《MedComm》：Targeted Protein Degradation: From Molecular Mechanisms to Emerging Therapeutic Strategies
靶向蛋白降解（TPD）重定向内源性蛋白清除途径以消除疾病相关蛋白，为传统基于占位的抑制策略提供了替代方案。TPD的进展已将可降解靶标范围从胞内蛋白扩展至细胞表面蛋白及胞外蛋白，尽管这些模式在机制和递送需求上存在差异。将这些差异转化为合理的降解剂设计和有效的治疗策略仍具挑战性。本综述比较了蛋白酶体依赖性降解、内吞介导的溶酶体降解、巨自噬及分子伴侣介导的自噬，并结合代表性降解剂类别与靶标范围进行讨论。研究人员探讨了影响降解效率的分子因素，包括靶标可及性、降解机器的选择、有效复合物形成、降解动力学及靶标再合成。随后，研究人员审视了改善降解剂递送与时空控制的策略，包括局部给药、分子偶联、条件激活及纳米技术。特别关注纳米材料在改善降解剂递送、控制药物释放及构建功能性纳米级降解系统中的作用。最后，研究人员总结了肿瘤学及非肿瘤学适应症中的临床前证据与临床进展，并讨论了治疗转化的局限性与未来方向。通过整合降解机制、分子设计、递送策略及药理学考量，本综述为根据靶标生物学与疾病背景选择TPD方法提供了框架。
1 引言
近几十年来，靶向疾病相关蛋白的小分子抑制剂开发取得了实质性进展，如伊马替尼的成功应用。然而，许多疾病相关蛋白要么缺乏可成药的小分子结合口袋，要么发挥重要的非催化及支架功能，传统基于占位的抑制剂无法完全抑制这些功能。靶向蛋白降解（TPD）提供了一种替代药理学策略，其重定向内源性降解机器以消除特定疾病相关蛋白，而非持续占据功能性结合位点。现代TPD领域可追溯至2001年首次报道的PROTAC概念验证，其中嵌合分子将靶蛋白募集至E3泛素连接酶并诱导其降解。后续机制研究表明，蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs）和分子胶降解剂均利用诱导性蛋白相互作用促进靶标泛素化及蛋白酶体清除。
在依赖泛素-蛋白酶体系统（UPS）的降解策略中，PROTAC已被用于靶向多种胞内蛋白，包括BRD4、CDK4/6、BCL-xL和BCL-2。多个PROTAC已进入临床开发，进一步支持了TPD的治疗潜力。然而，致病蛋白（包括某些细胞表面受体和分泌蛋白）因跨膜结构或胞外定位，无法被传统PROTAC技术有效降解。溶酶体靶向嵌合体（LYTAC）技术通过利用内吞-溶酶体降解途径解决了这一局限。LYTAC分子由溶酶体靶向配体和靶蛋白结合组件构成，引导靶蛋白至溶酶体降解。值得注意的是，EGFR、PD-L1、CD71和HER2等跨膜蛋白已通过LYTAC技术成功降解。除蛋白酶体和受体介导的溶酶体降解外，基于自噬的策略进一步扩展了TPD可及的靶标范围，包括选定的长寿命蛋白、蛋白聚集体和异常细胞器。这些进展将TPD从胞内蛋白酶体降解拓展至更广泛的药理学框架，能够参与多种细胞蛋白清除途径。
尽管TPD的治疗潜力不断扩大，许多异双功能降解剂的理化性质（包括高分子量、极性和构象复杂性）可能限制溶解度、膜通透性和全身暴露。这些限制促使研究人员在优化降解剂分子本身之外，开发调控降解剂分布、细胞可及性和激活的策略。将BRD4导向的PROTAC与靶向ROR1的抗体偶联，实现了受体依赖性内化，并相较未偶联降解剂改善了药代动力学和抗肿瘤性能，说明分子靶向可重塑降解剂暴露。空间控制也可在降解剂激活层面引入。双作用专一性PROTAC被设计为仅在同时暴露于缺氧和组织蛋白酶L时才保持活性，从而将活性降解剂的形成限制在特定病理环境，减少组成性活性相关的细胞毒性。纳米技术提供了协调递送与胞内释放的额外手段。在顺序响应性CDK4/6纳米PROTAC中，酸性条件促进纳米结构解组装和肿瘤穿透。随后组织蛋白酶B介导的切割在胞内释放活性降解剂，相较游离PROTAC增强了CDK4/6降解。总之，这些研究表明仅增加降解剂暴露或蓄积是不够的。治疗开发不仅取决于实现靶标降解，还取决于控制降解在体内发生的位置和时间。
近年来，越来越多的研究和综述关注TPD，但多数聚焦于特定降解模式、特定降解剂类别或单一递送策略，对降解机制、分子设计、递送方法和治疗转化的整合有限。因此，本综述首先总结主要TPD模式的分子机制和靶标谱，然后讨论影响降解效率的关键分子和药理学因素。研究人员进一步审视递送和时空控制策略，包括局部给药、分子偶联、条件激活和纳米技术，特别关注这些方法如何塑造降解剂的体内行为和治疗效果。最后，研究人员总结跨TPD模式的临床前和临床开发及仍存在的主要转化挑战，旨在为靶标和降解途径选择、降解剂和递送策略优化以及TPD疗法的进一步临床开发提供信息。
2 蛋白降解的分子机制与靶标谱
TPD将感兴趣蛋白（POI）的选择性识别与内源性降解途径偶联，导致结合底物的清除。与酶抑制不同，蛋白降解可去除依赖完整蛋白存在的功能，包括支架和信号功能。
然而，仅靶标识别并不保证降解。因此，降解效率取决于有效募集、胞内运输和相关降解途径的活性。在哺乳动物细胞中，与TPD相关的主要途径包括UPS、受体介导的内吞后溶酶体降解以及通过自噬的溶酶体降解。PROTACs、分子胶降解剂、LYTACs和基于自噬的降解剂是利用这些内源性途径的不同TPD模式。
2.1 蛋白酶体依赖性TPD
基于蛋白酶体的TPD包括多种最终将胞内蛋白导向蛋白酶体降解的策略。经典方法将POI募集至E3泛素连接酶，导致泛素化和随后的蛋白酶体降解。这一原理适用于PROTACs和分子胶降解剂，尽管两类化合物在分子结构和将靶标募集至E3连接酶的方式上存在差异。替代方法可通过将靶标直接募集至蛋白酶体或蛋白酶体相关蛋白来绕过E3连接酶募集。
2.1.1 蛋白水解靶向嵌合体
PROTACs是将感兴趣蛋白募集至UPS进行降解的异双功能分子。PROTAC包含POI配体和E3泛素连接酶配体，二者通过连接子相连。同时结合产生POI-PROTAC-E3三元复合物。三元复合物使泛素转移至靶标，随后泛素化蛋白被26S蛋白酶体识别、展开和降解。首个PROTAC研究表明，化学诱导靶标募集至E3连接酶可触发泛素化和降解。小分子PROTAC随后在细胞中实现了强效降解并在小鼠中实现靶标减少，将概念从生物化学推向药理学。PROTAC设计中最广泛使用的E3募集配体包括cereblon（CRBN，CRL4–CRBN的底物受体）和von Hippel-Lindau蛋白（VHL，CRL2–VHL的底物受体）。所得POI-PROTAC-E3三元复合物可将底物可及的赖氨酸残基朝向泛素化机器，从而促进泛素转移。一旦组装了适当的泛素信号，底物被26S蛋白酶体识别、展开并转位至蛋白水解核心进行降解。底物处理后，可逆性PROTAC可参与后续循环。在一个早期示例中，RIPK2 PROTAC在THP-1细胞中产生超过95%的耗竭，DC50约为1.4 nM，表明在低暴露下可实现高效细胞降解。仅靶标结合并不能确定可降解性，因为降解还取决于与所募集UPS机器的兼容性。胞质和核蛋白是重要底物，膜蛋白在暴露胞内结构域时可能可及。相比之下，可溶性胞外蛋白通常无法被胞质UPS触及，需要替代降解途径。
PROTAC靶标空间的扩展依赖于配体发现和可降解性的直接测量。激酶组范围的化学蛋白质组学分析揭示，多激酶配体结合的蛋白中仅部分被降解，强调结合图谱并非可降解性图谱。相反，受体酪氨酸激酶研究表明，在所检测系统中降解抑制信号的时间长于匹配的抑制。因此，蛋白清除和抑制应作为不同的扰动进行评估，并直接比较其生物学后果。可降解性也可因同一靶标的不同分子状态而异，如RAS导向降解剂所示。LC-2等早期概念验证研究证实内源性KRASG12C可通过VHL募集被降解。更近期的泛KRAS降解剂揭示了更强的靶标状态依赖性。ACBI3实现了多种致癌KRAS变体的广泛降解，但对KRASG12R和若干Q61突变体活性有限。这些耐药变体优先占据GTP负载的KRAS(On)状态，ACBI3对此状态结合不佳。随后ACBI4被优化以与GTP负载KRAS形成高度协同的三元复合物，并将降解扩展至这些具有挑战性的KRAS(On)变体。总之，这些发现表明可降解性不仅由靶标身份决定，还受突变背景、核苷酸状态和配体结合模式塑造。
2.1.2 分子胶降解剂
分子胶代表一类独特的靶向蛋白降解剂，通过诱导或稳定E3泛素连接酶与POI之间的有效相互作用介导蛋白消除。与PROTAC中携带两个独立结合元件不同，这些化合物促进或稳定特定蛋白界面，使靶蛋白募集至E3泛素连接酶。新建立的相互作用促进靶蛋白上的泛素偶联，随后通过蛋白酶体途径被识别和降解。来那度胺提供了临床重要示例。通过改变CRBN底物识别，它募集并耗竭骨髓瘤相关转录因子IKZF1和IKZF3。该机制也说明为何与大分子异双功能PROTAC相关的理化限制不应直接推广至所有分子胶。其较小结构可能有利于通透性和口服暴露，尽管药代动力学性能仍因化合物而异。胶活性源于化合物和E3泛素连接酶共同创建的复合表面，使互补新底物得以募集。由于决定有效识别的是这种诱导界面而非仅二元亲和力，分子胶发现通常需要整合细胞筛选、蛋白质组学、遗传扰动和结构或生物物理分析。CRBN募集配体也可能保留内在分子胶活性并诱导非预期新底物降解，这代表降解剂开发中应考虑的额外脱靶降解来源。更广泛而言，分子胶属于更大的邻近诱导分子类别，而术语分子胶降解剂特指诱导相互作用导致靶标降解的化合物。
分子胶机制超越CRBN结合免疫调节药物介导的新底物降解。E7820的结构研究揭示DCAF15–RBM39的广泛接触补偿了E7820对DCAF15的低亲和力。相反，CR8促进CDK12–cyclin K复合物与CUL4衔接蛋白DDB1结合，绕过经典底物受体需求。可扩展的化学谱分析随后为鉴定具有非显而易见的募集机制的cyclin K降解剂提供了途径。总之，这些研究强调分子胶活性取决于有效诱导蛋白界面的形成，而非仅强二元结合。近期CRBN研究进一步扩展了结构理解和实验观察的新底物图谱。冷冻电镜显示CRBN E3连接酶调节剂可促进底物募集所需的CRBN闭合构象。蛋白质组筛选鉴定了额外CRBN新底物，结构分析提示更多蛋白可能含有兼容识别基序。
共价和代谢赋能的分子胶进一步扩展了诱导识别的化学。DCAF16依赖性BRD9降解剂利用了不同的半胱氨酸参与策略，包括可逆共价化学，表明连接酶募集表面可被化学重塑而非视为固定附着位点。靶向DDX18的DCAF11分子胶通过谷胱甘肽偶联激活，将细胞代谢与活性募集界面的形成联系起来。另外，分子内双价胶可同时顺式接合靶蛋白两个相邻结构域，改善与E3连接酶的表面互补性并促进有效泛素化和降解。这些发现表明分子胶识别可通过共价参与、代谢激活或靶标构象重组产生，从而将诱导邻近机制扩展至经典胶结构之外。
