苏拉威西特有东眼镜猴（Tarsius属）的多样化与上新世—更新世苏拉威西岛形成的关联

《Molecular Phylogenetics and Evolution》：The diversification of endemic Eastern tarsiers (genus Tarsius) in relation to the Pliocene–Pleistocene formation of Sulawesi

　　

华莱士区（Wallacea）位于印澳群岛（IAA）内，一个多世纪以来一直是生物地理学领域深切关注的对象。该区域处于大陆板块交汇处，呈现出从亚洲物种到澳大利亚进化起源物种的显著东西向更替。苏拉威西岛位于华莱士区中心，体现了驱动区域生物多样性与特有性的进化与生物地理过程，并补充了岛屿生物地理学的经典模型系统。典型概念模型通常讨论单一来源的迁徙者扩展其分布范围，而苏拉威西（及更广泛的华莱士区）展示了当两个截然不同的群落（即亚洲与澳大利亚）扩展至同一区域时所发生的生物地理过程。虽然苏拉威西如今是一个基本连续的岛屿，但此前曾是一个群岛，导致古岛屿边界现已被纳入连续陆块之中。苏拉威西于始新世开始形成，位于巽他与萨胡尔板块边界附近，其西部前体从巽他大陆（今婆罗洲）分离，导致望加锡海峡的形成。随后板块碰撞在新近纪和第四纪持续塑造苏拉威西的地质演化，该岛从原苏拉威西群岛演变为当今存在的大型连续岛屿系统。近期对该区域的精细古地理建模详细描述了苏拉威西在新近纪的地质演化，若干陆块浮现和/或沉没于海平面以下。这一苏拉威西可用陆块的时空模型使得更详细地分析岛屿地理演变对苏拉威西生物多样性影响成为可能。苏拉威西复杂的地质历史反映在其生物多样性中，其特征为超过300种特有脊椎动物，包括98%的非飞行哺乳动物。扩散而非隔离分化被认为是苏拉威西定殖的主要模式，一些类群完全源自单次向该岛的分布区扩张（如东眼镜猴；猕猴；沼银汉鱼科和阿德里安银汉鱼科鱼类；Pisidium双壳类；Draco蜥蜴），而其他类群则通过从邻近系统的多次独立扩散到达（如Crocidura麝鼩；弯趾壁虎）。无论其推测的到达时间如何，苏拉威西多个类群已被表征为快速的原地多样化，如昆虫、两栖类、爬行类、鱼类和哺乳类。快速多样化在若干案例中与上新世和更新世海平面低水位期及陆块扩张相关联。跨类群共享的特有区域（如猕猴和蟾蜍）促进了对近期合并的苏拉威西群岛内隔离分化和扩散事件的假说。根据其扩散能力，苏拉威西上的类群会在群岛各亚单元之间移动，并随着各陆块露出海平面而在分离的陆块上被隔离。这种原苏拉威西的踏脚石定殖促进了异域多样化，因为各个岛屿将谱系彼此隔离。然而，尽管苏拉威西的地质历史遵循 emerged 陆块增加的趋势，中新世和上新世的俯冲和海平面波动也导致先前露出的区域（暂时）再次淹没。因此，代表这一复杂地质过去的古地理模型对于全面理解该区域的进化过程至关重要。将古地理信息纳入苏拉威西生物地理历史分析已阐明了岛屿形状变化如何影响偶蹄类和飞蜥的个体物种关系。然而，尽管其他苏拉威西类群存在可比的高水平特有生物多样性，类似的建模方法尚未被用于为其多样化过程提供信息。将这些方法扩展到额外的脊椎动物类群（如哺乳动物）将为苏拉威西的地理演化如何导致生态学和生活史差异巨大的类群多样化提供关键视角。眼镜猴是小型夜行性灵长类，代表一个进化上隐秘的类群，其系统发育位置长期存在争议：根据所使用的形态学或遗传数据，最初被置于链鼻亚目（形成原猴亚目）的姐妹群，或作为人形亚目的姐妹群（从而形成简鼻猴类支系）。逆转录组分析后来得到全基因组分析的支持，最终解决了眼镜猴形类与人形亚目的确信姐妹关系。虽然现存眼镜猴现限于岛屿东南亚（菲律宾、马来西亚、印度尼西亚和文莱），但地质证据表明眼镜猴形类及其近亲历史上具有广泛的全球分布，化石发现于更广阔的亚洲大陆、北美以及可能在非洲。因此，眼镜猴是一个古老谱系的现存后代，该谱系在晚白垩纪（约81 Ma）至早古近纪（约60.4–55.4 Ma）之间与其他灵长类分化。Hill（1955）将眼镜猴分类为三个物种，其中一个为苏拉威西特有。隐秘的形态差异、高度分化的且 tentative 物种诊断性二重唱叫声（用于领地和社交目的）以及分子多样性后来导致东眼镜猴被重新分类为若干物种（Tarsius属），与菲律宾和西部物种（分别为Carlito syrichta和Cephalopachus bancanus）不同。目前描述了12种Tarsius，在苏拉威西及其周围小岛上呈旁域分布。现存眼镜猴的进化关系在若干方面令人困惑，特别是并非所有已描述的Tarsius物种都有遗传数据可用，且现有分子研究仅基于少量位点，导致物种水平关系的支持度仅为中等。尽管如此，在更深节点上持续存在一致支持，即山区眼镜猴（Tarsius pumilus）作为岛上所有其他现存眼镜猴的姐妹种，随后所有其他（"低地"）Tarsius种群分裂为两个支系（称为"谱系1"和"谱系2"；以下简称"Lin-1"和"Lin-2"）。东眼镜猴的多样化受其在苏拉威西存在期间的地质时期塑造。尽管眼镜猴可能早至23 Ma到达苏拉威西，但大多数多样化发生在相对较近的上新世—更新世。现今眼镜猴呈现出复杂的分布模式，地理上接近的物种不一定关系最近。先前关于眼镜猴从原爪哇到达苏拉威西并在向北和向东扩展范围时以连续和重叠波次多样化的假说能够解释这种分布。然而，这一假说受到严重挑战，因为发现T. pumilus（现今仅见于苏拉威西中部山地栖息地）的祖先在岛上任何其他已知眼镜猴多样化之前数百万年就从低地眼镜猴的前身分化出来。为更好地理解东眼镜猴的生物多样性和生物地理学，本研究分析了苏拉威西主岛上Tarsius谱系的系统发育关系和生物地理历史。简化代表性基因组技术允许表征和系统发育分析数百至数千个遗传位点，已被证明能够完全解决种间关系，即使在近期多样化的类群中也是如此。因此，研究人员在此应用简化代表性基因组方法来开发更稳健的系统发育树，并使模型驱动的方法能够估计祖先分布区。在阐明现存东眼镜猴之间的关系及其分布区的地质基础时，研究人员提出：（i）当使用基因组规模数据集时，Tarsius谱系的遗传关系是否与过去研究一致；（ii）苏拉威西不断演变的地理如何塑造眼镜猴谱系关系？研究人员进一步讨论了使用概率生物地理学方法分析眼镜猴进化时所做的参数选择。本研究代表了概率框架在眼镜猴生物地理历史中的首次应用，使研究人员能够在不预先指定其在苏拉威西起源点的情况下评估其分布区随时间的演变。

