通过生物活性生物材料与生物制造在血管化心脏移植物中构建功能性灌注

《Materials Today Bio》：Engineering functional perfusion in vascularized cardiac grafts through bioactive biomaterials and biofabrication

　　

功能性灌注而非单纯的血管化决定移植物的成功。生物活性生物材料与血流线索驱动血管成熟。细胞组成与生物制造调控移植物整合。临床转化需要成熟的hiPSC来源细胞与可重复的制造工艺。1. 引言功能性心脏移植物的开发仍然是心脏组织工程领域的重大挑战。尽管工程化心脏组织（ECTs）能够重现心肌的某些结构与收缩特征，但其临床转化受到血管化不足、移植物存活率低以及与宿主循环整合不完全的限制。由于氧气和营养物质的扩散距离有限，厚层心脏构建体需要稳定且可灌注的血管网络以维持长期活力和功能。血管化心脏移植物旨在通过将心肌细胞（CMs）、内皮细胞（ECs）和支持性基质细胞群体整合于仿生基质中来应对这一限制，从而促进组织排列、血管网络形成以及宿主-移植物吻合。然而，仅形成血管结构不足以确保移植物的功能性。工程化血管网络最终必须支持持续灌注、适应生理血流动力学力并与宿主循环整合，这是该领域尚未解决的主要挑战。在此背景下，血管化不仅是支持性特征，更是移植物性能的核心决定因素，影响细胞存活、炎症、重塑、灌注和功能成熟。因此，越来越多的关注已从生成血管化构建体转向工程化具有功能性可灌注能力并能够实现长期生理整合的血管系统。在这一转变中，生物材料不应被视为被动结构支撑，而应被视为调控细胞黏附、内皮屏障形成、基质重塑、炎症反应以及血管和心肌组分成熟的生物活性微环境。重要的是，这些血管需求必须与CM组织和收缩相平衡，以使材料选择同时支持血管和心肌功能。干细胞生物学、生物材料、生物打印、灌注系统和临床前建模的最新进展拓展了血管化心脏移植物的设计空间。然而，生成同时具备收缩性、可灌注性、机械稳定性和长期整合能力的构建体仍未被解决。由于各项研究通常评估血管结构和功能的不同方面，使得血管化结果的直接比较具有挑战性，其评估进一步复杂化。本综述讨论了用于工程化血管化心脏移植物的细胞、生物制造、灌注和临床前策略，特别关注从结构性血管化向功能性灌注的转变。研究人员认为，建立稳定、可灌注且血流动力学整合的血管网络的能力是ECTs临床转化的核心前提。2. 心脏移植物中的功能性血管系统功能性血管网络是ECTs的先决条件，因为仅靠扩散无法维持临床相关的组织厚度。除氧气输送外，血管系统还调控炎症、重塑和组织稳态，这些功能在代谢需求高且扩散极限迅速被超越的心脏移植物中尤为关键。因此，血管功能可从三个互补层面加以考量：存在相互连接、有管腔的血管结构；通过这些结构实现有效的运输和灌注；以及由此维持心肌活力和功能。与未血管化对照相比，预血管化构建体表现出改善的存活、宿主整合和功能结局，这主要归因于预制血管网络能够促进植入后快速的宿主-移植物吻合和早期灌注。更新的人源细胞研究进一步证明，体外血管化增强了体内功能。同样，将预形成的微血管片段整合到工程化构建体中已被证明可加速血管整合并改善植入后的移植物存活。总之，这些发现确定功能性血管系统是心脏移植物性能的关键决定因素。重要的是，仅内皮组织化的证据不应被解释为功能性灌注的证据。内皮染色可以证明血管组织化，而灌注示踪剂、血流成像或相关运输测量则是建立功能性循环通路所必需的。3. 血管化心脏移植物的细胞组成工程化血管化心脏移植物需要精确控制细胞组成，因为组织功能源于CMs、血管细胞和支持性群体之间的协调相互作用。尽管CMs占据大部分心肌体积，但非心肌细胞群体在细胞数量上占主导，凸显了多细胞组织化在工程化组织中的重要性。