分子胶的靶标谱也可通过利用不同蛋白界面和疾病特异性分子依赖性来扩展。TNG961利用FOCAD缺陷肿瘤模型中对HBS1L介导核糖体拯救的依赖性。TRI-611通过激酶活性位点之外的表面将CRBN募集至ALK，并在耐药和颅内临床前模型中显示活性。HuR降解改变了BRAF突变结直肠癌模型中的BRAF RNA剪接。总之，这些示例说明分子胶的可降解靶标空间由靶标表面特征、所募集连接酶和生物学背景之间的兼容性塑造。
2.1.3 替代性UPS依赖性策略
除传统E3募集降解剂外，已开发多种UPS依赖性策略以将靶标识别扩展至经典小分子配体方法之外。这些方法包括疏水标签（HyT）、工程化识别降解剂和抗体介导的降解系统，利用替代机制将靶蛋白递送至蛋白酶体降解途径。
HyT提供了一种无需直接募集特定E3泛素连接酶的替代TPD策略。HyT降解剂通常由靶标结合配体（TBL）通过连接子与疏水部分偶联组成。靶标接合后，暴露的疏水标签可模拟错误折叠蛋白的结构特征并激活细胞蛋白质量控制途径，导致靶蛋白消除。HyT的初始开发表明含金刚烷的降解剂可通过细胞质量控制机制诱导HaloTag融合蛋白降解。后续研究通过引入替代疏水基序（如降冰片烯）扩展了HyT化学，并揭示不同HyT系统可能涉及伴侣蛋白、泛素化机器和蛋白酶体加工的不同贡献。与传统PROTAC相比，HyTs通常具有较小的分子结构和降低的极性，可能在类药性质方面具有优势，尽管其降解机制仍高度依赖于特定靶标和化学设计。
工程化识别系统提供了另一条克服许多疾病相关蛋白缺乏合适小分子配体限制的途径。BioPROTACs将工程化结合结构域（如纳米抗体）与E3连接酶组件偶联，引导靶蛋白进行泛素依赖性降解。Trim-Away利用内源性TRIM21（一种抗体结合E3连接酶）快速消除抗体结合的胞内蛋白。相反，dTAG系统利用基因引入的FKBP12F36V降解决定子，可被募集CRBN的异双功能降解剂识别并触发蛋白酶体降解。这些平台通过工程化识别模块实现降解，扩展了难以用传统配体发现方法靶向的蛋白的实验和治疗可及性。
总之，这些替代性UPS依赖性策略通过引入化学标签、工程化结合物或抗体识别系统拓宽了可降解蛋白质组。然而，其成功转化需要考虑内源性靶标可及性、递送效率和与细胞降解机器的兼容性。
2.1.4 直接蛋白酶体募集
直接蛋白酶体接合将可降解靶标空间扩展至对传统E3连接酶募集策略仍具挑战性的蛋白。该方法提供了不依赖传统E3连接酶募集的替代TPD途径。在经典UPS中，泛素链促进26S蛋白酶体识别底物，随后底物展开并转位至20S催化核心进行降解。通过将POIs物理连接至蛋白酶体相关组件，直接募集策略为底物接合和加工提供了替代途径。
该理论的首批证明之一使用了PSMD2/RPN1（19S调节颗粒组分）的大环配体。将该配体与BET结合部分连接增强了BRD4的募集和降解，确立蛋白酶体亚基本身作为TPD的化学可及锚点。该概念随后通过蛋白酶体帽靶向嵌合体（CAP-TACs）扩展，将POIs直接募集至19S帽蛋白RPN13或RPN1。这些分子促进BRD4、PRMT5和FKBP12等靶标的泛素非依赖性、蛋白酶体依赖性降解。蛋白酶体相关去泛素化酶USP14也被用作募集手柄。USP14导向降解剂已被报道可减少HDAC1、IMPDH2和CERT1，进一步证实将结构不同的蛋白直接导向26S蛋白酶体的可行性。相关方法是CANDDY（化学敲低与亲和力和降解动力学），使用源自修饰蛋白酶体结合支架的降解标签。KRAS导向分子TUS-007被报道可降解KRAS突变体（G12D和G12V）及野生型KRAS，说明蛋白酶体导向降解对难以通过传统抑制消除的致癌蛋白的潜力。总之，这些方法确立直接蛋白酶体募集作为可绕过传统E3连接酶募集的靶标降解替代策略。
2.2 内吞依赖性溶酶体降解
内吞依赖性溶酶体降解通过实现胞外和细胞表面蛋白的消除，将TPD扩展至胞内底物之外。这些方法通常利用细胞表面受体或膜结合E3泛素连接酶促进靶标内化和随后递送至溶酶体。这些方法可分为传统LYTACs、利用替代内化受体的变体以及募集膜E3泛素连接酶的平台。
2.2.1 溶酶体靶向嵌合体
LYTACs代表一种溶酶体依赖性TPD策略，通过将胞外和膜相关蛋白重定向至内溶酶体途径，将蛋白降解扩展至UPS可及的胞内底物之外。与PROTACs和分子胶不同，LYTACs利用细胞表面溶酶体靶向受体（LTRs）介导受体依赖性内化和溶酶体递送。典型LYTAC由靶标结合模块与溶酶体穿梭部分连接组成，使靶蛋白–LYTAC–LTR复合物形成并经内吞和随后降解。
第一代LYTAC平台利用阳离子非依赖性甘露糖-6-磷酸受体（CI-M6PR），该受体天然介导甘露糖-6-磷酸（M6P）修饰蛋白向溶酶体的转运。通过将M6P基序与TBLs偶联，胞外蛋白被重定向至CI-M6PR介导的摄取和降解。为提高组织特异性，第二代LYTACs通过三价N-乙酰半乳糖胺（tri-GalNAc）的高亲和力结合利用肝细胞特异性去唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）。在原始研究中，基于西妥昔单抗的GalNAc–LYTAC（Ctx–GalNAc）促进ASGPR依赖性内化和EGFR在肝细胞癌细胞系（包括HEP3B、HEPG2和HUH7）中的溶酶体降解。此外，Ctx–GalNAc在ASGPR阳性HEP3B细胞中选择性耗竭细胞表面EGFR，而在ASGPR阴性HeLa细胞中则不然，证明受体依赖性细胞选择性。
除CI-M6PR和ASGPR外，额外内吞受体扩展了LYTACs的靶标和组织范围。使用RGD配体的整合素α3β1介导LYTACs实现了CD71和PTK7等膜蛋白的降解并抑制肿瘤生长。叶酸受体、转铁蛋白受体和清道夫受体A1系统通过靶向EGFR、PD-L1、CD20、CD47和c-Met等蛋白进一步拓宽了LYTAC应用。GPC3介导LYTACs也被开发用于肝细胞癌中肿瘤相关膜蛋白的选择性降解。
LYTACs通过受体介导的内吞和溶酶体运输将可降解蛋白质组从胞内蛋白扩展至胞外和膜相关靶标。然而，有效降解不仅取决于受体表达，还取决于有效内化、内体分选和溶酶体递送，这些仍是溶酶体依赖性TPD策略进一步开发的关键决定因素。
2.2.2 小分子和细胞因子受体导向变体
后续胞外TPD策略扩展了用于进入内溶酶体途径的受体库和分子结构。这些变体保留受体介导内化后溶酶体蛋白水解的基本原则，同时引入替代靶向模块和内源性运输受体以拓宽细胞可及性和治疗应用。
胞外蛋白的ASGPR分子降解剂（MoDE-As）代表LYTAC的双功能小分子延伸，证明胞外蛋白可在无抗体识别模块的情况下被消除。MoDE-As是由TBL和ASGPR接合部分组成的双功能分子，使三元复合物形成和肝细胞特异性内化成为可能。ASGPR介导内化后，三元复合物被运输至溶酶体进行靶标降解。细胞因子受体靶向嵌合体（KineTACs）将靶标结合臂与接合同源细胞因子受体的细胞因子臂结合，将胞外和细胞表面蛋白重定向至溶酶体降解。Pance及其同事引入的平台使用CXCL12接合CXCR7并将细胞表面和胞外蛋白导向溶酶体降解。包含CXCL11、vMIP-II和IL-2的额外KineTACs进一步证明了细胞因子受体介导溶酶体降解策略的模块性。除细胞因子受体系统外，额外策略探索了替代细胞表面受体和转运蛋白以扩展可用于溶酶体降解的途径。胰高血糖素样肽-1受体（GLP-1R）和葡萄糖转运蛋白1最近被鉴定为选择性蛋白降解的替代溶酶体转运受体。GLP-1R介导LYTACs（g-LYTACs）实现了包括EGFR、PD-L1和整合素在内的胞外和膜蛋白降解，并通过促进PD-L1耗竭改善小鼠模型中的抗肿瘤免疫应答。类似地，GLUT靶向嵌合体（GTACs）促进包括TNF-α和HER2在内的胞外和膜蛋白的溶酶体降解。与亲本抗体相比，GTACs在体外显示出更强的肿瘤细胞生长抑制，并在小鼠肿瘤模型中增强了肿瘤靶向。总之，这些平台拓宽了可用于胞外和膜蛋白降解的受体库。
2.2.3 膜E3连接酶募集降解平台
LYTACs及相关方法利用内化受体将结合货物运输至溶酶体，而替代策略重编程跨膜E3泛素连接酶以清除细胞表面蛋白。膜E3连接酶募集平台利用泛素化依赖性受体运输而非经典胞质蛋白酶体降解。代表性平台包括基于抗体的PROTACs（AbTACs）、蛋白水解靶向抗体（PROTABs）和通过E3泛素连接酶募集的受体消除（REULR），后者使用模块化纳米抗体融合而非全长双特异性IgGs。
AbTAC概念最初由Cotton等人使用AC-1证明，AC-1是一种双特异性IgG，结合阿替利珠单抗的PD-L1结合臂与通过噬菌体展示选择的环指蛋白43（RNF43）结合抗体。两个半抗体通过杵臼工程组装，实现PD-L1和RNF43的同时识别。在MDA-MB-231细胞中，AC-1以DC50为3.4 nM和24小时后最大降解63%减少PD-L1。单个抗体臂或两种未偶联抗体均未重现该活性。RNF43敲低消除了PD-L1丢失，而巴弗洛霉素A1（而非MG132）抑制降解，确立初始AbTAC通过RNF43依赖性溶酶体途径发挥作用。全细胞蛋白质组分析未检测到广泛蛋白质组破坏，在HCC827肺癌和T24膀胱癌细胞中也观察到PD-L1降解，支持该方法在不同细胞背景中的可移植性。
PROTABs随后通过系统评估膜E3连接酶、靶标受体和抗体格式扩展了该原理。Marei等人首先将针对RNF43或锌指和环指3（ZNRF3）的抗体与若干胰岛素样生长因子（IGF）1R结合抗体配对，显示所得双特异性分子在结直肠癌细胞系中诱导受体泛素化和清除。破坏ZNRF3 RING结构域或用MLN7243抑制泛素激活损害IGF1R降解，直接将PROTAB活性与E3催化功能联系起来。巴弗洛霉素A1和MG132均减少降解，表明泛素化受体可以靶标和细胞背景依赖性方式接合溶酶体和蛋白酶体机器。值得注意的是，在IGF1R:ZNRF3表面比超过400:1的细胞中，高效IGF1R清除得以保留，支持事件驱动过程，即一个连接酶分子可作用于多个靶标受体而非严格化学计量机制。后续工作拓宽了靶标范围并阐明了PROTAB运输。Monroy等人工程化了一种双特异性抗体降解剂，包含泛选择性人αv抗体臂和抗ZNRF3臂。在HepG2细胞中，10 nM该降解剂在48小时后去除69.3 ± 1.2%的细胞表面αvβ5并减少总αv蛋白53%，表明该策略可应用于大型多亚基整合素受体。He等人随后报道使用HER2–ZNRF3 PROTAB在24小时内约85%的HER2耗竭。降解主要为溶酶体性，而ZNRF3未被共降解且抗体大部分被回收，表明靶标、所募集E3连接酶和降解剂具有不同的胞内命运。
