《Communications Biology》：Transcriptomic biomarkers reveal jasmonic and salicylic acid states under field herbivory in Arabidopsis thaliana
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植物通过水杨酸（SA）与茉莉酸（JA）信号通路之间的交叉对话协调对病原体和植食性昆虫的防御。然而，植物在复杂田间环境中如何整合植物激素浓度谱以塑造防御状态尚知之甚少。本研究表明，在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中系统改变SA与JA的组合浓度
植物通过水杨酸（SA）与茉莉酸（JA）信号通路之间的交叉对话协调对病原体和植食性昆虫的防御。然而，植物在复杂田间环境中如何整合植物激素浓度谱以塑造防御状态尚知之甚少。本研究表明，在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中系统改变SA与JA的组合浓度，可揭示超越SA–JA拮抗作用的43种组合特异性转录特征。利用这些数据，研究人员开发并验证了基于机器学习的转录组生物标志物，可从基因表达数据中独立测量SA和JA响应状态。将这些生物标志物应用于田间生长的拟南芥表明，SA/JA响应状态与单株植物上植食性昆虫的丰度及共现模式相关。本研究提供了一种从田间转录组解码植物对生物环境激素响应的策略，弥合了分子信号与生态动态之间的差距。
**研究背景与问题**：自然环境中植物面临植食性昆虫和病原体等多样攻击者的群落，需动态整合胁迫信号以优化防御策略。水杨酸（SA）与茉莉酸（JA）信号通路之间的互作长期被描述为相互拮抗：SA促进对活体营养型病原体的抗性，而JA介导对昆虫和死体营养型病原体的防御，在十字花科中部分通过硫代葡萄糖苷（GSL）类抗虫代谢物实现。遗传学和药理学研究表明，SA–JA交叉对话可表现为拮抗、协同或加性关系，取决于激素剂量和时序。然而，目前仍缺乏对SA–JA互作景观的高分辨率定量描述。植物对多样生物胁迫的SA/JA响应本质上是情境依赖且高度动态的，SA和JA状态不仅在不同物种和基因型间变化，而且在单一植物–植食性昆虫互作过程的不同生活史阶段内也会变化。例如在拟南芥中，菜粉蝶（Pieris rapae）产卵诱导SA依赖性防御，而孵化幼虫取食随后触发JA依赖性响应。SA和JA信号不仅受宿主调控，还被病原体、植食性昆虫及相关生物主动操纵。自然环境中多样植食性昆虫群落的 simultaneous 或序贯攻击驱动了远超单一攻击者实验所能模拟的SA/JA平衡及下游防御输出的多样化。因此，开发量化SA/JA信号水平的稳健方法对于弥合实验室与田间条件之间的差距至关重要。为此，必须纳入受SA–JA交叉对话影响的多基因标记。为量化植物对多样SA/JA平衡的响应，使用广泛SA和JA浓度组合的系统转录组分析至关重要，这对全面绘制这些通路间的拮抗、协同和剂量依赖性互作十分关键。然而，由于需要大规模RNA-seq实验，系统分析各种SA和JA浓度组合具有挑战性。为此，许多研究人员开发了高通量RNA-seq文库制备方法。例如，研究人员此前开发了一种低成本且简便的RNA-seq方法，命名为Lasy-seq，该方法已应用于多种环境输入下转录组响应的系统测量，但尚未应用于激素处理和生物胁迫。
**研究开展与结论**：在本研究中，为定量分析田间复杂生物条件下植物SA和JA响应状态如何变化，研究人员生成了拟南芥幼苗对64种SA和JA浓度组合响应的转录组谱，并衍生了量化SA和JA响应状态的转录组生物标志物。研究人员将这些生物标志物应用于日本大津和瑞士苏黎世不同田间生长的2381株拟南芥的田间转录组。将这些估计的响应状态与植食性昆虫普查数据整合，揭示SA/JA响应状态与单株植物上主要植食性昆虫的丰度和共现模式相关。研究结果提供了将分子防御信号与自然环境中植物–植食性昆虫互作联系起来的框架。
**关键技术方法**：研究人员采用96孔板系统对拟南芥幼苗进行64种SA/JA浓度组合处理6小时，通过Lasy-seq方法构建RNA-seq文库并进行测序，获得370个合格样本、12,963个表达基因的数据。