心肌细胞决定移植物的收缩身份，ECs建立血管网络，而其他支持细胞如成纤维细胞、周细胞或平滑肌细胞（SMCs）则贡献于组织排列和结构稳定性。3.1. 心肌细胞作为功能核心心肌细胞是血管化心脏构建体的功能核心。它们最常来源于人诱导多能干细胞（hiPSCs）、人胚胎干细胞（hESCs），替代来源包括原代新生CMs。永生化细胞系如H9C2、HL-1和AC16广泛用于简化的体外系统，但缺乏生成功能性心脏移植物所需的结构、电生理和收缩特性。hiPSC来源心肌细胞（hiPSC-CMs）的广泛使用源于通过定义转录因子（OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC）将体细胞重编程为多能细胞的能力，使得能够生成保留供体遗传背景的患者特异性CMs。该方法促进了同基因模型的开发，其中遗传变异可在匹配背景中引入或纠正以分离其功能效应。尽管具有这些优势，与成年CMs相比，hiPSC-CMs在结构和功能上仍不成熟，在收缩强度、电生理特性和代谢成熟方面存在局限。原代CMs保留成熟的生理特征，但受限于可用性有限、供体变异性和体外长期存活差。重要的是，细胞不成熟仍然是血管化心脏移植物开发的主要瓶颈，因为未成熟CMs可能无法对发育中的血管网络提供的生物力学和代谢线索作出适当响应。因此，改善CM成熟可能与改善血管化本身同样重要。然而，目前可用的成熟策略具有重要局限性。延长培养可改善结构和电生理成熟但耗时，而生化和代谢调理可能改善CM表型的特定方面而无法完全重现成年样状态。电和机械刺激可增强结构和功能成熟但需要额外技术基础设施和仔细优化刺激条件。同样，3D组织工程方法为CM成熟提供生理相关环境但增加实验复杂性并可能对标准化和放大提出挑战。总体而言，没有单一方法能完全重现成人CMs的复杂结构、电生理、代谢和收缩表型，突出表明需要在成熟效力与可重复性和转化可行性之间取得平衡。除心肌细胞成熟相关挑战外，基于hiPSC的心脏移植物还面临额外的细胞来源和安全性限制。分化效率和功能表型可能因hiPSC系和生产批次而异，而与重编程和长期培养相关的遗传和表观遗传改变可能损害产品一致性。残留的未分化多能细胞可能在植入后构成畸胎瘤形成风险，强调需要灵敏的检测方法、纯化策略和基因组稳定性测试。此外，自体hiPSC来源产品涉及漫长且昂贵的患者特异性制造，而异体方法提供更大的可扩展性但需要适当的免疫相容性策略。这些挑战凸显了标准化分化方案、全面质量控制和明确的临床转化放行标准的重要性。3.2. 内皮细胞与血管网络形成内皮细胞构成血管化心脏移植物的核心组分，形成组织灌注所需的微血管网络。常用的细胞群体包括人脐静脉内皮细胞（HUVECs）、hiPSC-ECs、hESC-ECs和内皮祖细胞。内皮异质性和组织特异性身份日益被认为是血管稳定性和功能的关键决定因素，因为源自不同血管床的ECs表现出不同的表型和功能特性。除形成被动的血管衬里外，ECs还通过旁分泌信号积极调控心肌细胞存活、排列、代谢重塑和成熟。因此，共培养系统更紧密地重现天然心肌组织化，并与改善的结构和功能结局相关。因此，内皮来源的选择应同时考虑网络形成能力和预期应用所需的内皮表型。特别是，不应假设使用常用HUVECs获得的结果能重现心脏微血管内皮的所有特性。然而，重现天然冠状动脉血管系统的层级组织仍是ECTs中的重大挑战。此外，内皮网络的存在并不保证功能性灌注，强调需要在移植物评估中区分血管结构与血管功能。因此，一个有用的设计目标是形成管腔、募集支持细胞并在预期流动条件下维持适当屏障的内皮网络。预血管化策略利用ECs在植入前自组装成相互连接的有管腔网络的能力，从而促进与宿主血管系统的快速吻合和后续灌注。