基于相同机制原理，REULR平台用模块化纳米抗体融合替代全长双特异性IgGs。REULRs针对五种质膜相关RING E3连接酶——RNF128、RNF130、RNF167、RNF43和ZNRF3——生成，并将这些连接酶重定向至EGFR、促红细胞生成素受体和PD-1。用选定的PD-1导向REULRs以50 nM处理在工程化HEK293T细胞中产生稳健、近乎完全的细胞表面PD-1丢失，而单个纳米抗体组件无活性。较小且易于重构的支架拓宽了可用E3–靶标组合的范围，尽管快速肾清除可能限制未修饰纳米抗体的全身暴露。
该机制将膜E3募集降解剂与LYTACs区分开来。LYTACs可去除可溶性胞外蛋白和细胞表面蛋白，而AbTACs和PROTABs的实验确立靶标谱目前主要限于其胞内区域可被泛素化的跨膜蛋白。REULR具有类似受限的靶标范围。它已针对细胞表面受体EGFR、EpoR和PD-1以及通过“自相残杀”REULR构建体靶向的膜E3连接酶进行验证。相反，膜E3募集平台可作为全重组抗体分子生产，并可能利用单个E3连接酶的疾病或组织限制性表达。这创造了将抗体选择性和有利全身暴露与背景依赖性降解相结合的机会，同时去除整个受体而非仅阻断一个功能结构域。
2.3 自噬依赖性溶酶体降解
相比之下，自噬——一种重要的胞内降解途径——在调节蛋白周转和维持细胞稳态中发挥关键作用。与主要靶向胞外或膜相关蛋白进行溶酶体降解的LYTAC不同，自噬涉及将底物隔离至自噬体，随后与溶酶体融合进行降解。巨自噬可处理可溶性蛋白、蛋白聚集体和较大细胞结构（包括受损线粒体）。自噬还可促进错误折叠和聚集倾向蛋白的清除，这一特征与若干神经退行性疾病相关。
2.3.1 自噬靶向嵌合体
自噬靶向嵌合体（AUTACs）是异双功能小分子，化学标记胞内货物进行选择性自噬，从而实现蛋白和细胞器的溶酶体清除。AUTACs包含三个关键组件：鸟嘌呤衍生物基降解标签、化学连接子和选择性结合靶蛋白或细胞器的配体。TBL识别货物，而鸟嘌呤衍生降解标签模拟S-鸟苷酸化并促进底物的K63连接多泛素化。该泛素链被自噬受体SQSTM1/p62识别，通过与LC3相互作用促进泛素化底物募集至自噬体膜。
该模块化设计最初使用第一代AUTACs验证，靶向甲硫氨酸氨肽酶2（MetAP2）、FKBP12、BET蛋白和线粒体。蛋白导向AUTACs包括基于烟曲霉醇的AUTAC1、基于合成FKBP配体的AUTAC2和JQ1衍生的AUTAC3，分别靶向MetAP2、FKBP12和包括BRD4在内的BET蛋白。在HeLa细胞中，1–100 μM AUTAC1在24小时后减少内源性MetAP2，而10 μM AUTAC2显著减少FKBP12并增加其K63连接多泛素化。相反，10 μM AUTAC3在A549细胞中24小时后仅适度减少BRD4，证明可行性但降解效力有限。AUTAC4通过将易位蛋白配体与鸟嘌呤衍生标签连接，将方法扩展至细胞器，从而靶向线粒体外膜。在唐氏综合征衍生成纤维细胞中，AUTAC4处理3天清除了碎片化线粒体并恢复线粒体膜电位和ATP产生。该线粒体自噬需要泛素化但独立于PINK1和Parkin，支持非经典途径的参与。
与鸟嘌呤衍生标签含L-半胱氨酸亚结构的第一代AUTACs不同，第二代AUTACs（2G-AUTACs）优化了标签化学而不改变配体导向货物识别或选择性自噬机制。构效关系研究表明鸟嘌呤核心仍然必需，而L-半胱氨酸可被芳香杂环替代。其中，含吡唑衍生物tt44显示最强活性。通过PEG5连接子将优化标签转移至FKBP12配体产生在1 μM有活性且比AUTAC2活性高约100倍的降解剂。若干相关衍生物实现亚微摩尔降解活性，且FKBP12降解仍为p62依赖性。
AUTAC策略也已扩展至SHP2。SA-8将SHP2抑制剂SHP099与LC3募集配体结合，在HeLa细胞中诱导剂量和时间依赖性SHP2降解（DC50 = 3.22 ± 0.18 μM；Dmax = 80.47 ± 1.14%）。其活性被自噬和溶酶体功能抑制剂降低，支持通过自噬–溶酶体途径降解。
2.3.2 自噬体锚定化合物
自噬体锚定化合物（ATTECs）是同时接合靶标和自噬体相关蛋白LC3的小分子，从而将靶标锚定至自噬体膜进行隔离和随后通过巨自噬的溶酶体降解。ATTECs由该锚定机制定义，不一定采用PROTACs典型的双弹头加连接子结构。直接募集LC3也将其机制上与鸟嘌呤标签AUTACs和AUTOTACs区分开来，后者募集并激活自噬受体。创始化合物结合突变亨廷顿蛋白和LC3并优先降低突变蛋白，提示疾病相关结构状态可用于偏倚清除。
后续双功能ATTECs将LC3介导锚定扩展至非蛋白细胞结构。脂滴靶向ATTECs促进选择性脂噬，而线粒体靶向变体随后诱导线粒体自噬和整个线粒体耗竭。这种扩展需要明确区分单个分子组件丢失与靶向细胞结构清除。LC3导向锚定已从聚集倾向底物扩展至信号蛋白和适应性识别支架。BCR–ABL导向ATTECs将BCR–ABL抑制剂达沙替尼与LC3B结合配体GW5074连接，而2,4-喹唑啉二酮衍生LC3B募集剂与CDK9抑制剂SNS-032偶联实现CDK9及其相关cyclin T1的同时自噬降解。共价适体基自噬体锚定嵌合体使用靶标结合DNA适体与LC3配体偶联促进细胞表面蛋白（包括转铁蛋白受体1（TfR1）和核仁素）的自噬降解。RNA适体支架也被工程化为靶标识别和自噬募集模块，从而将蛋白货物导向自噬–溶酶体途径。PDEδ导向ATTECs进一步将该策略扩展至与KRAS运输相关的异戊二烯基蛋白伴侣。化合物12c诱导线粒体依赖性PDEδ自噬降解，DC50为1.7 μM，Dmax为85%，并比相应PDEδ抑制剂更有效抑制KRAS突变Capan-1和MiaPaCa-2胰腺癌细胞增殖。必须区分复合物相关组件的共清除与每种受影响蛋白的直接配体识别。
有效ATTEC降解需要同时接合靶标和LC3以及功能性自噬–溶酶体途径。仅LC3-II增加或与LC3斑点共定位不能确立自噬流增加；还应证明溶酶体周转。对于线粒体，测量线粒体质量、多种线粒体蛋白和mtDNA，结合pH敏感性线粒体自噬报告基因或电子显微镜，可区分整个细胞器清除与单个线粒体组分的选择性丢失。细胞器导向锚定揭示了溶酶体路由中的额外区别。TSPO–LC3嵌合体在疾病相关细胞和类器官模型中诱导线粒体清除，工程化募集LC3或ATG16L1被探索用于聚集体和线粒体消除。募集ATG16L1的人工线粒体自噬系统也可通过ATG5非依赖性内体途径运作。因此，募集自噬相关蛋白不足以确立经典巨自噬。途径归属需要在特定构建体中测试货物包裹、必需因子和终末溶酶体降解。
2.3.3 AUTOTACs
AUTOTACs是促进通过p62/SQSTM1介导的选择性自噬进行TPD的双功能小分子。经典AUTOTACs由TBL、连接子和自噬靶向配体（ATL）组成。TBL识别POI或病理性蛋白聚集体，而ATL接合p62的ZZ结构域并诱导其构象激活。重要的是，AUTOTACs不仅将货物锚定至p62，还将p62转化为具有自噬递送能力的活性货物聚类状态。所募集货物随后被路由至p62–LC3依赖性自噬–溶酶体途径。AUTOTACs在机制上不同于ATTECs和AUTACs。ATTECs直接稳定靶标与LC3之间的相互作用，不需要p62或经典双配体-连接子结构。AUTACs则含有模拟S-鸟苷酸化、促进K63连接多泛素化并促进p62等自噬受体识别的鸟嘌呤衍生降解标签。相反，经典AUTOTACs直接募集并激活p62，靶标降解可在无靶标泛素化的情况下进行。
TBL决定底物选择性，可源自抑制剂、受体配体、共价配体、化学伴侣或聚集体选择性结合物。AUTOTACs已针对雌激素受体β、雄激素受体（AR）和MetAP2，以及突变结蛋白、聚集倾向蛋白、突变亨廷顿蛋白和α-突触核蛋白聚集体开发。ATL通常设计为接合p62 ZZ结构域。配体结合通过其PB1结构域促进p62寡聚化，并通过LC3相互作用区域增强LC3接合。所得靶标–AUTOTAC–p62复合物被募集至吞噬泡，包裹于自噬体中，并在溶酶体融合后最终降解。PEG基连接子通常被纳入AUTOTACs以在两个配体之间提供柔性间隔，并可改善水溶性和细胞通透性。尽管AUTOTAC活性可在一定连接子长度范围内保留，连接子结构仍是降解效率的重要决定因素。在AR靶向系列中，ATC-323、ATC-324和ATC-325含有逐渐延长的三个至五个单元的PEG连接子。在5 μM时，ATC-324和ATC-325有效激活p62依赖性自噬并促进AR降解，而ATC-323显示很少活性。值得注意的是，ATC-324实现AR降解DC50为2.05 μM并在6–12小时内将AR水平降低50%以上，强调需要靶标特异性优化连接子长度和组成。
AUTOTACs特别适用于聚集或其他难以清除的蛋白。ATC161选择性耗竭聚集α-突触核蛋白而不显著减少单体蛋白，并在α-突触核蛋白预形成纤维小鼠模型中减少聚集体负荷。AUTOTACs还可将配体结合扩展至靶标消除。例如，ATC-324降解多种AR配体结合结构域突变体并通过AR-FL/AR-v7异二聚化间接减少AR-v7。
2.3.4 分子伴侣介导的自噬
分子伴侣介导的自噬（CMA）是一种选择性溶酶体降解途径，直接将可溶性胞质蛋白转位穿过溶酶体膜。经典CMA底物含有被胞质HSC70识别的KFERQ样基序。底物HSC70复合物随后被递送至溶酶体相关膜蛋白2A（LAMP2A），后者作为CMA底物的溶酶体受体。底物结合促进LAMP2A动态组装为高分子量转位复合物，介导跨溶酶体膜 passage。与巨自噬不同，CMA不需要自噬体形成。经典CMA底物是含有或暴露被HSC70识别的KFERQ样基序的可溶性胞质蛋白，并被递送至溶酶体膜上的LAMP2A。底物必须在转位前展开，这限制经典CMA仅适用于与直接跨溶酶体膜 passage 兼容的蛋白，并排除完整细胞器或大蛋白聚集体。
基于CMA的降解剂利用CMA的底物识别机器将非经典蛋白重定向至溶酶体。早期概念验证使用HSC70结合基序与聚谷氨酰胺结合肽QBP1融合，选择性促进突变亨廷顿蛋白降解并改善R6/2亨廷顿病小鼠模型中的疾病相关表型。该策略随后发展为更模块化的肽基系统，包含蛋白结合结构域（PBD）、CMA靶向基序（CTM）和细胞膜穿透结构域（CMPD）。PBD赋予靶标识别，CMPD使细胞进入，CTM募集HSC70引导结合货物进行LAMP2A介导的溶酶体转位和降解。使用该架构，CMA导向降解扩展至内源性DAPK1、PSD-95和α-突触核蛋白。其耗竭依赖于溶酶体活性和CMA机器（包括LAMP2A）。总之，这些研究确立CMA底物识别可被人工重编程，允许不天然含有可及CMA靶向基序的蛋白被重定向至溶酶体降解途径。
