，24小时：62 SDAPs，168小时：81 SDAPs）。三个时间点升高蛋白质无生物过程相关GO术语显著富集（Fisher精确检验，BH校正p值>0.05）。大多数降低SDAPs为单个时间点独有，352 SDAPs在一个时间点独特鉴定，75种蛋白质在两个时间点共享，7种蛋白质在所有三个时间点共享。排毒后升高蛋白质，157种独特蛋白质在一个时间点，19种蛋白质在两个时间点升高。由于分析揭示排毒后蛋白质丰度普遍降低，这可能由于毒液使用和耗竭预期，研究人员检查先前描述毒液蛋白的丰度变化。在排毒组内鉴定熊蜂毒液突出组分表达降低（适度t检验，BH校正<0.05），如磷脂酶A2样（XP_012170988.1）在1小时，bombolitin/melittin（XP_020718386.1）、磷脂酶A2（XP_012170987.1）和透明质酸酶样蛋白（XP_012171522.1）在排毒后24小时分别降低。相反，这些蛋白质在排毒后168小时对照和处理蜂间未观察到表达水平差异（适度t检验，BH校正p值>0.05）。虽然大多数推定毒液蛋白表达降低，鉴定一种毒液蛋白——海藻糖酶样蛋白（XP_003400853.1）在排毒后24小时丰度增加。
讨论部分总结，许多不同谱系动物使用毒液主要用于捕食和防御，凸显这一生物创新的生态和演化重要性。然而，毒液合成和维持毒液系统能量代价高昂。鉴于这一能量需求，本研究旨在检查熊蜂工蜂毒液使用（排毒）相关潜在分子层面后果，其中毒液主要用于个体和群体防御。因此，研究人员进行基于蛋白质组学的分析以理解熊蜂工蜂排毒后毒液囊（毒液蛋白主要储库）内个体蛋白质丰度如何变化，以及确定排毒是否导致可能影响重复使用的短期变化。研究发现排毒导致毒液囊蛋白质组变化，蛋白质丰度相对较大降低，包括熊蜂毒液突出组分，提示至少分子层面的潜在代价。分析还凸显毒液蛋白丰度恢复至非排毒对照所需时期，如排毒后24小时丰度降低，至少1周后恢复，这可能对短期效力和重复使用有影响。在毒液递送过程中，有毒生物收缩毒液储库肌肉以允许毒液调节性释放至促进递送结构。在排毒后变化蛋白质分析中，大多数降低，包括先前描述毒液组分的显著降低，这与毒液使用导致储存毒液蛋白可能耗竭一致。在24小时内毒液囊中降低的毒液蛋白中，鉴定磷脂酶A2和bombolitin，它们是熊蜂毒液中最丰富蛋白质之一。磷脂酶A2诱导炎症反应，熊蜂磷脂酶A2在哺乳动物中表现凋亡活性。Melittin（蜜蜂中bombolitin同源物）是蜜蜂毒液中最丰富肽，已知诱导目标生物强烈疼痛反应，鉴于密切关系，bombolitin也可能如此。此外，bombolitin增强磷脂酶A2活性，提示两者在毒液效力中的重要角色。观察到的排毒后毒液蛋白短期降低可能导致毒液效力降低，可能不诱导那么多疼痛且对目标毒性较低。例如，蛇可能使用干咬以保存毒液使用或在毒液再生期间递送较低剂量。毒液可用性降低可能导致个体行为变化。尽管本研究未检查，有证据表明某些有毒动物意识到其毒液状态，如果毒液较少则产生不同行为，如某些蛇在毒液有限时捕食较小猎物或使用绞杀。在熊蜂中，个体可能在排毒后不太可能或无法适当直接防御巢穴。然而，重复防御中的个体代价可能被巢友抵消或补偿，巢友可合作威慑群体级攻击。毒液使用常与使用后再生时间相关。