这在较厚的构建体中尤为关键，因为氧气和营养物质的扩散仅限于距最近血管几百微米（约100-200 μm）范围内，使得主动灌注或预血管化成为维持中心细胞活力所必需。除内皮自组装外，整合预形成的微血管片段或微血管网络支持组分提供了加速心脏构建体内血管组织化的替代策略。最近使用3D生物打印人iPSC来源心脏构建体的工作表明，微血管网络支持可改善体内移植物存活，凸显了引入预组织血管元件而非仅依赖从头内皮网络形成的价值。3.3. 稳定移植物的支持细胞支持细胞群体如心脏成纤维细胞（CFs）、周细胞和SMCs对ECTs的结构和功能成熟至关重要。心脏成纤维细胞调控细胞外基质（ECM）沉积和重塑，从而贡献于组织排列、机械稳定性和力传递。此外，成纤维细胞来源的旁分泌信号调节CMs增殖、排列和电生理成熟。血管壁细胞，包括周细胞和SMCs，在血管稳定和成熟中发挥关键作用。尽管ECs启动血管网络形成，但仅有内皮的血管本质上不稳定且易于退化。壁细胞的募集促进血管稳定、调节血管张力并使得能够形成功能性可灌注微血管系统。重要的是，壁细胞的作用应结合目标血管结构来考虑：周细胞主要支持微血管网络，而SMCs特别与较大血管壁相关。因此，内皮和壁细胞之间的协调相互作用是建立层级血管组织和长期稳定性所必需的。相应地，整合CMs、ECs和支持性群体的多细胞共培养系统更紧密地重现天然心脏微环境，增强组织成熟、血管稳定性和整体移植物功能。4. 血管化心脏移植物的生物打印策略4.1. 血管化心脏移植物工程的生物制造原理传统合成血管移植物，如膨体聚四氟乙烯（ePTFE）和聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET；Dacron），在临床实践中仍广泛使用，但无法重现天然心血管组织的动态、机电活性微环境和层级结构。这些局限性在小直径血管移植物（SDVGs；<6 mm）中尤为明显，其中血栓形成、内膜增生和感染显著损害长期通畅性。临床相关血管化心脏移植物的制造进一步受到质量运输限制的约束。虽然薄构建体可通过扩散维持，但较厚组织需要整合的可灌注血管网络以确保足够的氧气和营养输送。因此，生物制造策略日益聚焦于生成具有内在血管结构的构建体，要么通过直接打印血管通道，要么通过实现制造后内皮化和重塑。为应对这些血管化需求，生物制造策略可大致分为支架支持和无支架方法，各自在建立ECTs功能性血管网络方面具有不同的优势和局限性。支架支持策略提供结构稳定性和对组织结构的更大控制，使得能够空间组织ECs并整合可支持直接灌注的预定义互连通道。此外，支架特性包括刚度、孔隙率和降解动力学可被定制以影响内皮组织和血管重塑。然而，外源性生物材料的存在可能限制细胞重塑并引入材料依赖性炎症或降解相关反应。相比之下，无支架方法包括细胞片、球体和自组装微组织，主要依赖细胞-细胞相互作用和内源性细胞外基质沉积，促进内皮自组织和微血管网络形成。然而，仅形成血管样网络并不确保功能性灌注。在hiPSC来源心脏微组织中，与灌注微流体血管腔室的整合促进了内部和外部微血管网络之间的流动依赖性吻合，说明了建立血管连接和流动对功能性血管化的重要性。无支架方法对血管几何形状的控制也较少，通常缺乏预定义灌注路径。在较大或较厚构建体中，功能性灌注的延迟建立可能额外导致扩散限制和中心缺氧。因此，支架支持方法主要提供结构控制和工程化灌注，而无支架系统有利于生物自组织和重塑。结合这些互补特征可能最终是在临床相关心脏移植物中建立稳定功能性血管网络所必需的。生物打印已成为关键使能技术，允许以逐层方式空间控制沉积细胞和生物材料（生物墨水）以生成具有定义结构和功能的3D构建体。通过实现对细胞组织和基质组成的精确控制，生物打印促进移植物存活和成熟所需的多细胞结构和早期血管网络的形成。