更近期的方法扩展了降解剂结构和靶标范围。分裂混合CMA基降解剂（SM-CMADs）由功能化有KFERQ CMA靶向基序或TBL的自组装肽模块组装而成。通过改变这些模块的相对比例，该平台实现CMA导向降解剂的可编程组装和筛选。包含他莫昔芬、恩杂鲁胺、考比替尼或达沙替尼的SM-CMADs分别促进ERα、AR、MEK1/2和BCR–ABL的降解，证明CMA募集在多种致癌靶标中的适应性。称为Ab-CMAs的抗体–肽偶联物进一步将CMA基降解扩展至细胞表面蛋白。通过将CMA靶向肽与单克隆抗体偶联，Ab-CMAs以独立于特定细胞表面受体和E3连接酶的方式促进EGFR、PD-L1和HER2的溶酶体降解。这些发展将CMA基TPD的概念范围拓宽至传统可溶性胞质底物之外。
因此，CMA基降解通过利用HSC70–LAMP2A轴提供了泛素–蛋白酶体和巨自噬基TPD的替代方案。当靶标消除优于基于占位的抑制或蛋白酶体募集困难时，它可能特别有用。然而，其直接转位机制施加了重要的物理约束，因为底物必须保持与展开和膜 passage 兼容。
3 分子设计与降解效力决定因素
降解剂效力和持久性反映一系列偶联事件，包括靶标接合、兼容降解机器的募集、适当细胞区室中有效复合物的形成、途径承诺、靶标破坏和随后靶标恢复。这些变量应作为整合过程评估，因为仅亲和力、连接子结构或标称效力无法完全预测细胞降解。跨TPD模式，核心设计问题因此不仅是降解剂是否结合其靶标，而是靶标和降解剂能否在相关生物学背景中完成整个降解循环。
3.1 靶标接合与降解机器选择
靶标识别是可降解性的第一决定因素，但相关变量是靶标呈递给降解机器的分子状态。配体可高亲和力结合但若结合状态不暴露有效表面、靶标嵌入蛋白复合物遮蔽关键界面或所募集机器不在同一区室，则不能诱导降解。对于双功能降解剂，结合位点、结合构象和出口矢量决定募集后靶标表面如何定向。蛋白构象、大分子相互作用和亚细胞定位进一步改变靶标可及性和下游加工可用的几何结构。因此，合适的TBL必要但不充分。完整降解剂必须将靶标的可降解分子状态与同一生物学背景中的功能性处置途径连接起来。
对于泛素依赖性PROTACs，该兼容性问题从靶标配体延伸至所募集E3连接酶。靶标结合位点和出口矢量决定哪些表面和赖氨酸呈递给连接酶，而募集剂选择决定该呈递可在何处和哪些细胞中被加工。CRBN和VHL仍广泛使用，因为其配体和复合物表征充分，但活性取决于完整连接酶复合物的丰度、定位、催化能力和遗传完整性，而非孤立募集剂的表达。因此，扩展E3库可解决特定生物学约束。DCAF16提供核限制性募集机会，而基于DCAF1的PROTACs在CRBN或VHL依赖性途径耐药的模型中保留降解活性。组织富集机器可增加进一步选择性层。DT2216利用血小板中有限的VHL可用性减少BCL-xL耗竭相关血小板毒性，而KLHL41募集提供肌肉限制性降解的新策略。这些示例说明为何募集剂选择应被视为生物学设计变量而非可互换化学手柄。
分子胶说明不同形式的机器兼容性，因为其活性由新复合识别表面的形成而非两个独立优化配体通过连接子连接决定。DCAF15–RBM39和DDB1–cyclin K系统表明，当化合物补充有利蛋白–蛋白界面时，相对弱的二元相互作用可变得有效。cyclin K胶的系统研究表明，溶剂暴露取代基可独立于经典激酶抑制调节DDB1接合和降解，证明靶标占据和胶活性可分离。分子内双价胶通过顺式接合靶标相邻区域扩展该原理，重塑其表面并促进E3募集。对于分子胶，表面互补性、诱导靶标构象和潜在靶标–连接酶兼容性因此比仅二元亲和力更具信息性。
直接蛋白酶体募集和HyT施加不同要求。CAP-TACs将蛋白直接募集至蛋白酶体帽组件，可绕过传统E3募集剂需求。早期直接募集研究同样确立蛋白酶体亚基作为TPD的化学可及锚点。然而，与蛋白酶体的邻近本身不足，因为底物仍必须被捕获、展开并转位至催化核心。HyT则创建人工蛋白质量控制信号。其结果取决于疏水标签化学、连接子结构、靶标背景、伴侣识别和解释诱导疏水表面的蛋白水解途径。这些策略强化同一一般原理：诱导邻近仅在将靶标连接至可物理完成降解的下游加工步骤时有用。
对于胞外和膜蛋白，主要兼容性约束从胞质E3募集转向有效运输。LYTACs需要可及靶标表位和能够内体分选和溶酶体递送的内化受体。CI-M6PR基LYTACs的全基因组分析显示受体占据、逆转录体依赖性回收和溶酶体成熟独立调节降解。内源性M6P修饰配体可占据CI-M6PR，而逆转录体介导回收可使受体复合物返回细胞表面而非溶酶体。因此，总受体丰度是不完整的活性预测因子。AbTACs、PROTABs和REULRs等膜E3募集平台增加几何要求，因为靶标胞外域和跨膜E3必须以与内化和加工兼容的方向可及。因此，胞外降解剂不应简单视为附着于溶酶体穿梭器的结合试剂。其活性取决于表面识别如何转化为定向胞内运输。
自噬导向系统施加另一物理约束，因为靶标或货物必须被自噬结构捕获并通过功能性溶酶体途径递送。ATTECs需要同时接合靶标和LC3，因此靶标亲和力、LC3识别、连接子几何、货物大小和所得复合物被隔离的能力均可影响降解。AUTACs使用降解标签促进选择性自噬，而AUTOTACs募集并激活p62/SQSTM1驱动货物聚类和自噬捕获。CMA更具限制性。HSC70介导识别必须随后发生LAMP2A依赖性对接、底物展开和跨溶酶体膜转位。强结合底物因此可能仍与经典CMA兼容性差，如果它不能展开或穿越转位机器。Ab-CMA应相应区分为CMA相关靶向至细胞表面蛋白的非经典延伸，而非可溶性胞质底物的经典CMA。总之，这些模式表明降解机器选择最终是关于哪种细胞途径可在靶标天然位置和分子状态物理加工靶标的决定。
3.2 有效复合物形成与降解动力学
一旦确立靶标和机器兼容性，降解取决于诱导组装是否采用有效几何结构。该点对PROTACs定义最明确。连接子长度、附着位置、出口矢量、柔性、极性和立体化学决定靶标–降解剂–E3复合物可用的构象集合。MZ1–VHL–BRD4BD2结构显示降解剂诱导的蛋白–蛋白接触可稳定协同三元复合物并促进降解选择性。相关p38 PROTACs证明改变连接子附着和长度可改变同工型选择性，即使保留相同靶标配体和VHL募集剂。更近期的SMARCA2研究进一步表明，具有相似静态界面的降解剂可显示不同降解效率，因为其动态集合以不同频率采样有效构象。因此，三元复合物亲和力和协同性是有用描述符，但均非降解的通用预测因子。重要的是集合是否将底物置于可进行下一催化步骤的几何结构中。
对于泛素依赖性降解，该承诺步骤是泛素转移而非三元复合物形成本身。可检测三元复合物可形成而无有效泛素化，如p38系统所示。完整CRL2VHL组装建模显示更活跃SMARCA2降解剂将更高密度的可及靶标赖氨酸定位在E2负载泛素附近。CRL2VHL–MZ1–BRD4BD2冷冻电镜通过将BRD4定位朝向E2活性位点并鉴定与泛素转移兼容的富赖氨酸表面提供直接结构支持。即使成功泛素化也不保证破坏。泛素链结构可影响降解效率。例如，TRIP12与CRL2VHL合作生成K29/K48分支泛素链，加速MZ1诱导的BRD4降解。蛋白酶体随后必须识别底物、接合起始区域、展开蛋白并将其转位至20S核心。直接蛋白酶体募集剂绕过初始E3依赖性递送步骤，但仍受底物捕获和加工要求约束。因此，有效状态是一系列几何和动力学偶联事件而非单一稳定复合物。
浓度和驻留时间进一步塑造该序列。在过高PROTAC浓度下，分离的靶标–降解剂和E3–降解剂二元复合物可与有效三元组装竞争，产生特征性钩效应。正协同性可拓宽有效三元复合物占主导的浓度范围，尽管该效应幅度仍系统依赖性。当驻留时间提供足够泛素转移机会时，它也可重要。MZ1与BRD2BD2和BRD4BD2形成相对长寿命VHL复合物，较长解离半衰期与该系统中BRD3相比更快的初始降解相关。然而，驻留时间不应孤立解释，因为长寿命但几何无效的复合物仍可能降解不佳。实时测量进一步显示具有相似终点DC50或Dmax的降解剂可在降解起始、初始速率、最大耗竭时间和化合物去除后恢复方面显著不同。单时间点DC50和Dmax因此将若干机制不同过程压缩为两个数字。靶标再合成也必须考虑，因为观察到的蛋白丰度反映诱导破坏和持续合成之间的平衡。
有效复合物的含义在分子胶系统中改变。此处关键事件是诱导蛋白–蛋白界面的形成，将新底物定位进行泛素化。胶部分微小变化可重组该界面并显著改变降解而不成比例改变二元靶标亲和力。这解释了为何仅基于抑制剂效力的优化可能错过活性分子胶。相关构效关系包括三元表面本身：化合物与两种蛋白的接触、靶标中诱导的构象以及所募集底物相对于连接酶的定向。在此设置中，如果诱导界面足够互补和催化有效，弱二元结合仍可支持强效降解。
对于LYTACs及相关胞外降解剂，有效状态不是稳定三元复合物而是运输循环。靶标捕获必须随后发生受体接合、内化、内体分选和递送至降解性溶酶体区室，同时与受体回收竞争。该区别解释了为何更强表面结合不一定产生更大降解。价数和空间组织增加另一设计层。多价适体基LYTACs（AptLYTACs）显示三价或五价靶标结合架构可优于单价构建体，而进一步增加价数尽管相似表观细胞结合却降低降解，表明过度多价可损害有效摄取。四面体DNA LYTACs进一步证明纳米级排列和多价受体接合可相较匹配单价设计增强膜蛋白降解。膜E3降解剂将该运输问题增加靶标–E3几何和泛素化。因此，有效设计需要优化胞外组装和该组装内化后发生的情况。
自噬导向降解剂需要不同形式的有效加工。货物必须被生长的自噬结构捕获并成功通过自噬体成熟和溶酶体融合。对于ATTECs，仅增加LC3结合不能确立有效降解，因为靶标–LC3复合物必须以可被物理隔离的形式定位在自噬体膜上。这对于线粒体等大货物尤其重要，成功降解需要细胞器包裹而非单个蛋白清除。AUTACs说明化学降解标签可独立于靶标配体调节选择性自噬信号。AUTOTACs增加介观组装步骤，因为p62接合必须促进寡聚化、货物聚类和随后LC3依赖性隔离。因此，实验评估应包括自噬流和终末溶酶体降解证据而非仅LC3积累，因为增加LC3-II或斑点也可反映周转阻滞。跨所有这些模式，共同原理是结合或诱导邻近必要但不充分。有效降解需要成功通过途径特异性承诺步骤。
3.3 暴露、选择性和耐药决定因素
上述分子事件仅在化学完整活性物种以足够局部浓度到达相关组织、细胞和亚细胞区室时才重要。有效暴露应与血浆浓度或总细胞摄取区分。该问题对于超出五规则化学空间中的异双功能降解剂尤其重要，其中分子量、极性、构象行为、溶解度、膜分配和外排可强烈影响胞内可用性。连接子依赖性折叠可部分遮蔽极性表面积从而影响通透性，意味着连接子优化可同时改变药代动力学和三元复合物几何。分子胶通常较小，但通透性和代谢稳定性仍因化合物而异。LYTACs和抗体基胞外降解剂避免被动胞质进入，但仍受组织穿透、受体占据、内化和内体路由约束。自噬导向降解剂必须到达相关胞内区室并获得对靶标货物和所需自噬机器的 access。