**研究背景与问题提出**
华莱士区（Wallacea）位于印澳群岛（Indo-Australian Archipelago, IAA）内，处于大陆板块交汇处，呈现出从亚洲物种到澳大利亚进化起源物种的显著东西向更替。苏拉威西岛位于华莱士区中心，是研究岛屿生物地理学的关键区域。该岛地质历史复杂：始新世开始形成，西部前体从巽他大陆分离形成望加锡海峡；新近纪和第四纪的板块碰撞持续塑造其地质演化，使其从原苏拉威西群岛（proto-Sulawesi archipelago）演变为当今的大型连续岛屿系统。苏拉威西具有超过300种特有脊椎动物，包括98%的非飞行哺乳动物。扩散而非隔离分化被认为是苏拉威西定殖的主要模式。尽管将古地理信息纳入生物地理历史分析已阐明了岛屿形状变化对偶蹄类和飞蜥物种关系的影响，但类似建模方法尚未应用于其他苏拉威西类群。眼镜猴是小型夜行性灵长类，代表进化上隐秘的类群。现存眼镜猴限于岛屿东南亚，但化石证据表明眼镜猴形类（Tarsiiformes）历史上具有广泛的全球分布。Hill（1955）将眼镜猴分类为三个物种，其中一个为苏拉威西特有。隐秘的形态差异、高度分化的二重唱叫声以及分子多样性后来导致东眼镜猴被重新分类为若干物种（Tarsius属）。目前描述了12种Tarsius，在苏拉威西及其周围小岛上呈旁域分布。现有分子研究仅基于少量位点，物种水平关系支持度仅为中等。东眼镜猴的多样化受其在地质时期塑造：尽管眼镜猴可能早至23 Ma到达苏拉威西，但大多数多样化发生在相对较近的上新世—更新世。先前关于眼镜猴从原爪哇到达苏拉威西并向北向东以连续波次扩散的假说受到严重挑战，因为发现T. pumilus的祖先在岛上任何其他已知眼镜猴多样化之前数百万年就已分化。本研究旨在利用简化代表性基因组技术开发更稳健的系统发育树，并应用概率框架估计祖先分布区，以阐明现存东眼镜猴之间的关系及苏拉威西地理演变对其分布区的影响。

