癌症相关成纤维细胞来源的胰岛素样生长因子1作为肺腺癌进展的基质介导因子：多组学与功能分析

《MedComm》：Multi-omics and Functional Analyses Identify Cancer-associated Fibroblast-derived Insulin-like Growth Factor 1 as a Stromal Mediator of Lung Adenocarcinoma Progression

　　

肺腺癌（LUAD）仍是癌症相关死亡的主要原因之一，但驱动疾病快速进展的基质机制尚未被完全阐明。本研究将单细胞RNA测序（scRNA-seq）与探索性全外显子组测序（WES）相结合，以表征一例快速进展的LUAD患者的肿瘤微环境（TME）重塑。肿瘤组织表现出显著的基质富集，其中炎症型癌症相关成纤维细胞（CAF_infla）构成主要的成纤维细胞亚群。受体-配体及细胞类型特异性表达分析鉴定出CAF来源的胰岛素样生长因子1（IGF1）是LUAD进展的潜在基质介导因子。该成纤维细胞特异性IGF1表达模式在外部单细胞数据集以及伴或不伴骨转移的LUAD组织免疫荧光验证中得到了印证。在功能层面，重组IGF1增强LUAD细胞的增殖、迁移和侵袭能力，而在CAF样细胞中敲低IGF1可在共培养模型中减弱上述恶性表型。在体内，CAF样细胞中IGF1的敲低减少了远处转移负荷，并伴随Wnt相关信号通路、细胞外基质组织及转移相关分子的改变。上述发现表明，CAF来源的IGF1通过旁分泌基质-肿瘤细胞间通讯促进LUAD进展及骨转移重塑，突显了IGF1/IGF1R轴作为特定LUAD患者群体基质靶向治疗靶点的潜力。

**研究背景与问题**

肺腺癌（LUAD）是全球范围内发病率和死亡率极高的恶性肿瘤，约占所有肺癌病例的40%。多数患者初诊时已处于晚期，治疗选择受限，预后不佳；此外，10%–30%的早期LUAD患者在接受手术后仍会出现复发，导致总生存期缩短。尽管靶向治疗已取得一定进展，晚期患者的治疗失败仍然常见，因此亟需深入探究LUAD进展的机制并开发新的治疗策略。肿瘤微环境（TME）中癌症相关成纤维细胞（CAFs）是肺腺癌基质中最常见的细胞类型之一，可通过分泌多种细胞因子、趋化因子、生长因子和细胞外基质（ECM）蛋白促进LUAD细胞的干性、增殖、迁移及化疗耐药。CAFs具有高度异质性，可与周围细胞、缺氧等环境因素及ECM刚度相互作用而改变其表型特征。尽管CAFs参与肺癌进展已较为明确，但其具体的CAF来源介导因子及其在LUAD进展中的功能角色仍有待进一步研究。胰岛素样生长因子1（IGF1）与胰岛素约有50%的同源性，以内分泌、自分泌和旁分泌方式调节细胞生长。流行病学证据显示高水平IGF1与乳腺癌、前列腺癌、结肠癌和肺癌风险增加相关。IGF1最初被认为是肝源性因子，但大多数肝外组织也可合成。已有研究发现CAFs可以旁分泌方式分泌IGF1，促进结直肠癌、胃癌和乳腺癌的进展。然而，CAF来源的IGF1在LUAD中的临床相关性及细胞类型特异性表达模式尚未被充分定义。在此背景下，研究人员报道了一例术后及药物治疗后快速进展的LUAD病例，整合scRNA-seq与探索性WES分析表征该患者的TME重塑和基因组改变，旨在揭示驱动LUAD快速进展的基质机制。

**主要技术方法**

研究人员采用的主要关键技术方法包括：对索引患者术中肿瘤组织及癌旁组织进行单细胞RNA测序（scRNA-seq），使用10x Genomics Chromium平台建库并在Illumina平台上测序；对配对肿瘤-癌旁样本进行探索性全外显子组测序（WES）以表征基因组变异；利用CellphoneDB进行细胞间相互作用分析；使用外部scRNA-seq数据集（GSE153935，含6例正常肺组织和12例肺癌组织）进行验证；采用重组IGF1刺激及CAF样细胞共培养模型进行体外功能实验；构建NOD-SCID小鼠转移模型进行体内验证；对骨转移组织进行RNA测序及GO/KEGG富集分析；利用来自24例伴或不伴骨转移的LUAD患者的石蜡包埋组织进行免疫荧光验证。临床样本来源于Sir Run Run Shaw Hospital。

**研究结果**

**2.1 临床表现与病程**：通过回顾患者病史和治疗时间线，发现该75岁男性非吸烟患者在接受右肺胸腔镜肺叶切除及淋巴结清扫术后，经病理诊断为低分化腺癌（pT2N0M0，IIA期），术后接受培美曲塞联合顺铂化疗及阿替利珠单抗辅助治疗后出现多发骨转移，提示疾病快速进展。据此，研究人员对术中肿瘤及癌旁组织进行了scRNA-seq和探索性WES分析。