选择性同样由连续生物学过滤器而非仅靶标结合产生。PROTAC降解选择性可与结合选择性分离，因为仅部分结合蛋白可形成有效靶标–降解剂–E3几何。募集剂分布增加另一过滤器。DT2216说明血小板中低VHL可用性如何减少在靶血小板毒性同时保留VHL competent肿瘤细胞中的BCL-xL降解。分子胶选择性取决于连接酶–化合物–新底物界面的互补性，仅CRBN接合不定义完整新底物谱。内吞依赖性降解剂用受体可用性和运输替代E3可用性。GalNAc LYTACs利用肝脏富集ASGPR，而CI-M6PR基系统具有更广泛细胞分布。自噬导向策略增加货物状态和途径能力作为进一步过滤器。这些示例强调选择性应在降解和下游生物学层面证明，而非从标称靶向配体或募集剂推断。
持久性和耐药源于相同多步架构。靶标耗竭可在游离药物浓度下降后持续，因为药效状态由降解和靶标再合成共同支配。RIPK2 PROTACs在大鼠中化合物浓度不可检测后产生药效效应，而耗竭持续时间仍与RIPK2合成速率相关。慢性暴露可选择降解机器缺陷。对VHL和CRBN募集PROTACs的耐药与相应E3连接酶复合物改变相关，而增加MDR1可降低胞内PROTAC蓄积并产生内在或获得性耐药。分子胶具有相关负债。CRBN突变、拷贝丢失、结构变异、改变剪接或新底物界面突变可阻止有效胶诱导降解。切换至替代连接酶如DCAF1可绕过一条 disabled 途径，但替代而非消除机器依赖性。HyT可类似避免依赖特定募集E3，同时仍依赖伴侣和蛋白质量控制途径。
对于溶酶体和自噬降解剂，获得性临床耐药较少确立，但相关检查点已明显。减少受体可用性、增强回收、损害内体成熟或溶酶体功能障碍可降低LYTAC通量。膜E3降解剂额外依赖所募集跨膜连接酶的表达和催化完整性。ATTECs、AUTACs和AUTOTACs需要完整货物识别、自噬体形成和溶酶体流，而经典CMA需要功能性HSC70–LAMP2A机器和与展开和转位兼容的底物。因此，TPD候选物应使用活性暴露、机器丰度和功能、途径特异性承诺、降解深度和速率、靶标恢复和下游响应的匹配测量进行评估。核心问题不是降解剂是否在一个终点降低蛋白丰度，而是完整降解循环是否在药理学可及暴露下有效、选择性和持久地运作。
4 降解剂递送与时空控制
细胞试验中观察到的活性不一定转化为体内治疗效力。降解剂必须到达疾病组织、进入相关细胞并以活性形式保持可用。因此，递送、细胞进入和释放将分子设计与治疗应用连接起来。
4.1 非纳米颗粒递送与激活
对于可及组织，局部给药可将降解剂置于其预期作用位点附近。在雄激素性脱发小鼠模型中，局部应用的AR降解剂C6在皮肤中蓄积、诱导AR降解并促进毛发生长。另一项研究将AR PROTAC纳入溶解微针以通过皮肤递送至毛囊。局部给药也已用于LYTACs。玻璃体内注射后，双特异性适体基LYTAC诱导VEGF降解并减少小鼠模型中病理性视网膜新生血管和血管渗漏。因此，局部递送方法的选择取决于病变位置和周围屏障。
对于需要全身给药的病变，分子偶联可影响哪些细胞遇到降解剂。ROR1抗体–PROTAC偶联物在结合并进入ROR1表达细胞后诱导BRD4降解。在所研究小鼠模型中，它相较未偶联PROTAC还显示改善的药代动力学和抗肿瘤活性。偶联同样用于将溶酶体降解剂导向选定细胞。叶酸受体靶向嵌合体在肿瘤模型中降解细胞表面和胞外蛋白。转铁蛋白受体结合肽被纳入称为Pep-TAC的肽基溶酶体降解剂，在小鼠脑肿瘤模型中显示PD-L1降解活性。这些设计使用不同识别组件影响降解发生位置，而不依赖纳米颗粒载体。
对于作用于胞内货物的自噬导向降解剂，偶联也可促进细胞进入。与环状细胞穿透肽连接的自噬靶向纳米抗体嵌合体进入细胞并诱导HE4降解。在另一项研究中，静脉给予的Tat–SIRT5–CTM在小鼠中穿越血脑屏障并诱导SIRT5溶酶体降解。这些研究分别解决细胞摄取和脑组织 access。
条件激活提供降解剂给药后的控制。双作用专一性PROTACs被设计为需要缺氧和组织蛋白酶-L两者才能激活。相关策略已应用于LYTACs：将谷胱甘肽响应性笼状聚糖与抗PD-L1抗体偶联产生具有条件依赖性PD-L1降解的pro-LYTAC。因此，条件激活可调节蛋白酶体和溶酶体系统中的降解剂活性。
局部给药、分子偶联和条件激活针对递送的不同阶段。纳米载体提供结合降解剂负载与组织分布和释放控制的进一步手段。这创造了在单一递送策略可能不足的组织中改善降解剂暴露的机会。
4.2 纳米技术赋能的TPD
胞内运输需求因每种TPD技术的作用机制而异。对于需要降解胞内蛋白的PROTACs，其功能取决于胞质中的UPS。因此，PROTACs纳米载体设计必须优先确保有效内体逃逸的机制。已开发多种策略应对该挑战。pH响应性系统利用聚乙烯亚胺等聚合物的“质子海绵效应”，导致渗透肿胀和酸性内体破裂。酸不稳定化学键策略使用在酸性环境中断裂的可切割连接子，通过化学或机械应力诱导膜破坏。膜融合方法利用与内体或溶酶体膜融合的融合性材料，允许直接胞质递送。相反，纳米LYTACs通过受体介导内化将胞外或细胞表面靶标导向溶酶体。其设计应促进细胞选择性靶标摄取和随后溶酶体运输。对于该降解途径，内体逃逸至胞质通常不需要。AUTAC作用于胞内靶标，需要进入胞质或其他相关胞内亚区域，然后诱导K63连接泛素化和自噬介导降解。纳米AUTAC设计应实现活性降解剂的控释和内体逃逸以 access 胞内靶标。这些差异指导每种TPD模式的纳米平台设计。
4.2.1 纳米材料平台
纳米材料具有可调尺寸、易修饰表面、负载兼容性强和释放过程可控等特征，使其能够从多方面支持TPD。除简单包封降解剂外，纳米材料还可改善难溶性降解剂的制剂和全身暴露、增强细胞摄取、调节胞内运输并实现刺激响应性释放。目前用于TPD的主要纳米材料包括脂质基载体、仿生囊泡、聚合物纳米材料、无机纳米颗粒、蛋白纳米系统和DNA基纳米平台。这些材料不仅可作为纳米载体促进降解剂递送和释放，还可作为直接参与分子识别和胞内运输过程的集成纳米系统。
脂质基纳米载体主要包括脂质体和脂质纳米颗粒（LNPs）。脂质体可同时包封亲水和疏水化合物并在细胞摄取后进入内吞运输途径。这些特征特别适合PROTACs，因为其大分子尺寸和理化性质可能限制水溶性和膜通透性。因此，脂质制剂可改善降解剂稳定性和组织暴露。LNPs可进一步递送小分子、肽和核酸有效载荷。可电离脂质在酸性内体中质子化，增强膜相互作用并促进胞质有效载荷释放。该过程对于必须 access 胞内靶蛋白和降解机器的降解剂尤其重要。因此，脂质平台的作用不仅增加颗粒摄取，更重要的是增加药理学活性降解剂在细胞中的有效暴露。
仿生囊泡主要包括外泌体、红细胞膜囊泡和细菌外膜囊泡（OMVs）。外泌体保留源细胞膜组件并具有良好生物相容性，可运输蛋白、脂质和核酸等多种货物。这些性质有利于递送细胞通透性差的降解剂或核酸编码降解系统。红细胞膜囊泡保留CD47等膜蛋白，可减少巨噬细胞清除并延长循环时间，其表面可进一步功能化以改变组织分布。源自红细胞膜的杂合系统也已用于溶酶体–TPD。OMVs具有强细胞摄取和货物递送能力，但其自身免疫活性需要与蛋白降解依赖性治疗效果区分。
聚合物纳米颗粒和聚合物胶束在分子结构和表面化学方面提供实质灵活性，可通过纳米沉淀、自组装或共价偶联构建。两亲性嵌段共聚物可自组装成含疏水核和亲水壳的结构，从而改善疏水货物的水分散性并增加循环稳定性。对于PROTACs，这些特征可帮助解决相对较大和疏水分子相关的制剂限制。更重要的是，聚合物系统可纳入pH、氧化还原或酶响应单元，在定义胞外或胞内条件下触发颗粒解组装或货物释放。这种多步响应性可将疾病部位颗粒蓄积转化为活性降解剂的局部可用性，使聚合物材料特别适合纳米PROTACs的时空控制。其结构灵活性还支持屏障导向制剂，如与CA19-9抗体偶联的PROTAC负载PLGA纳米颗粒增强肠上皮运输。然而，仅纳米颗粒内化不能确立成功TPD。降解剂必须以药理学活性形式释放并达到足够胞内浓度以接合靶标和相关降解机器。因此，对于聚合物基TPD，释放动力学和有效胞内暴露比仅颗粒摄取更具信息性。
无机纳米颗粒主要包括介孔二氧化硅、金纳米颗粒和上转换纳米材料。介孔二氧化硅具有大比表面积、可调孔径和多功能表面化学，实现高效药物负载和响应性释放。上转换纳米颗粒可将近红外光转换为更高能量光。在代表性PROTAC递送系统中，该性质被用于触发光敏剂介导的活性氧生成，促进内体逃逸和dBET6胞质释放以增强BRD4降解。金基纳米系统已被研究用于膜融合和肽PROTAC递送，说明其支持胞内运输和TPD的潜力。因此，这些材料既可作为递送载体也可作为纳米级降解系统的结构组件。
蛋白基纳米材料主要包括铁蛋白、白蛋白及相关自组装蛋白支架。铁蛋白形成明确纳米笼，H-铁蛋白基纳米笼可经TfR1介导细胞内化。其内部空腔可容纳治疗货物，而外表面可支持功能配体多价展示。因此，铁蛋白既可作为递送载体也可作为促进受体介导溶酶体降解的活性支架。最近报道的Ferritac和铁蛋白基LYTAC平台例证该机制。白蛋白具有高血浆稳定性和延长全身暴露。白蛋白结合或可切割PROTAC设计可利用这些性质改善降解剂药代动力学，随后释放活性分子。因此，蛋白基纳米平台不仅是被动载体，其受体相互作用、循环行为和结构特征也可影响TPD剂的組織分布和细胞摄取。
DNA和其他核酸纳米结构表现出高度空间可编程性。通过Watson–Crick碱基配对，DNA可组装成四面体、框架和其他结构定义纳米系统。其在TPD中的主要优势不仅在于货物递送，还在于功能配体数量、间距和空间定向的精确控制。DNA框架可同时展示TBLs和E3连接酶配体，从而在纳米级组织降解组件。类似原理也适用于DNA基LYTACs，其中配体价数和空间几何可影响受体接合、内化和随后溶酶体运输。因此，DNA纳米结构既可作为递送载体也可作为直接参与降解过程的几何模板。其进一步发展仍需改善核酸酶稳定性、折叠一致性、链纯度和潜在免疫识别。
总体而言，不同纳米材料在TPD中执行不同药理学功能。这些材料性质可增加降解活性分子或功能组件在适当细胞和亚细胞区室中的有效暴露，从而最大化TPD活性。在此基础上，以下部分进一步讨论纳米PROTACs、纳米LYTACs和纳米赋能自噬导向降解系统如何利用这些平台满足其独特递送和时空控制需求。
4.2.2 纳米PROTAC
对于纳米PROTACs，细胞摄取仅是靶标降解的一步。活性降解剂还必须在可接合其靶蛋白和所募集E3连接酶的位置变得可用。该区别适用于携带EGFR和BRD4导向降解剂的纳米脂质体、携带dBET6和CXCL9的混合壳胶束以及展示HER2结合和CRBN募集基团的金纳米簇等不同制剂。每种系统具有不同治疗目的，但仅颗粒摄取不能确立其PROTAC组件已到达有效胞内位点。因此，胞内释放和靶蛋白耗竭仍是降解剂活性的必要测量。