**关键技术方法**
研究人员于2001至2012年间在苏拉威西主岛27个采样点采集耳组织或血液样本，共分析182个个体，归属8个物种（其中1个未描述）。样本经全基因组扩增后，采用MIG-seq（一种基于PCR的简化代表性文库技术，靶向简单序列间重复侧翼DNA序列）在Illumina NextSeq 500上测序。使用ipyrad流程进行序列比对和直系同源位点鉴定，获得三个不同完整性阈值的矩阵（分别代表1560、736和342个位点）。采用RAxML进行最大似然法（ML）建树，并以SVDquartets在多物种溯祖（MSC）模型下独立建树。使用TreePL进行时间校准，基于Hagemann et al.（2022）的二次校准点生成两棵时间树（TC1和TC2）。采用BioGeoBEARS进行祖先分布区估计（ARE），整合Nugraha and Hall（2018）的古地理图层，定义8个区域，比较DIVAlike、DEClike和BAYEAREAlike模型及其+w参数版本。

**研究结果**
3.1 系统发育分析：系统发育分析完全解决了所包含眼镜猴的关系，八个推定物种均以强自举支持度解析为支系。研究确认了先前描述的支系：T. pumilus、T. wallacei、T. supriatnai、T. spectrumgurskyae、T. fuscus、T. dentatus（Luwuk、Korosule和苏拉威西中部为内部不同支系）和T. lariang。来自Kendari的样本被鉴定为需要正式描述的独立谱系，称为Tarsius sp. 'Kendari'。以T. pumilus为根，T. wallacei、T. supriatnai、T. spectrumgurskyae和T. sp. 'Kendari'聚为Lin-1，而T. fuscus、T. dentatus和T. lariang聚为Lin-2。较大的矩阵解决了先前T. fuscus与T. dentatus关系的不确定性，揭示T. fuscus为T. dentatus的姐妹种。在T. dentatus内，Korosule个体与苏拉威西中部个体形成姐妹关系，Luwuk个体为外群。在T. wallacei内，南部种群作为支系嵌套于更广泛的样本集中，北部站点形成地理上广泛分布的并系群。

3.2 时间校准：使用四个校准区间的TC1树得出整体树较年轻的根，T. pumilus与所有其他Tarsius谱系的分裂估计在晚中新世（点估计6.57 Ma），所有其他节点发生在更新世（<2.35 Ma）。仅使用两个较深校准区间的TC2树得出整个树较老的日期，根估计在中中新世（点估计12.78 Ma）。然而大多数多样化事件——导致Tarsius广泛多样性的事件——在两棵树中均发生在上新世晚期至更新世之间。对于低地眼镜猴，TC1估计所有多样化事件发生在过去2.16 Ma内，而TC2估计多样化时期更长，始于3.32 Ma。

3.3 祖先分布区估计：首选生物地理模型为DIVAlike和DIVAlike+w（两棵时间树的AIC评分差异<2）。所有ARE一致表明，山区眼镜猴（T. pumilus）和近期低地眼镜猴物种的祖先均占据原苏拉威西中西部（概率估计0.93–0.99）。苏拉威西中西部在所有模型中持续为所有低地眼镜猴共同祖先最可能的区域。约2.1–3.2 Ma，低地眼镜猴谱系从中部向东扩展并分化为Lin-1和Lin-2。随后，随着苏拉威西在上新世—更新世从海洋中浮现，眼镜猴跨岛分布区扩张与两个低地谱系的进一步多样化和物种形成同时发生。Lin-1眼镜猴在早更新世占据东南至西北分布区，该分布区可能随后被Lin-2眼镜猴（将成为T. dentatus的谱系）在中晚更新世向东扩散所二分。Tarsius sp. 'Kendari'谱系在过去2.5 Ma持续占据东南部。Lin-1北部亚谱系是上新世—更新世分布区扩张的结果，首先从东南和苏拉威西中部向北并沿北部臂扩展。Lin-2物种的祖先在整个上新世大部分时间留在苏拉威西中西部，之后T. lariang祖先从[T. fuscus+T. dentatus]支系分化。苏拉威西在将世—更新世进一步浮现为连续陆地促进了Lin-2向苏拉威西中东部和南半岛的分布区扩张，随后隔离导致现存T. fuscus和T. dentatus谱系的形成。