分析发现排毒后24小时内两个点降低，尽管毒液蛋白在排毒后7天与对照个体相似丰度水平。虽然研究设计捕获排毒后长达168小时三个时间点，毒液储备恢复可能发生在24小时至168小时之间某时。因此，未来更短时间点 profiling 可能捕获排毒后更即时变化。结果仍表明关键毒液组分恢复在排毒一周内发生。由于补充毒液蛋白丰度需要时间，存在毒液不能使用或毒液较少可用时期。毒液再生时间因物种而异，再生可能长达数周。再生速度也受代谢率影响。例如，蝎子Parabuthus transvaalicus代谢率在毒液再生最初几天增加21%–40%，凸显补充毒液代谢代价。虽然未直接测量代谢活动，翻译相关蛋白在排毒后立即差异丰度，可能反映补充使用毒液的能量资源投入。然而，由于熊蜂是社会性昆虫，毒液蛋白恢复可能不仅受代谢代价影响，还受社会环境影响。例如，在社会性橡子蚁Temnothorax longispinosus中，毒液生产与社会线索相关。个体毒液投资与社会寄生虫压力相关，经历社会寄生虫袭击的群体每只个体估计毒液更多。此外，袭击后毒液投资与个体执行任务相关，觅食者比保育员毒液更多。因此，潜在威胁和社会因素如个体数量低可能影响个体毒液生产和毒液恢复以确保群体生存力。熊蜂通常使用毒液防御巢穴，群体通常由众多个体组成能贡献集体巢穴防御，这可能使毒液投资包括补充所需时间在巢友间分配。研究中工蜂保持小社会群体，可能导致更快的毒液恢复以能在攻击事件中防御。此外，随着实验过程中采样导致每箱个体数量略微减少，随时间较低个体数量也可能贡献毒液囊表达变化。在毒液再生期间，能量代价可能通过增加食物消耗补偿。排毒后24小时，毒液相关蛋白海藻糖酶在毒液囊中升高。海藻糖酶是昆虫血淋巴中也发现的酶，水解海藻糖（昆虫血淋巴和毒液腺中发现的主要储存糖）为葡萄糖，与蜜蜂饥饿状态和食欲调节相关。低海藻糖水平对应蜜蜂大脑章鱼胺水平增加导致食欲水平升高。因此，排毒响应中海藻糖酶水平升高可能导致葡萄糖（昆虫主要能量资源）更高可用性，同时降低海藻糖水平导致食欲增强以补偿毒液再生能量代价。由于熊蜂使用毒液防御且不通过成功捕食和消费营养收益抵消能量代价，这可能是确保抵消能量代价的机制。更高食物消耗可抵消熊蜂免疫刺激负面能量效应，因此可能代表补偿代谢代价高昂活动诱导的机制。实验中，使用低工蜂密度小微群体提供充足食物，可能加速至少1周内恢复，而在自然环境中资源受限下恢复时间可能更长。未来研究将受益于检查资源限制如何影响毒液再生。
结论部分翻译：毒液在社会性昆虫如熊蜂防御中发挥关键作用，但使用可能导致不同生物层面可观察的后果。使用对毒液储存和使用至关重要器官的蛋白质组学 profiling，研究人员表明排毒和随后再生与蛋白质丰度变化相关，大多数降低，包括已知毒液蛋白。发现还表明毒液恢复所需时间超过1天，这可能对重复使用以及再生期间熊蜂毒液效力有影响。未来工作将受益于增加样本量，允许更高分辨率捕获群体级和个体变异，以及纳入毒液囊、毒液腺和体型测量，这些可能与蛋白质丰度相关。此外，直接检查毒液产物包括生物测定可能提供排毒后效力变化的见解。最后，研究毒液使用如何影响其他生活史性状如寿命或繁殖特别感兴趣，鉴于毒液可履行从卫生和社会免疫到个体和群体防御的多样功能。总体而言，发现证明毒液使用对整个毒液囊（毒液递送必需器官）的分子后果，以及毒液恢复所需时期代表潜在增加脆弱性时期。