4.2.2.1 自组装和无载体纳米PROTACs
自组装为传统纳米PROTAC制剂（降解剂负载于单独制备载体中）提供了替代方案。早期纳米PROTAC设计已利用自组装纳米材料进行控释降解剂递送。例如，ARV-771被包封在氧化还原响应性聚二硫酰胺纳米颗粒中，在还原条件下解组装以促进胞内降解剂释放。
更近期研究将该概念扩展至无载体制剂。dBET57和氯e6通过非共价共组装形成纳米颗粒，无需额外药物辅料。PROTACs也已与花菁染料如IR783和吲哚菁绿共组装生成超分子纳米颗粒，PROTAC含量高达约70 wt%且无外源载体。或者，自组装可直接编码于降解剂结构中。两亲性EGFR靶向PROTACs自发形成稳定纳米颗粒而无外部辅料，并相较相应游离PROTAC显示改善的水溶性。类似地，将烷基连接子和脂肪酸纳入适体衍生PROTAC生成双疏水模块，促进纳米胶束形成、增加细胞内化约五倍并实现有效胞内硬骨素降解。
这些研究表明，疏水性和两亲性（否则可能促成游离PROTACs的不利性质）可被利用支持纳米级组装。然而，自组装不应自动等同于完全无载体制剂，因为稳定剂、靶向涂层、染料或其他辅助组件可能仍存在。对于胞内靶标，组装系统还必须在靶蛋白和所募集E3连接酶均可及的位置解组装或释放降解 competent PROTAC。通过减少对单独制造载体材料的依赖，无载体自组装PROTACs可简化制剂组成和制造要求，从而改善其临床转化潜力。
4.2.2.2 条件激活与释放
条件激活和释放提供了一种机制手段，将全身递送需求与胞内蛋白降解需求分离。游离PROTACs必须在给药和循环期间保持足够溶解度和稳定性，到达适当组织和细胞，随后达到允许有效接合靶蛋白和所募集E3连接酶的胞内浓度。纳米制剂可通过在运输期间将降解剂保持在保护、增溶、偶联或无活性状态，并在到达预期生物环境后转化为降解 competent 物种，部分解耦这些需求。因此，相关纳米效应不仅是增加颗粒摄取。相反，纳米技术可将PROTAC活性所需功能重新分布至连续递送阶段，制剂支配全身运输、组织分布、细胞进入和释放，而释放的降解剂保留有效靶标–E3连接酶接合责任。
内源性氧化还原条件提供若干化学不同机制用于该转化。ARVat PDSA将ARV-771包封在聚二硫酰胺基质中，其二硫键稳定聚合物网络。升高的胞内谷胱甘肽还原这些键，使聚合物骨架不稳定并导致颗粒解组装和ARV-771释放。Nano-MPat PSI是一种超分子金(I)-硫醇-肽复合物（Nano-MP），涂有pH响应性聚丙烯酰巯基咪唑（PSI），转而依赖可逆Au(I)-硫醇配位。酸性条件下PSI涂层质子化促进细胞摄取，随后胞内谷胱甘肽破坏Au–S相互作用，导致纳米结构解组装和MDMX导向肽降解剂释放。相关系统表明还原敏感性也可与细胞特异性递送结合。称为CREATE的双靶向纳米PROTAC由CRV工程化Lewis肺癌细胞膜、pH/GSH响应性DS-PLGA和BRD4降解剂dBET6构建，设计为靶向肺癌细胞和肿瘤相关巨噬细胞。在皮下和原位LLC肿瘤模型中，CREATE在两种细胞群体中促进BRD4降解、诱导凋亡并抑制肿瘤生长。携带SIAIS171142的GSH响应性纳米胶囊类似地将二硫交联剂切割与BRD4降解剂释放偶联，同时纳入胶质母细胞瘤靶向特征。ROS可提供替代内源性触发。在BT-NanoPROTAC中，ROS响应性硼酸修饰ARV-771衍生物与Poloxamer 188形成纳米颗粒并在活化肝星状细胞中释放活性ARV-771，将条件性纳米PROTAC激活扩展至肿瘤学之外。因此，疾病相关氧化还原条件可控制聚合物解组装、配位相互作用破坏、交联剂切割或降解剂化学脱掩。
酸度和酶活性可进一步将递送分为连续步骤。在CDK4/6导向顺序响应性纳米颗粒中，肿瘤微环境轻度酸性条件诱导颗粒转化为更小组装体，改善穿透和细胞摄取。内化后，溶酶体组织蛋白酶B切割连接聚合物与PROTAC的含Gly–Phe–Leu–Gly连接子，释放活性降解剂并增加CDK4/6耗竭。ALK导向平台应用类似级联，其中酸响应结构转化先于组织蛋白酶B介导的ALK降解剂释放和随后ALK及磷酸化ALK减少。酶响应激活也可直接纳入含降解剂纳米结构。在SPNpro中，吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）靶向PROTAC肽通过组织蛋白酶B可切割肽与半导体聚合物连接。蛋白水解切割在CatB富集肿瘤细胞中释放降解剂，而半导体聚合物在近红外照射下独立产生单线态氧。在携带原发和远端4T1肿瘤的BALB/c小鼠中，SPNpro促进IDO降解并增强抗肿瘤免疫应答。pH响应材料还可额外修饰细胞进入本身。在nChap平台中，聚(β-氨基酯)在酸性肿瘤组织中质子化改变胶束状态和表面电荷，促进细胞摄取和dBET6释放，同时同一载体递送CXCL9。这些系统说明酸度或酶活性不仅触发药物释放。它可调节颗粒大小、表面性质、肿瘤穿透、细胞摄取和最终胞内可用PROTAC的生成。
外部刺激对同一递送至降解序列提供更大时间控制。在自组装近红外响应平台中，ARV-771通过硫缩酮连接子与焦脱镁叶绿酸a连接。照射激活光敏剂并产生单线态氧，切割硫缩酮键并释放ARV-771进行BRD4降解。上转换纳米材料通过机制不同途径使用近红外照射。UMSNsat phoBET1将980nm激发转换为更高能量发射，光解phoBET1的笼状基团并恢复活性BRD4降解剂。相反，携带未修饰dBET6的纳米器件使用上转换介导的玫瑰红激活产生反应性氧物种，促进内溶酶体逃逸和dBET6胞质释放。在后一情况下，PROTAC本身未被化学切割或脱笼。相反，纳米效应改变胞内运输，强调仅细胞摄取不能确立有效PROTAC递送。该问题已通过可电离纳米PROTAC更直接解决，其中叔胺与疏水C16段合作增强细胞摄取并促进质子海绵介导内体逃逸，从而增加胞质递送和富亮氨酸α-2-糖蛋白1降解。
其他外部施加能源调节深层组织中的类似过程。X射线响应性RCNprotac含有通过含二硒连接子与聚乙二醇偶联的MZ1。照射破坏辐射敏感性连接并释放MZ1进行BRD4降解。在超声响应性NPCe6+PRO平台中，氯e6在超声照射下产生反应性氧物种，切割硫缩酮连接并释放BRD4导向PROTAC在胰腺肿瘤模型中。更复杂设计使用多种肿瘤相关线索解决瘤内异质性而非依赖单一刺激。PGDATat N结合MMP-2响应性去PEG化、酸依赖性纳米结构变化、ROS可切割硫缩酮连接和缺氧响应性ARV-771前体。该设计促进肿瘤蓄积和穿透，同时允许在不同氧合肿瘤区域进行BRD4降解。这些示例表明空间选择性不仅源于纳米颗粒蓄积，还源于将降解 competent PROTAC形成限制于存在所需触发的组织或区域。
生物正交化学通过递送后生成活性降解剂扩展该原理。在AuPLs中，受保护dBET1衍生pro-PROTAC和水溶性Pd催化剂共递送于涂有月桂酸/硬脂酸相变层的金纳米立方体中。近红外光热加热熔化涂层并释放两种组件，允许Pd介导脱保护并恢复BRD4降解活性。无催化剂策略用4-(乙烯氧基)苄基碳酸酯基团掩蔽MZ1的VHL结合区域生成MZ1-O。靶向纳米颗粒全身递送MZ1-O，而局部给予含四嗪微针启动逆电子需求Diels–Alder反应，随后键切割和1,6-消除再生[226]。Nano-CLIPTACs更进一步，将ALK导向PROTAC分成两个较小前体，分别包封于环RGD修饰脂质体中。肿瘤靶向递送后，胞内生物正交反应生成完整功能PROTAC。该研究还证明抗钩效应，表明控制完整降解剂形成位置和时间可改变支配有效降解的浓度条件。生物正交化学还可用于肿瘤保留层面。在POLY-PROTAC纳米颗粒中，胞外酸度暴露预靶向纳米颗粒上的DBCO基团，使叠氮功能化POLY-PROTACs通过点击介导保留在肿瘤部位。随后二硫键的胞内还原释放活性BRD4降解剂。因此，生物正交反应可控制降解剂脱笼、原位PROTAC组装或胞内释放前空间富集。
纳米制剂还可通过改变分布和限制活性降解剂可用位置重塑PROTACs的组织选择性。纳米颗粒大小、表面性质和制剂特征影响循环和组织暴露，而膜伪装或靶向配体可进一步偏倚递送至选定组织或细胞群体。微环境响应性释放和外部控制激活通过将降解 competent PROTAC生成限制于定义病理或处理区域提供额外空间限制层。因此，纳米PROTAC系统中的组织选择性源于生物分布、细胞递送和局部降解剂激活的联合控制而非仅纳米颗粒蓄积。
更广泛而言，这些系统表明纳米技术通过一系列机制不同过程而非仅被动包封重塑PROTAC行为。纳米制剂可改善制剂和全身运输、增强组织穿透和细胞摄取、促进内体逃逸，并通过纳米结构解组装、键切割、脱笼或原位合成调节活性PROTACs的胞内可用性。这样，与全身递送相关的部分理化负担从PROTAC分子转移到制剂，而释放或再生的降解剂仍负责有效靶标–E3连接酶接合。
纳米制剂还可通过控制活性PROTACs的胞内可用性影响钩效应。响应性基质、可切割连接子和触发纳米结构解组装可延迟运输期间降解剂释放。这可重塑游离PROTAC的胞内浓度–时间曲线。过快释放可能瞬时产生高胞内浓度并有利于非有效二元复合物。相反，过慢释放可能提供不足活性降解剂用于有效三元复合物形成。Nano-CLIPTACs提供更直接示例。两种PROTAC前体分别递送并在胞内生物正交反应后形成完整降解剂。这种活性PROTAC的受控形成与减少的钩效应相关。因此，纳米材料可通过调节胞内PROTAC释放或生成的速率和时机调节钩效应。
这些机制优势是否最终转化为有意义的药理学益处取决于其药代动力学和药效学后果。延长循环或增加肿瘤蓄积仅在增加靶组织 and 相关胞内区室中降解 competent PROTACs的有效暴露，从而产生可测量靶标耗竭时才具有药理学意义。若干研究表明纳米制剂可将改善的药代动力学转化为增强的蛋白降解。在CT26荷瘤小鼠中，单剂顺序响应性CDK4/6纳米PROTAC在报道匹配剂量下分别产生比相应游离PROTAC高约2.6倍和3.0倍的肿瘤CDK4和CDK6耗竭。类似地，ALK靶向纳米平台将改善的全身暴露和肿瘤蓄积与ALK和磷酸化ALK水平更大减少联系起来。P-选择素靶向Fi-dBET6纳米颗粒也实质改变dBET6的体内处置，将其血浆半衰期从约30分钟延长至3小时并增加肿瘤组织中浓度。在相同15 mg/kg剂量下，Fi-dBET6在肿瘤中诱导显著BRD4降解，而游离dBET6未产生显著靶标耗竭。然而，改善的药代动力学不一定转化为更强药效活性。与溶液制剂相比，GNE-01的脂质体包封在小鼠中增加全身暴露约80倍，在大鼠中约380倍，但该暴露大幅增加未导致肿瘤中更大BRM降解，可能由于PROTAC从脂质体释放缓慢。这些发现表明仅延长循环或增强组织蓄积不足以确保改善的蛋白降解。相反，活性降解剂必须以适当速率释放并达到支持有效三元复合物形成的胞内浓度。