**讨论与结论**
研究人员呈现的基于>1500个位点的东眼镜猴系统发育树确信地解决了更深的谱系间关系，其中一些在先前基于五个或更少标记的树中不明显。与先前分析一致，研究发现八个支系的证据与已描述的东眼镜猴物种一致，划分为三个主要谱系。分析支持先前观察到的山区眼镜猴与所有其他主岛东眼镜猴之间的深度分裂。研究分析了WGA样本以利用有限且后勤上具有挑战性的东眼镜猴组织，通过测试多个缺失数据阈值调查了WGA伪影的潜在影响，未发现偏倚引入分析的证据。T. dentatus谱系进一步由三个明确支系组成，反映样本的地理来源。先前研究中Luwuk个体与T. fuscus个体聚类（低支持度），但采样位置使这似乎不太可能；SRY单倍型网络和动物二重唱叫声也表明Luwuk个体属于T. dentatus。T. lariang、T. fuscus和T. dentatus之间观察到的关系不一致可能由于不完全谱系分选（incomplete lineage sorting），这在灵长类谱系中常见，在快速连续分裂的谱系中加剧。修订后的树支持T. lariang为[T. fuscus+T. dentatus]支系的姐妹种。

关于历史生物地理学与当代分布，"混合生物地理假说"（hybrid biogeographic hypothesis）讨论了每个独特的眼镜猴谱系似乎对应于其他苏拉威西类群中鉴定的特有性中心。本研究与先前研究一致，发现大多数东眼镜猴物种出现在上新世至更新世，远在眼镜猴初始定殖苏拉威西之后。东眼镜猴祖先估计在早中新世从西部和菲律宾眼镜猴共同祖先分化，当时它们通过穿越短暂陆桥或筏运定殖苏拉威西。这一早期分布区扩张远在其他非人灵长类物种到达该岛之前。尽管定殖时间不同，现存谱系的多样化似乎在眼镜猴与猕猴、倭水牛、鹿豚和疣猪中发生在上新世—更新世相似的时间尺度上。苏拉威西的古地理重建详细描述了北部、东部、东南部和南部（西南）半岛作为独立陆块在原苏拉威西群岛系统中浮现，该系统持续至中上新世。晚上新世至早更新世（2–4 Ma）见证了苏拉威西各臂的逐步连接。苏拉威西仅在更新世（1–2 Ma）才呈现其当代形状，所有部分相互连接。苏拉威西从群岛系统到连续岛屿的进程也跨越了火山活动和海平面波动时期。这些过程对塑造该区域生物地理学具有高度影响，许多物种边界与合并古岛屿的接触点一致。Lin-1和Lin-2眼镜猴的相对分布暗示岛上多次扩散事件和分布区扩张。虽然三个Lin-2物种共同占据苏拉威西中部和西南部的连续分布区，Lin-1物种占据北部和东南部半岛的不连续分布区，导致被Lin-2分布区二分的分离分布。虽然模型不能得出结论，Lin-1可能在苏拉威西中部被Lin-2个体替代之前占据连续分布区。除非常狭窄的杂交区外，物种分布区不重叠；二分将因此导致显著的基因流屏障。