根据所选策略，生物打印可生成预定义通道模板、沉积内皮和支持细胞或空间定位预形成组织单元以进行后续血管重塑。最近的方法表明，将微血管片段整合到生物打印心脏构建体中促进快速体内血管化和宿主-移植物吻合，改善移植物存活和CMs成熟，同时允许对血管元件初始分布的空间控制。液滴基、挤出基和激光辅助生物打印在分辨率、通量、可打印性和细胞负载材料相容性之间提供不同权衡。这些方法根据血管直径、结构复杂性、细胞组成和机械需求为工程化血管化构建体提供互补能力。挤出基生物打印与广泛的天然和合成生物墨水相容并能沉积高细胞密度；然而，其分辨率和挤出诱导的剪切应力可能限制细胞活力和层级血管网络的制造。此外，传统挤出打印在跨多个长度尺度重现互连血管网络方面仍具挑战性。同轴生物打印通过使得能够直接制造明确的可灌注管状结构扩展了挤出基方法，但不太适合重现高度分支和互连的微血管网络。牺牲模板化使得能够生成具有受控几何形状的互连可灌注通道；然而，模板去除和复杂多尺度血管结构的制造仍然具有挑战性。重要的是，通道的制造本身并不建立血管功能性，同轴或牺牲生成的结构通常需要后续内皮化和重塑以发展功能性血管界面。除这些挤出基和模板化方法外，激光辅助生物打印提供高分辨率、无喷嘴细胞沉积，减少剪切应力和精确空间控制，尽管其复杂性、有限的可扩展性和相对较低的通量可能限制其在大组织构建体中的应用。容积生物打印正在成为制造具有复杂内部结构的软性细胞负载水凝胶构建体的补充途径。在断层容积打印中，构建体通过投影光图案而非顺序丝状沉积在整个树脂体积内生成，允许在数秒至数分钟内形成厘米级水凝胶结构同时避免喷嘴相关剪切。这一特征对血管化心脏移植物尤为重要，因为延长打印时间、层间界面和剪切暴露可能损害细胞活力或精细通道网络的连续性。然而，目前容积生物打印用于可灌注心脏移植物仍处于早期阶段。重要限制包括需要光学透明和细胞相容的生物树脂、控制光散射和过度固化、打印后保持开放灌注通道以及长期培养期间软水凝胶的机械稳定化。重要的是，成功制造开放通道本身不应被解释为内皮化、长期可灌注性或血管整合的证据。因此，容积方法应被视为挤出、牺牲或同轴生物打印的补充而非替代，作为更广泛生物制造工具箱的一部分，用于快速生成几何复杂的模板，随后可进行内皮化、增强或与灌注生物反应器整合。用于工程化血管化心脏移植物的主要细胞组分、生物活性材料输入和生物制造策略已总结。计算建模和人工智能（AI）正在成为血管化组织构建体设计和优化的补充工具。计算方法，特别是计算流体动力学（CFD），能够预测流动分布、压力梯度和壁面剪切应力，为制造前优化血管几何形状提供合理基础。最近，模型引导的血管网络生成结合CFD和3D生物打印使得能够快速设计器官规模可灌注血管结构，合成血管灌注改善工程化组织构建体中的细胞活力。计算建模还可支持患者特异性血管设计。Hayashi等人表明，磁共振成像（MRI）和4D-flow数据结合CFD已用于优化组织工程血管移植物（TEVG）几何形状并评估猪模型中植入后的血流动力学性能。基于AI的方法可能通过识别打印参数与所得血管结构之间的复杂关系进一步加速生物制造。例如，使用约束贝叶斯优化的机器学习辅助混合生物打印使得能够快速优化打印参数并制造具有低于10 μm毛细管级通道的层级血管网络。这些方法可能减少经验性试错并促进血管结构和制造参数的合理设计，尽管其在血管化心脏移植物中的更广泛应用将需要进一步的实验验证。最终，其与心脏移植物工程的相关性将不仅取决于几何或制造性能，还取决于对流动、细胞活力、内皮功能和组织收缩期间血管性能的实验验证。4.2. 血管移植物生物制造的生物材料和生物墨水有效的血管移植物工程生物墨水必须同时满足生物学和机械要求，包括生物相容性、可打印性、结构完整性和支持内皮化的能力。