4.2.2.3 肿瘤学之外的应用
非肿瘤学研究将纳米PROTAC递送应用于实体瘤之外的其他屏障。开发了反应性氧物种可激活制剂以在活化肝星状细胞中释放ARV-771衍生BRD4降解剂，并在肝纤维化模型中评估。对于动脉粥样硬化，METTL4降解剂负载于涂有M2巨噬细胞膜的PLGA纳米颗粒中以增强递送至动脉粥样硬化斑块内巨噬细胞。在脉络膜新生血管中，开发了称为dNCLat tFNAs的四面体DNA构建体以改善核仁素导向降解剂的递送。直接添加游离dNCL至内皮细胞未产生用dNCLat tFNAs观察到的靶标耗竭，而蛋白酶体抑制阻断DNA构建体诱导的降解。这些研究将载体设计与疾病组织条件联系起来：活化星状细胞中的氧化应激、斑块内细胞定位和穿越眼屏障的有限 access。
联合制剂也在肿瘤学之外研究。在类风湿关节炎模型中，自组装纳米PROTAC将COX-2导向降解剂与桦木酸配对，后者除PROTAC组件外贡献生物活性。该区别对肝纤维化和动脉粥样硬化平台也重要，其中制剂变化可能影响哪些细胞接受降解剂，而对dNCLat tFNAs，与直接添加dNCL的比较将改善递送与观察到的核仁素丢失联系起来。总之，这些研究表明纳米PROTAC的价值取决于其所解决的屏障和将递送与靶标降解联系起来的证据。在纳入另一活性治疗时，其对疾病改善的贡献必须与蛋白耗竭的贡献区分。
4.2.3 纳米LYTACs
4.2.3.1 多价组织与受体募集
纳米LYTACs使用纳米级支架将靶标结合模块与促进溶酶体运输的组件聚集在一起。支架决定展示多少结合基团及其排列方式，这可影响靶标接合是否导致有效内化。GalNAc修饰糖多肽纳米球募集ASGPR，而金纳米颗粒锚定适体嵌合体结合ABCG2识别与IGF2R募集。DNA纳米组装提供可编程替代方案，其中靶标和受体结合适体的位置可调整。跨这些系统，增加细胞表面结合或摄取本身不能确立改善的降解。结合靶标必须随后到达降解性溶酶体区室。
可编程DNA结构提供纳米级组织影响靶标降解的相对直接证据。多价DNA LYTACs已由识别致病膜蛋白和IGF2R的适体组装而成，允许其结合模块的空间分布变化。智能模块化DNA LYTAC纳米器件通过控制靶标结合位点数量和促进降解的pH响应模块扩展该方法。在直接比较中，携带靶标特异性适体和三价GalNAc的四面体DNA LYTAC在测试肝细胞系统中诱导约两倍于相应单价适体LYTAC的膜蛋白降解。另一系列展示一个、三个或九个结合单元的DNA构建体在所检查受体途径中随价数增加显示增强降解。这些结果支持在定义条件下多价展示的药效学益处，尽管最有效排列取决于靶标和所募集受体。
受体选择也影响纳米LYTAC作用位置和方式。携带GalNAc的纳米球募集ASGPR，使受体表达与降解的细胞背景相关。整合素导向纳米嵌合体使用多价RGD肽接合αvβ3整合素和附着抗体结合PD-L1。在报道模型中，复合物经历内化和溶酶体降解，限制PD-L1回收。展示在金纳米颗粒或DNA组装上的IGF2R结合适体提供靶标运输的不同途径。最近工程化成纤维细胞衍生纳米囊泡展示PD-1和转铁蛋白以分别结合PD-L1和TfR1。这些研究表明所募集受体影响哪些细胞可内化构建体以及结合靶标是否进入有效降解途径。
4.2.3.2 条件控制与替代架构
一些纳米LYTAC系统将靶标降解与局部激活或第二治疗功能偶联。报道表面组装肽结构的半导体聚合物纳米颗粒诱导PD-L1降解同时支持光动力治疗。在酸度响应制剂中，纳米颗粒表面变化促进PD-L1导向纳米LYTAC在肿瘤环境中的活性，伴随过氧化氢酶相关治疗组件。声动力纳米LYTACs将靶标范围扩展至M2巨噬细胞上的IL-4受体，并将受体降解与超声依赖性肿瘤微环境效应结合。自组装CTGF导向LYTAC纳米颗粒已用谷胱甘肽响应性连接构建，而CAIX靶向超分子组装体利用膜相关CAIX促进PD-L1内化。因为这些制剂也可能产生反应性氧物种或其他生物学效应，其整体治疗活性不能完全归因于蛋白降解。
蛋白笼和生物囊泡提供在单一构建体内组织靶标结合和溶酶体运输的进一步方式。人重链铁蛋白LYTACs通过SpyTag-SpyCatcher偶联展示靶标特异性亲和体，并通过工程化铁蛋白支架募集TfR1。报道构建体降解HER2、EGFR和PD-L1，有证据表明TfR1依赖性内化和颗粒多价性质均有贡献。PD-1/转铁蛋白纳米囊泡也募集TfR1，但将功能蛋白展示在囊泡膜上而非蛋白笼上。工程化细菌外膜囊泡提供另一种制剂用于TfR1相关PD-L1降解并贡献自身免疫刺激活性。因此，用这些构建体观察到的靶标丢失可能涉及不同运输途径和伴随生物学效应，即使它们募集相同受体。
多价纳米结构也可促进溶酶体降解而无需传统LYTAC的受体募集排列。Ferritac在铁蛋白上展示多个抗体以交联相邻膜蛋白并诱导内化而无需募集额外溶酶体运输受体。环状多价纳米抗体靶向嵌合体募集清道夫受体并促进结合膜蛋白的网格蛋白或小窝相关内化。称为PANTACs的适体功能化金纳米颗粒已被报道通过网格蛋白相关摄取诱导膜蛋白降解而不依赖LTR。这些方法拓宽了纳米级构建体将结合膜蛋白导向溶酶体的途径。其摄取机制仍区别于明确募集溶酶体运输受体的纳米LYTACs。
4.2.3.3 药效学和药代动力学证据
纳米LYTAC是否优于非纳米降解剂取决于比较物和所测终点。四面体DNA研究将靶标降解与相应单价适体LYTAC诱导的降解比较，而受控价数DNA系列检查相关构建体内结合单元数量的影响。其他比较解决更窄问题。GalNAc纳米球相对游离西妥昔单抗增加EGFR内化，但西妥昔单抗单独缺乏完整LYTAC的受体募集组件。这些结果支持纳米级组织在测试系统中的作用，但与抗体或单个结合模块的比较不能确立优于完整、结构匹配的非纳米LYTAC。
关于全身暴露的证据需要相同区分。在一项铁蛋白研究中，从荧光测量估计的血浆半衰期为HER2靶向纳米笼构建体131.8分钟，而其游离HER2结合模块为9.3分钟。这支持将结合模块纳入铁蛋白后更大持久性。然而，游离比较物不是完整非纳米LYTAC。某些靶标结合物的附着还降低铁蛋白构建体对TfR1的亲和力，表明改善的靶标结合或更长循环不一定产生更强受体介导降解。与受控价数DNA研究一起，这些发现说明为何结合、受体募集、全身暴露和靶标耗竭需作为纳米LYTAC的单独性质解释。
4.2.3.4 肿瘤学之外的应用
溶酶体纳米降解剂正在炎症和眼部疾病中研究。募集巨噬细胞清道夫受体A的超分子组装促进胞外IL-17A溶酶体降解并减少银屑病样疾病小鼠模型中的炎症。在眼部疾病中，识别VEGF和M6PR的双特异性适体LYTAC提供局部给予胞外蛋白降解的非纳米示例。基于核酸的LYTAC Plus水凝胶在新生血管性年龄相关性黄斑变性模型中将VEGFR-2降解与siRNA介导ANG-2沉默结合。更近期，包含多个适体基VEGF降解单元的DNA纳米花被用于携带维替泊芬进行联合降解和光动力治疗。水凝胶和纳米花结果反映不止蛋白降解，而用作纳米花对照的单个适体不等同于完整游离LYTAC。
相关系统也已在神经和心血管疾病中研究。靶向RAGE的内吞触发多价纳米嵌合体在阿尔茨海默病模型中评估，同时解决递送至相关组织和疾病相关蛋白清除。在急性心肌梗死中，Ly6G靶向红细胞模拟脂质体降解剂促进巨噬细胞SIRPα丢失并通过区别于传统受体募集LYTACs的途径增强胞葬作用。与IL-17A导向组装一起，这些研究将纳米级溶酶体降解扩展至肿瘤细胞膜蛋白之外。它们还强调不同疾病的不同需求：到达相关组织、接合适当细胞群体和证明预期蛋白丢失是相关但可单独验证的结果。
跨这些应用，纳米级设计益处的最清晰证据来自价数或排列受控差异的密切 related 构建体之间的比较。优于完整非纳米LYTAC的药代动力学证据仍较不直接，如铁蛋白与游离结合模块比较所示。对于联合系统，疾病结果改善还必须与siRNA、光动力治疗或其他活性组分的效应一起解释。
4.2.4 自噬–溶酶体途径纳米TPD
4.2.4.1 纳米AUTAC
与纳米PROTACs不同，纳米赋能自噬导向降解剂主要不以胞质释放和E3连接酶接合评估。其活性需要所递送构建体保持有效货物识别和相关自噬机器接合，随后完成自噬流和溶酶体降解。因此，增强摄取或肿瘤蓄积不足，除非纳米系统支持货物隔离和降解所需的途径特异性步骤。进入细胞后，AUTAC的靶蛋白配体结合靶蛋白，降解标签模拟S-鸟苷酸化修饰，诱导靶蛋白多泛素化。然而，AUTAC分子的差水溶性和高极性导致体内低生物利用度和通透性，这些限制可通过超分子自组装解决。超分子人工纳米技术是整合超分子化学与纳米技术的新兴领域，依赖非共价相互作用（如氢键、范德华力和静电相互作用）通过自组装形成具有特定结构和功能的纳米材料。该技术可对外部刺激（如光、电和温度）动态响应。作为药物载体，超分子纳米材料实现精确药物递送，增强效力同时最小化毒副作用。
Wang等人通过开发超分子人工纳米AUTACs（GM NPs）设计降解免疫抑制酶IDO引入新型治疗 method。核心组件GN通过将IDO配体NLG8189与嘌呤基可降解标签偶联合成。甲氨蝶呤（MTX）是一种核苷类似物，因其对GN的特异性亲和力被选择。以1:1摩尔比混合时，MTX和GN通过氢键和静电相互作用自组装形成直径约60 nm的纳米颗粒。胞内酸性条件促进纳米颗粒解组装和药物释放。MTX提供细胞毒性活性并诱导自噬，促进GN介导的IDO降解。在荷瘤小鼠中，GM NPs比游离GN或未组装MTX–GN混合物更有效降低肿瘤IDO蛋白水平并抑制肿瘤生长。药代动力学分析定量MTX暴露并显示半衰期为3.832 ± 0.037小时，是游离MTX的1.43倍。MTX AUC也是游离MTX的1.55倍。这些发现支持改善的体内效力和增强的MTX暴露。
氧化石墨烯（GO）具有生物灵活性，因其2D结构成为药物递送系统的理想材料。GO可被修饰用于TPD应用。Jin等人构建了选择性响应蛋白定位的纳米APTAC平台，通过酰胺键将蛋白特异性适体共价偶联至单层GO纳米颗粒。纳米APTAC可启动自噬–溶酶体和泛素–蛋白酶体途径，分别降解膜和胞内蛋白，从而扩展靶蛋白范围。
4.2.4.2 纳米ATTEC