**2.2 单细胞RNA测序**：通过scRNA-seq获得14,828个高质量细胞（癌旁7,079个，肿瘤7,749个），无监督聚类鉴定出14个簇并注释为内皮细胞、基质细胞、免疫细胞和上皮细胞四类主要细胞类型。比较癌旁与肿瘤组织的相对丰度，发现肿瘤组织中基质细胞增多、内皮细胞减少，细胞间相互作用分析显示肿瘤组织中内皮-基质细胞间相互作用增强，上皮细胞与其他细胞类型的相互作用也增强，提示TME活跃重塑。进一步将基质细胞分为炎症型CAFs（CAF_infla）、正常成纤维细胞（NFs）、肌成纤维细胞型CAFs（CAF_myo）和内皮-间质转化相关CAFs（CAF_EndMT），发现CAF_infla和CAF_myo在肿瘤组织中显著增多，NFs显著减少。GO/KEGG富集分析显示CAF_myo主要富集于PI3K-Akt信号通路、ECM-受体相互作用和黏着斑，CAF_infla主要富集于炎症和免疫相关通路。受体-配体分析与差异表达基因取交集鉴定出IGF1，提示CAF来源的IGF1可能参与LUAD进展中的成纤维细胞-上皮细胞通讯。进一步分析发现IGF1在肿瘤组织CAF_infla中显著升高，且主要富集于基质细胞，IGF1R在肿瘤组织多种细胞类型中表达较高。外部数据集分析证实IGF1主要富集于成纤维细胞，且肿瘤来源成纤维细胞中表达高于正常肺组织成纤维细胞。探索性WES发现该患者IGF1变异位于非编码区，不太可能直接影响IGF1蛋白功能，TCGA探索性分析提示IGF1改变可能与受体-配体活性及Wnt相关通路存在潜在关联，但仅作为背景信息。

**2.3 IGF1在肺癌中的功能评价**：通过重组IGF1（100、200、400 ng/mL）处理A549和PC-9细胞，发现IGF1以剂量依赖方式促进LUAD细胞增殖，并显著增强迁移和侵袭能力。在Helf细胞中敲低IGF1后经TGF-β1诱导为CAF样细胞，与对照组相比，共培养IGF1敲低的CAF样细胞显著降低LUAD细胞的增殖、迁移和侵袭能力，直接接触共培养实验也获得一致结果，表明CAF来源的IGF1在体外促进LUAD细胞的恶性表型。

**2.4 CAFs中IGF1敲低抑制LUAD体内远处转移**：通过将稳定表达对照shRNA或IGF1 shRNA的Helf细胞诱导为CAF样细胞后与A549细胞共注射入NOD-SCID小鼠，发现对照组小鼠出现明显转移灶，而IGF1敲低组转移负荷显著减少，H&E染色显示肺组织和骨转移病变在IGF1敲低后大幅减少。对骨转移组织进行RNA测序，PCA显示两组转录组明显分离，鉴定出574个差异表达基因（68个上调、506个下调），GO/KEGG富集分析提示IGF1敲低与Wnt信号通路、ECM组织、骨化、IGFR信号通路、EMT调控、PI3K-Akt信号通路、黏着斑等通路改变相关。Western blot验证显示IGF1敲低组骨转移组织中IGF1、MMP9、CXCL12、SNAI1表达降低，FZD8表达改变；免疫组化显示MMP9和IRS1表达降低。对24例伴或不伴骨转移的LUAD组织进行免疫荧光，发现骨转移组IGF1在COL1A1阳性基质区域的表达强度显著高于非骨转移组，表明CAF相关IGF1模式具有临床相关性。

**讨论与结论**

在讨论部分，研究人员指出CAFs是TME中功能异质性的重要组分，在ECM重塑、免疫调节、血管生成、治疗耐药和转移进展中发挥重要作用。本研究中CAF_infla和CAF_myo在肿瘤组织中扩增而NFs减少，功能富集分析提示这些亚群与炎症反应、ECM-受体相互作用、黏着斑和PI3K-Akt信号相关。数据表明IGF1主要来源于基质成纤维细胞群体而非肿瘤上皮细胞，支持以CAF为中心的旁分泌机制。IGF1R在正常组织和实体瘤中广泛表达，IGF1/IGF1R轴的激活参与肿瘤细胞增殖、存活、迁移、干性和治疗耐药。重组IGF1增强LUAD细胞恶性表型而CAF样细胞中IGF1敲低减弱这些表型，直接接触共培养结果一致。体内实验证实CAF来源IGF1促进LUAD转移，转录组分析提示其通过协调调控基质重塑、Wnt相关程序和IGF1R相关信号而非单一线性通路发挥作用。临床样本验证了IGF1在伴骨转移LUAD组织COL1A1阳性基质区域的高表达。从治疗角度看，IGF1/IGF1R轴仍是具有生物学意义但临床复杂的靶点，基于基质IGF1活性或CAF富集IGF1表达的患者分层可能有助于识别更可能从该轴靶向治疗中获益的亚组。研究优势包括整合了单细胞转录组学、探索性基因组分析、体外功能实验、体内转移实验和临床组织验证等多维度评估，外部数据集和独立临床队列部分解决了单患者观察的局限性；局限性包括发现来源于一例快速进展患者、临床队列样本量有限、需要通路特异性抑制和救援实验及空间多组学方法明确下游调控网络。

结论部分翻译如下：本研究提示CAF来源的IGF1可能作为LUAD进展和转移的重要基质介导因子。通过将关注点从IGF1遗传变异转向成纤维细胞富集的IGF1表达和功能，研究结果为理解快速进展LUAD中的基质调控提供了更具生物学支持的框架。这些结果可能为以CAF为中心的旁分泌信号提供新见解，并支持进一步研究IGF1/IGF1R轴作为特定LUAD患者群体潜在治疗脆弱性的价值。