利用基于标准差比值的筛选鉴定3001个SA/JA响应基因，采用亲和传播聚类（affinity propagation clustering）鉴定43个基因簇，通过线性模型和广义加性模型（GAM）分析基因表达的线性和非线性响应，利用MEME Suite的SEA工具进行转录因子结合基序富集分析，并采用LASSO回归和深度神经网络（DNN）构建转录组生物标志物，最终将生物标志物应用于田间转录组数据集（大津1195样本、苏黎世1186样本）及多个公共RNA-seq数据集。
**研究结果**：
**高通量RNA-seq揭示的SA/JA响应表达地形图**：通过对64种SA/JA浓度组合处理6小时的拟南芥幼苗进行转录组分析，主成分分析（PCA）显示第一主成分（解释19.3%方差）与SA处理浓度协调，第二主成分（解释6.7%方差）与JA处理浓度协调。SA和JA的差异表达基因数呈剂量依赖性增加。表达地形图分析显示，SA响应标记基因PR1在0.033 mM SA处出现表达阈值，最适浓度为0.33 mM，在1 mM JA下完全抑制；JA响应标记基因VSP1在0.001 mM JA处出现阈值，最适浓度为0.1 mM，在SA条件下降低。JA代谢相关基因LOX3表达随JA浓度依赖性增加至0.33 mM，但在1 mM SA和/或JA处理下显著降低；CYP94B3在1 mM JA存在下于0至1 mM SA间表达增加4.6倍。线性模型分析表明8,387个基因（64.7%）可由线性模型解释，而广义加性模型对7,699个基因（59.4%）显著改善模型拟合，表明非线性特征广泛存在。
**SA/JA浓度表达地形图的多样功能响应**：对3001个SA/JA响应基因进行亲和传播聚类，鉴定出43个具有特定SA/JA浓度依赖性调控模式的基因簇，并层次聚合为A–H八个高阶组。组F最大，含1435个基因（47.8%），在未处理条件下高基础表达但被高浓度SA和JA抑制；组B第二，含382个基因（12.7%），低基础表达但被两种激素高浓度诱导。簇A-02显示JA依赖性激活，在中等SA和JA浓度处达峰，高SA浓度下减弱；簇C-01显示SA依赖性激活和JA依赖性抑制。基序富集分析显示，簇A-02和E-03富集GT3a型三螺旋基序，簇C-01富集TGA类bZIP基序。GO富集分析表明14个簇显著富集1至23个生物学过程GO术语。簇A-02和E-03富集"对茉莉酸响应"（GO:0009753），簇C-01和H-03富集"对水杨酸响应"（GO:0009751），其中C-01含PR1并富集"对细菌响应"（GO:0009617），H-03含PAD4、NUDT6和BRN1并富集"对昆虫响应"（GO:0009625）。此外，吲哚型和脂肪族GSL核心结构生物合成基因在不同JA浓度下诱导，低SA条件下吲哚GSL生物合成基因的表达峰值约在0.1 mM JA，而脂肪族GSL生物合成基因约在0.003 mM JA，前者JA敏感性约为后者的30倍。
**多基因需用于解释SA/JA响应**：PR1与SA/JA处理浓度的相关系数分别为0.59和?0.30，VSP1与SA/JA的相关系数分别为?0.20和0.05。AT1G53540与SA处理浓度正相关最高（r=0.72），PR4与SA负相关最高（r=?0.79），AT2G47950与JA正相关最高（r=0.82），AT4G00165与JA负相关最高（r=?0.74）。这些基因在特定阈值水平响应SA/JA，表明单基因表达水平不足以作为预测定量植物激素水平的标记，促使研究人员开发使用多基因的定量响应标记。
**SA/JA响应状态转录组生物标志物的开发**：研究人员评估了基于多基因表达谱的多种回归策略，包括LASSO模型和DNN模型。DNN模型预测误差大于LASSO模型，单任务LASSO模型误差小于多任务LASSO模型。最终采用单任务LASSO模型组合方法，分别构建SA和JA的预测模型。所得生物标志物在独立测试数据集中表现出高预测精度，SA和JA的预测浓度与实际处理浓度之间的相关系数分别为0.96和0.97，超过最佳相关单基因。生物标志物具有高特异性，预测的SA和JA浓度之间弱相关（r=?0.05），反之亦然（r=0.10）。基因选择频率分析显示，JA生物标志物的主要贡献基因（选择频率>0.95）有140个，包括JAZ1、JAZ2、JAZ3、JAZ5、JAZ6和LOX2等经典信号组分；SA生物标志物的主要贡献基因有95个，包括ZAR1、WRKY18、WRKY70、ROXY18、ECS1和ARR4等已知SA响应基因。
**SA/JA转录组生物标志物在多样生物学背景中的验证**：应用于npr3/4双突变体（npr3-1npr4-3和npr3-2npr4-2）显示，除1 mM SA外，所有SA处理条件下突变体的预测SA响应状态显著高于Col-0，表明NPR3/4在外部SA浓度低于1 mM时抑制SA响应。