血清样品中十氯酮定量分析的实验室间研究：设计、性能与建议

《Microchemical Journal》：Inter-laboratory study for the quantification of chlordecone in serum samples: design, performance and recommendations

　　

： 一项针对血清中十氯酮（chlordecone, CLD）定量的实验室间研究（inter-laboratory study, ILS）：设计、性能与建议。本文介绍了首次针对人血清和动物血清中十氯酮（CLD）定量的实验室间研究（ILS）。该研究由五个实验室组成的初步研究（preliminary study, ps）启动，随后扩展至十个实验室参与的正式实验室间研究（ILS）。研究人员发现，标准溶液的溶剂选择对定量准确性至关重要，丙酮（acetone）、乙腈（acetonitrile）和甲基叔丁基醚（methyl tert-butyl ether, MTBE）等极性溶剂优于烷烃类溶剂。此外，研究人员推荐使用全13C标记的十氯酮（13C10-CLD）作为内标（internal standard, IS），以避免天然与标记化合物之间的信号干扰。在正式实验室间研究（ILS）中，动物血清和人血清样品的指定值（assigned value）分别设定为2.56 ng/mL和0.273 ng/mL，接近慢性毒理学参考值（chronic toxicological reference value, TRV）0.4 ng/mL。大多数参与实验室的Z分数（Z-score）落在[-2, +2]区间内，表明性能满意。个别偏差归因于内标选择不当或仪器灵敏度不足。本研究建立了可靠的实验室网络用于人体血清中十氯酮（CLD）监测，并为分析方法优化提供了关键建议。

论文解读文章

研究背景与问题

十氯酮（chlordecone, CLD）是一种有机氯农药，曾在1972至1993年间广泛用于法属西印度群岛香蕉种植园的象鼻虫防治，并在全球范围内用于多种害虫控制。由于其在环境中的持久性、长距离迁移能力以及对人类健康的潜在危害，联合国持久性有机污染物审查委员会于2007年将其列入《斯德哥尔摩公约》附件A。长期大量使用导致土壤、河流水体和海洋环境受到污染，当地生产的食品也面临污染风险，使得当地居民持续暴露于该物质之下。

法国食品安全局（Anses）制定了血浆中十氯酮浓度（chlordeconemia）的慢性毒理学参考值（toxicological reference value, TRV）为0.4 ng/mL。低于此阈值时，一般认为普通人群发生不良健康效应的概率可忽略不计。然而，早期基于液液萃取结合气相色谱-电子捕获检测器（GC-ECD）的分析方法定量限（limit of quantification, LOQ）普遍高于0.75 ng/mL，无法满足低浓度水平下（如TRV附近）的准确定量需求。近年来，虽然液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）和气相色谱-串联质谱（GC-MS/MS）等方法已被多个实验室采用，并实现了低于或等于0.06 ng/mL的可接受LOQ，但在方法验证过程中，研究人员始终面临缺乏标准参考物质和能力验证样品的困境。此前仅有两次实验室间的比对研究，且仅限于两个参与者。因此，建立一个更大规模、更系统的实验室间比对体系成为当务之急。

研究目的

为解决上述问题，五个实验室决定合作开展一项符合ISO 17043:2023标准要求的实验室间研究（inter-laboratory study, ILS），旨在评估各实验室对血清中十氯酮（CLD）定量分析的准确性，识别关键影响因素，并为常规实验室提供方法优化的具体建议。

关键技术方法

本研究分为初步研究（preliminary study, ps）和正式实验室间研究（ILS）两个阶段。初步研究涉及五个实验室（编号1 ps至5 ps），均为本文共同作者所在单位。正式实验室间研究（ILS）邀请了来自法国本土、法属西印度群岛和比利时的十个实验室（编号1至10）。样品包括：从Sigma-Aldrich购买的人血清加标至0.4 ng/mL CLD（血清S0）；来源于一项获批研究（APAFIS 2016062217188805）的自然污染的绵羊血清及其未污染稀释血清（血清S1）；以及由法国血液机构（EFS）提供的未污染人血清池加标至0.4 ng/mL CLD（血清S2）。标准溶液方面，研究人员使用了商业化的十氯酮（CLD）溶液（100 μg/mL，溶剂为MTBE，购自Chiron公司）并稀释至约500 ng/mL。内标使用了全¹³C标记的十氯酮（¹³C₁₀-CLD，100 μg/mL，非烷溶剂，购自CIL公司）。样品均匀性和稳定性测试依据NF ISO 13528:2022标准附录B进行，分析工作由LABERCA实验室承担。各参与实验室采用的方法包括固相萃取（SPE）和QuEChERS两种前处理方式，分析仪器涵盖LC-MS/MS、GC-MS/MS和GC-HRMS。性能评价采用Algorithm A计算指定值（assigned value），并通过Z分数（Z-score）评估各实验室的偏差，判断标准为：|Z|<2为满意，2≤|Z|≤3为可疑，|Z|>3为不满意。