ARE分析表明东眼镜猴在上新世至更新世从苏拉威西中部扩展其分布区。整合古地理图层约束了眼镜猴在上新世—更新世多样化期间可能占据的可用陆块。因此，推断的眼镜猴多样化起源于苏拉威西中西部与先前关于眼镜猴从原爪哇扩散并向北以连续波次扩散的假说相矛盾。东眼镜猴的分布区扩张和多样化序列与Frantz et al.（2018）提出的假说一致，即上新世—更新世陆面积增加导致现存物种从苏拉威西中部开始扩张。虽然眼镜猴初始定殖苏拉威西的路线仍未知，但当树以T. pumilus为根时，建模的祖先分布区暗示跨望加锡海峡的扩散，并与其他类群的这一推测扩散路线一致。东眼镜猴的分布区扩张在分析中被建模为既跨越水域也跨越新形成的连续陆块。推断的生物地理历史表明，陆块之间较短的距离可能是分布区扩张所必需的，无论是跨水域还是通过短暂未描述的陆桥。尽管跨水域距离减小，Lin-1向北和Lin-2向东南的扩散均被建模为发生在半岛估计与苏拉威西中部连接之前，因此指向跨水域扩散及此后有限的基因流。灵长类通过漂浮碎片筏运跨水域扩散已被假设，并且是眼镜猴谱系在苏拉威西邻近岛屿上建立的可能机制。此外，许多眼镜猴谱系的更新世多样化也与全球海平面振荡时期同时发生。这一时期苏拉威西陆面积的波动可能是驱动观察到的Tarsius谱系多样化的机制，也可能允许苏拉威西主岛各部分及其周围一些岛屿之间的连接。根据生物地理分析，东眼镜猴在苏拉威西中西部至少分化两次：第一次是T. pumilus从低地眼镜猴分裂，第二次是T. lariang从Lin-2其余部分分裂。导致这些物种形成事件的机制仍不清楚。然而，热年代学数据强调该区域经历了延伸至中上新世的变质事件。此外，苏拉威西中西部山峰在上新世—更新世持续浮现，加上更新世海平面波动，可能以研究人员建模无法考虑的方式构建了苏拉威西中西部眼镜猴的分布区。这些高山脉的持续存在以及动态构造过程被讨论为潜在促物种形成因素，Draco walkeri中也有类似模式。苏拉威西中西部的更精细尺度分析也可能阐明Lariang河或Palu河/Palu-Koro断裂等特征的作用，后者代表T. lariang和T. dentatus之间的当代边界。约1.6 Ma的海平面低水位期与T. lariang和[T. dentatus+T. fuscus]支系的分裂同时发生，已被假设为Lin-2多样化的触发因素。

关于建模，概率建模的进步连同测序技术的进步和精细古地理重建，使得首次基于模型的眼镜猴系统地理学方法成为可能。研究人员在建模东眼镜猴祖先分布区时识别了两个主要不确定性领域：（i）鉴于缺乏化石主要校准点，Tarsius谱系在苏拉威西多样化的估计时间；（ii）新近纪苏拉威西主岛各 subdivision 之间连通性的估计。使用二次校准点是当主要校准点不可用时的成熟实践。然而，二次校准系统发育通常复合分化估计的不确定性，并可能掩盖分化时间估计的固有方差。研究人员通过使用两棵时间校准树和两个扩散矩阵重复分析来试图解决这些不确定性。尽管由此产生的生物地理分析在进化事件序列上大体一致，但时间取决于 underlying 时间校准。Tarsius初始分裂为Lin-1和Lin-2被建模为发生在上新世（3.3 Ma）或更新世（2.2 Ma），取决于时间校准。此外，尽管研究人员试图考虑原苏拉威西群岛水域的未知渗透性，但产生的模型在事件时间上略有差异。然而，在所有模型中，研究人员发现强支持苏拉威西眼镜猴的丰富多样性源于它们从初始中西部分布区扩张，随后在上新世至更新世发生连续多样化事件。苏拉威西详细时空图层的可用性通过允许将古地理信息纳入陆生类群祖先分布区重建，改善了该岛生物多样性的研究。因此，尽管结果在不同假设下稳健，但研究人员注意到关于眼镜猴跨水域扩散能力、苏拉威西眼镜猴化石信息以及更精细尺度古地理图层的进一步信息都将改善生物地理推断的精确性。研究人员认为未来研究应旨在纳入苏拉威西周围小岛上眼镜猴的样本。岛屿—大陆谱系对可以为其个体物种身份提供信息，并集体阐明眼镜猴生物地理学的若干未知问题。它们也可能有助于阐明眼镜猴穿越半渗透屏障的机制，无论是通过短暂陆桥还是短距离水域。

**结论翻译**：东眼镜猴是研究岛屿和群岛系统中多样化过程如何与过去地理过程相关的理想系统。眼镜猴相对较近的多样化与苏拉威西发生的剧烈地质变化相协调，为物种如何在岛屿上进化提供了更广泛的见解。本研究支持东眼镜猴在隔离中建立若干谱系的观点，这些谱系随后建立了与非姐妹同属物种次生接触一致的生物地理模式。这证明了眼镜猴在未来种群动态和分布区进化研究中的效用。苏拉威西的人为开发和森林砍伐是东眼镜猴的关键威胁，对苏拉威西某些地区的影响不成比例地大于其他地区。与此相关，IUCN将所有东眼镜猴物种列为易危、濒危或极危，但T. lariang除外，其被列为数据缺乏。然而，这一评估未考虑其遗传多样性。东眼镜猴的进一步遗传表征对其全面评估至关重要，因此对其保护也至关重要。对眼镜猴物种身份和人为开发程度的知情考虑将为眼镜猴可能受森林砍伐或其他种群威胁影响最大的地区提供信息。