应用于六个已发表的转录组数据集显示，短期（≤6小时）SA、MeJA和冠菌素（COR）处理选择性增加相应响应；昆虫和病原体攻击产生与已知SA/JA响应一致的偏移；菜粉蝶产卵处理中SA响应推断为高，取食处理中JA响应推断为高，产卵和取食联合处理中SA和JA响应均升高；JA和SA处理下响应状态在约2小时达最高水平，JA响应状态在JA处理后7小时下降，而SA响应状态在SA处理后约7小时起持续保持高位。5 μM COR喷雾处理使JA响应状态偏移至约100 μM JA诱导的可比水平。这些分析表明转录组生物标志物能够在多样生物学背景中单独评估植物SA和JA响应状态。
**生物标志物在田间植食性胁迫转录组数据集中的应用**：将生物标志物应用于包含2381株拟南芥个体及其昆虫群落的田间数据（大津1195样本，苏黎世1186样本）。在苏黎世，SA和JA响应不相关，而在大津检测到显著正相关。苏黎世主要植食性昆虫为小菜蛾（Px）和跳甲（Ps和Pa），大津为菜粉蝶（Pr）和Px。在苏黎世，Px和甘蓝蚜（Bb）个体数与JA响应正相关、与SA响应负相关；Pa和Ps与SA响应正相关、与JA响应负相关。在大津，菜粉蝶卵（Pr_e）和幼虫（Pr_l）均与SA和JA响应正相关。LASSO回归显示，苏黎世Px对两种激素响应影响最强（SA β=?0.38，JA β=1.12），Bb为JA响应的预测因子（β=0.43），Pa为SA响应唯一正系数（β=0.15）；大津Pr_e和Pr_l分别为SA（β=0.60）和JA（β=0.38）响应的最强预测因子，表明同一物种内生活史阶段特异性特征。植食性昆虫共现网络分析显示，LASSO选择的物种占据其各自网络的中心位置，苏黎世Pa和Px显著负相关（r=?0.25），大津网络凝聚力强，Pr_e和Pr_l强共现（r=0.59）。
**讨论与结论**：本研究结合组合植物激素处理与大规模转录组学的系统方法为SA/JA响应提供了定量证据，扩展了此前SA/JA共处理实验中观察到的拮抗和协同调控。组B和F为协同上调或下调基因的两个最大组，合计占SA/JA响应基因的半数以上。在全基因组一致响应的背景下，研究人员解析了43种不同的表达地形图，包括SA或JA主导响应、拮抗、加性和协同互作，以及仅在特定SA和JA浓度组合下出现的非线性响应。即使细微不同的表达地形图也与不同生物学功能相关，表明SA–JA交叉对话包括广泛的协调响应和基因特异性诱导或抑制，随SA和JA的浓度和组合而变化。GSL核心结构生物合成基因的研究发现，低SA条件下吲哚和脂肪族GSL核心结构生物合成基因的转录峰值JA浓度相差约30倍，鉴于高JA积累是伤口部位的特征而较低JA水平通常见于系统组织，这种不同的转录最优值可能有助于与JA积累相关的防御策略。转录组生物标志物为跨多样背景预测SA/JA响应状态提供了稳健框架，与植物激素定量互补使用将有助于阐明测量水平与响应状态之间差异的机制。田间转录组数据揭示了与群落组成相关的更复杂现实，两个田间站点SA和JA平衡不同，与昆虫群落组成显著差异一致。大津站点Pr丰富，其产卵和幼虫取食分别已知诱导SA和JA介导的防御响应，这种同时诱导可能解释大津站点SA和JA正相关的原因；苏黎世站点Pa和Px丰富，Pa可在邻近植物间跳跃取食叶片，可能与植物SA响应状态相关。整合转录组生物标志物与植食性昆虫数据提供了关于植物–植食性昆虫关系的可检验假设。总之，研究结果强调了结合转录组学和植食性昆虫群落数据理解复杂田间环境中植物激素对复杂生物胁迫响应的效用，通过将本研究中开发的转录组生物标志物与田间转录组学整合并考虑物理环境因素，将深化对真实环境中植物防御响应与气象因子之间互作的理解。
**研究结论翻译**：本研究通过系统组合植物激素处理与大规模转录组学，为SA/JA响应提供了定量证据。研究结果扩展了此前SA/JA共处理实验中观察到的拮抗和协同调控。在全基因组一致响应的背景下，解析了43种不同的表达地形图，包括SA或JA主导响应、拮抗、加性和协同互作以及非线性响应。转录组生物标志物为跨多样背景预测SA/JA响应状态提供了稳健框架。田间转录组数据揭示了与群落组成相关的更复杂现实，两个田间站点SA和JA平衡不同，与昆虫群落组成显著差异一致。整合转录组生物标志物与植食性昆虫数据提供了关于植物–植食性昆虫关系的可检验假设。研究结果强调了结合转录组学和植食性昆虫群落数据理解复杂田间环境中植物激素对复杂生物胁迫响应的效用。