因为连接S-鸟苷酸化样标签至K63连接泛素化的分子机器仍不完全明确，潜在脱靶效应需要进一步评估。另一方面，ATTEC直接结合LC3和靶蛋白，绕过泛素化需求。Xu等人开发了pH响应性MSPM纳米平台，通过双功能化设计促进肿瘤特异性蛋白降解。纳米ATTEC系统通过自组装三种不同二嵌段共聚物构建：POI（BRD4或AR）配体、LC3配体（ispinesib，IS）修饰聚(乙二醇)-b-聚(ε-己内酯)（PEG-b-PCL）和pH响应性PAE-b-聚(ε-己内酯)（PAE-b-PCL）。在生理pH下，纳米ATTEC的细胞内化极少。然而，在肿瘤轻度酸性环境中，PAE组件变得亲水并获得正电荷，显著增强纳米ATTEC构建体的摄取。该系统通过双配体桥接LC3和靶蛋白促进自噬体介导降解。此外，它诱导LC3-II表达并促进自噬体形成，创建增强自噬并加速降解的正反馈环。因此，BRD4降解效率显著改善。
此外，Liu等人采用生物正交化学实现肿瘤内ATTEC时空精确控制，使肿瘤组织中选择性线粒体耗竭成为可能。线粒体降解由肿瘤特异性蓄积的Apt-Cu30（一种适体引导铜纳米催化剂）触发。Apt-Cu30由形成铜纳米颗粒（CuNPs）的富胸腺嘧啶序列、用于癌症靶向的MUC1/AS1411适体和连接两者的连接子组成。定位后，炔基标记LC3募集弹头（alk-DP）和叠氮标记线粒体配体（azi-TPP）之间的生物正交反应生成bio-ATTECs，诱导线粒体自噬。Bio-ATTEC诱导线粒体–LC3相互作用，将线粒体锚定至自噬体并以浓度依赖性方式触发线粒体降解。Bio-ATTEC的原位生成体现“按需合成”策略，规避全身毒性。它仅在肿瘤部位合成，由于缺乏适体介导催化剂富集，正常细胞基本不受影响。纳米ATTEC通过利用环境响应性递送系统解决ATTEC相关脱靶问题，而生物正交催化和适体-金属纳米颗粒赋予其精确激活时空控制。
4.2.4.3 纳米CMA
CMA通过伴侣HSC70选择性识别具有KFERQ样基序的蛋白。这些蛋白随后与溶酶体膜蛋白LAMP2A相互作用，导致其在溶酶体中降解。CMA通过调节关键信号途径（包括Wnt/β-Catenin、p300/NF-κB/NLRP3和cGAS–STING）具有治疗肿瘤和神经退行性疾病的潜力。STAT3持续激活与多种癌症的发生和进展密切相关，但传统STAT3抑制剂因选择性和脱靶毒性差在临床应用中面临挑战。为解决此问题，Song等人开发了CMA靶向嵌合体（CMATAC），由STAT3结合肽和HSC70结合肽通过连接子连接组成。CMATACs随后被包封在LNPs中（nCMATACs），进一步用IGF2R靶向肽修饰生成InCMATACs用于肿瘤靶向递送。与模拟禁食饮食联合时，肿瘤细胞中IGF2R表达和CMA途径活性增加，从而增强抗肿瘤效果。类似地，Wang等人提出SM-CMADs，为溶酶体介导蛋白降解提供通用解决方案。他们利用联苯甘氨酸（δδRR）基序的自组装性质，将靶蛋白配体（如ERα、AR、MEK1/2和BCR–ABL）与KFERQ肽以受控比例混合。该策略在多种癌症模型中显示有前景的降解效果。
纳米技术的整合显著扩展了AUTAC/ATTEC和CMA系统的潜力。将外部刺激响应机制纳入纳米AUTAC/ATTEC/CMA平台代表实现靶蛋白精确、时空降解的关键步骤。然而，需要进一步进展以优化该方法以获得更大效力和临床适用性。
5 临床开发与转化进展
尽管TPD的机制和递送库已大幅扩展，临床转化在各模式间进展不均。临床前动物研究确立不同途径降解的可行性和生物学后果，而临床研究评估其在患者中的治疗相关性。TPD的治疗转化取决于靶标耗竭能否在体内重现并最终转化为临床益处。本节总结从临床前验证到临床开发的当前进展。
5.1 临床前动物证据
动物研究提供降解机制证明和临床开发之间的重要中间步骤。对于UPS导向降解剂，体内研究已确立靶标耗竭可与途径抑制和治疗应答联系起来。Vepdegestrant在ER阳性乳腺癌模型中产生ER降解和肿瘤生长抑制，而KRASG12D降解及BCL-xL和BCL-2同时耗竭将该原理扩展至致癌驱动因子和抗凋亡依赖性。纳米技术可进一步修饰体内暴露和组织递送。例如，顺序响应性纳米PROTACs增强结直肠肿瘤模型中的肿瘤穿透并延长CDK4/6降解。
溶酶体降解已将可及靶标空间扩展至胞内蛋白之外。ASGPR导向PCSK9降解改变高脂血症小鼠中的脂质代谢，而VEGF和5-HT2A受体导向LYTACs分别在视网膜血管生成和肝纤维化模型中显示治疗活性。SIRPα的受体介导溶酶体降解也已应用于心肌梗死后心脏修复。自噬导向方法提供对聚集倾向蛋白的互补 access。工程化外泌体递送促进帕金森病模型中α-突触核蛋白清除，而TauAutac-3减少阿尔茨海默病模型中病理性Tau和相关溶酶体应激。总之，这些研究表明靶向降解可在不同细胞途径中产生体内药效学和疾病相关效应。
5.2 临床开发
TPD从临床前概念验证到人体研究的进展对UPS导向小分子降解剂最为显著。其中，异双功能降解剂建立了最先进的临床管线，而分子胶和胞外降解策略也在扩展至更广泛治疗环境。根据公开来源，共鉴定53项涉及靶向蛋白降解剂的注册临床试验，涵盖肿瘤学（n = 46）和非肿瘤学适应症（n = 7）。
在肿瘤学中，异双功能降解剂的临床靶标谱已从激素受体扩展至信号蛋白、转录调节因子和突变定义致癌驱动因子。临床开发中的代表性靶标包括ER、AR、BTK、KRASG12D、BCL6和BCL-xL。ER导向降解已实现监管批准，而靶向AR、BTK和KRAS G12D的代表性降解剂已进入III期开发。相反，BCL6和BCL-xL降解剂仍主要处于I期或I/II期评估。ER导向降解迄今取得最清晰临床进展。口服ER靶向PROTAC vepdegestrant（ARV-471）获得美国食品药品监督管理局（US FDA）批准用于ESR1突变、ER阳性、HER2阴性晚期或转移性乳腺癌。在III期VERITAC-2试验中，vepdegestrant在ESR1突变人群中相对氟维司群显著延长无进展生存期（5.0 vs 2.1个月），尽管在总体人群中未观察到显著获益。作为首个US FDA批准的异双功能PROTAC，vepdegestrant为该治疗模式提供重要临床和监管验证。除ER外，其他若干肿瘤靶标已进入晚期临床开发。AR降解剂BMS-986365（gridegalutamide）、BTK降解剂tacabrutideg（BGB-16673）和KRASG12D降解剂setidegrasib（ASP3082）均已推进至III期研究。Setidegrasib也在KRAS p.G12D突变非小细胞肺癌和胰腺导管腺癌的I期研究中显示抗肿瘤活性，提供TPD可扩展至突变定义致癌驱动因子的临床证据。总之，这些进展表明肿瘤学聚焦TPD正从激素依赖性靶标扩展至血液信号蛋白和遗传定义致癌驱动因子。
TPD也在超越肿瘤学。脑穿透性LRRK2降解剂ARV-102已进入神经退行性疾病临床开发，并在人体中证明中枢神经系统暴露和药效学靶标接合。在免疫学中，口服STAT6降解剂KT 621在早期临床研究证明血液和皮肤中快速持续STAT6耗竭后，已进展至特应性皮炎和嗜酸性哮喘的IIb期研究。这些项目将TPD的转化背景拓宽至慢性疾病，其中持续组织暴露和长期耐受性变得越来越重要。
分子胶开发正经历平行转变。iberdomide在2026年的加速批准进一步确立CRBN介导新底物降解的临床相关性，而系统努力正将该原理扩展至先前未开发靶蛋白。例如，VAV1导向分子胶降解剂MRT 6160已进入舍格伦病II期评估，说明合理开发分子胶扩展至免疫介导疾病。同时，临床降解不再限于胞内蛋白。经典LYTACs仍处于临床前，而相关ASGPR接合胞外降解剂平台已进入临床开发。Biohaven的MoDE降解剂BHV-1300已推进至Graves病III期评估。
尽管进入临床开发的降解剂数量不断增加，当前管线仍以泛素蛋白酶体系统导向策略为主。溶酶体导向降解临床进展仍较少，尽管许多疾病相关蛋白为胞外或膜相关，因此无法被传统UPS基方法 access。未来发展应扩展溶酶体降解至有限受体和组织之外，特别关注靶标内化、受体分布、胞内运输和有效溶酶体递送。此类进展可实质拓宽TPD的临床可及靶标空间。
6 结论与展望
本综述系统总结TPD的机制、分子决定因素、递送策略和治疗开发。通过整合这些相互关联方面，研究人员旨在建立理解和优化TPD方法的综合框架，从而促进根据靶标特征和疾病背景选择适当降解模式。通过利用蛋白酶体依赖性、内吞溶酶体介导和自噬依赖性降解途径，TPD正将治疗干预从传统蛋白功能抑制转变为疾病相关蛋白稳态的主动调节。这些演进策略已实质扩展可及靶标范围，并创造调节胞内、膜相关和胞外蛋白的新机会，这些蛋白仍难以用传统药理学方法控制。
然而，实现有效蛋白降解需要的不仅是建立降解剂与靶蛋白之间的结合。多种相互关联因素，包括靶标可及性、有效降解复合物形成、降解机器的可用性和功能状态以及蛋白降解与再合成之间的动态平衡，共同决定降解效率和治疗结果。这些决定因素在不同TPD模式间差异显著，因此应作为分子设计期间的基本考虑纳入。未来TPD开发需要从仅优化靶标接合转向系统调节分子结构、细胞背景和降解动力学。
药物递送进一步增加TPD开发的复杂性，因为足够全身暴露不一定确保降解剂到达有效活性所需的相关组织、细胞或亚细胞区室。纳米技术提供应对这些限制的重要机会。纳米载体可改善难溶性分子的制剂性质、增强循环稳定性、调节生物分布并实现响应性释放和时空控制。当与靶向配体、仿生膜策略或微环境响应性设计结合时，纳米平台可进一步调节活性降解剂发挥功能的位置和时间。此外，某些纳米技术系统不仅作为递送载体，还作为通过多价展示、空间组织和功能模块整合直接贡献靶标识别和胞内运输的集成平台。这些能力为开发先进TPD平台和联合治疗策略创造新可能性。
尽管如此，纳米技术在TPD中的价值最终应基于功能结果而非仅递送参数评估。增加细胞摄取或增强组织蓄积不一定转化为更有效靶标降解或改善治疗效力。未来研究应确定纳米平台能否增加活性降解剂的生物利用度、促进持续靶蛋白消除并最终改善体内治疗窗。此外，纳米赋能TPD的临床转化仍面临非特异性摄取、免疫激活、延长载体保留、生理条件下释放行为改变以及批次间变异性、储存稳定性、可扩展制造和质量控制等问题挑战。因此，未来努力应优先考虑具有明确治疗目标、可控结构复杂性和已证明临床优势的纳米降解系统。
展望未来，响应性纳米平台可整合组织靶向、顺序释放和条件激活以改善疾病组织中降解控制。蛋白基和仿生载体值得进一步开发，同时严格评估其生物学命运和重复剂量安全性。共递送还可实现互补靶标的协调降解或耐药相关蛋白的去除以增强另一治疗。计算建模和人工智能可协助降解剂结构和载体性质的联合优化。将这些策略扩展至癌症之外将需要适应神经、炎症、代谢和心血管疾病的组织屏障和治疗需求。最终，将机制理解与可靠递送和实用制造相结合将是开发解决明确临床需求的TPD疗法的核心。