研究结果

3.1 初步研究与标准溶液

初步研究中，五个实验室各自使用自己的方法和标准溶液对血清S0和S1进行了分析。结果显示实验室明显分为两组：实验室1 ps、3 ps和4 ps报告的结果低于中位数，而实验室2 ps和5 ps报告了较高的数值。经分析，差异并非源于样品前处理方法，而是与校准溶液的溶剂有关。使用非烷（nonane）溶剂的实验室（2 ps和5 ps）给出了最高的CLD测定值。进一步分析表明，十氯酮（CLD）在丙酮中的溶解度优于烷烃。对新购买的MTBE标准品进行分析后发现其准确性良好，与丙酮基标准品相当，而非烷基标准品则表现出较大偏差。乙腈也被证明效果与丙酮相当，且因其挥发性较低更适合日常使用。此外，初步研究还指出，使用¹³C₈-CLD作为内标在气相色谱分析中会产生干扰，因为其母离子与天然CLD的同位素簇重叠；而在液相色谱中这种干扰则较弱。因此，研究人员建议正式实验室间研究（ILS）中使用丙酮、MTBE或乙腈配制标准溶液，并统一选用¹³C₁₀-CLD作为内标。

3.2 实验室间研究

3.2.1 均匀性与稳定性评估

对动物血清（S1）和人血清（S2）样品进行的均匀性和稳定性测试结果显示，所有比值均低于0.3的阈值（对应√10%），证明样品均匀且稳定。

3.2.2 LOQ范围与方法特征

各参与实验室报告的定量限（LOQ）范围为0.02至0.15 ng/mL，均远低于慢性毒理学参考值（TRV）0.4 ng/mL，足以满足低浓度定量需求。由于参与者数量有限，无法对不同提取或分析方法的结果进行统计学显著区分。

3.2.3 实验室性能评估

对于动物血清样品（S1），八个实验室提交了结果，相对标准偏差（RSD）为16%。七个实验室的Z分数在[-2, +2]区间内，性能令人满意。实验室2的Z分数为-4.3，属于不满意表现，原因是其原本计划使用GC-HRMS但因设备故障改为GC-MS单级质谱分析，后者灵敏度和选择性不足导致了低估。对于人血清样品（S2），九个实验室提交了结果，RSD为27%。八个实验室的Z分数在[-2, +2]区间内。实验室4的Z分数高达7.8，属于严重高估，原因在于其使用了未经标记的PCB 181作为内标，该化合物不具备CLD相似的行为特性，且可能自然存在于样品中；同时该实验室的LOQ较高（0.1 ng/mL），而S2样品的指定值仅为0.273 ng/mL，接近其定量下限，增加了测量不确定性。

3.3 建议

综合以上结果，研究人员提出三项核心建议：第一，标准溶液应优先选用丙酮、乙腈或MTBE等极性溶剂，避免使用烷烃类；第二，检测方法应具备最优的灵敏度和选择性，推荐使用串联质谱（MS/MS）或高分辨质谱（HRMS），而非单级质谱（single MS）；第三，内标应尽可能模拟天然CLD的行为，首选全¹³C标记的十氯酮（¹³C₁₀-CLD），以最小化天然与标记化合物之间的干扰。

结论与意义

本次首次针对血清中十氯酮（CLD）开展的实验室间研究（ILS）是一项重要举措，它使各实验室能够评估自身结果的准确性，从而推动分析方法的改进。该研究结果对未来大规模流行病学研究（如Kannari研究第二部分及法属西印度群岛全体人群暴露评估计划）具有重要价值。整体来看，无论使用何种方法，各实验室的结果准确性令人鼓舞。初步研究中发现的差异已转化为切实可行的优化建议，为建立可靠的血清十氯酮（CLD）监测实验室网络奠定了坚实基础。