由于没有单一材料能满足所有这些标准，复合系统常被采用。对于血管化心脏移植物，材料的生物活性尤为重要，因为基质直接影响血管和心肌行为。黏附配体、蛋白酶敏感降解位点、固定化或释放的生长因子、基质刚度、粘弹性和微尺度结构可调控内皮附着、管腔形成、壁细胞募集、CMs排列和宿主细胞浸润。在此意义上，用于心脏移植物工程的生物墨水应不仅设计为维持打印形状，还应提供支持血管稳定和组织重塑的指导性生物线索。天然聚合物，如海藻酸盐、明胶、胶原、丝素蛋白、透明质酸、琼脂糖和壳聚糖，提供仿生环境，因其与ECM的相似性而支持细胞黏附和活力。然而，其有限的机械强度限制了在承重应用中的使用。相比之下，合成聚合物，包括聚己内酯（PCL）、聚(L-丙交酯-co-ε-己内酯)（PLCL）、聚乙二醇（PEG）和聚乳酸（PLA），提供优越的机械性能但通常缺乏内在生物活性。在混合系统中，甲基丙烯酰化明胶（GelMA）因其二价整合素结合RGD基序和可调交联特性而受到特别关注，使得能够精确控制细胞-基质相互作用和机械刚度。然而，基于GelMA的构建体通常需要用额外材料增强以确保长期结构稳定性并防止在生理条件下塌陷。这一局限性说明了生物活性水凝胶设计中的更广泛挑战：强烈支持细胞黏附和重塑的材料通常机械强度弱，而机械稳健的聚合物通常缺乏足够的生物指导性。因此，混合系统提供了解耦和重组关键功能的机会，包括内皮黏附性、降解动力学、弹性、血液相容性和灌注下抗变形性。这种多功能材料设计对血管化心脏移植物尤为重要，因为同一构建体必须支持CMs组织化、内皮网络成熟和长期暴露于动态机械负荷。对血管移植物生物制造生物材料设计策略的全面分析强调了整合机械稳健性与生物功能性的重要性。总体而言，生物材料选择代表了机械性能与生物功能性之间的基本权衡，复合生物墨水为工程化临床相关血管移植物提供了最有前景的策略。重要的是，设计需求随血管尺寸而变化，因为微血管、小直径移植物和大导管施加不同的结构和机械约束。4.3. 血管移植物的生物制造TEVGs的概念最早由Weinberg和Bell展示，他们在胶原基支架中用ECs、SMCs和成纤维细胞重建多层血管壁并用Dacron网增强。这一早期工作确立了体外复制血管结构的可行性，并为血管生物制造的后续进展奠定了基础。此后，血管生物制造策略从简单的多层支架发展到日益复杂的方法，包括牺牲生物打印、同轴挤出和无支架自组装。这些技术使得能够更大程度地控制管腔几何形状、细胞组织和血管分支，从而促进具有日益增加结构复杂性的可灌注构建体的生成。尽管取得了重大进展，实现与宿主组织整合并维持长期通畅的完全功能性血管移植物仍是重大挑战。当前方法旨在将仿生支架设计与受控细胞组织相结合以重现天然血管结构和功能。工程化血管移植物的设计需求强烈依赖于血管直径。虽然小直径移植物主要受血栓形成和内膜增生限制，大直径导管面临与机械稳定性、壁厚度和组织血管化相关的不同挑战。因此，这两类移植物需要不同的生物制造策略。4.4. 小直径血管移植物：挑战与新兴解决方案小直径血管移植物（SDVGs；<6 mm）代表心血管外科最紧迫的未满足需求之一，特别是用于冠状动脉旁路移植和外周动脉重建。与大口径合成导管不同，SDVGs由于合成材料与天然血管组织之间的生物力学和生化不匹配，仍然高度易受血栓形成、内膜增生和闭塞性重塑的影响。此外，当前可用的移植物无法随宿主生长和重塑，严重限制了其在儿科患者中的使用，通常需要终生多次手术修正。快速内皮化仍是SDVGs成功的关键决定因素，因为延迟的内皮覆盖促进血小板黏附、血栓形成和新生内膜增生，最终损害长期移植物通畅性。生物打印的最新进展已开始通过使得能够制造结构和功能仿生血管构建体来应对这些局限性。尽管许多概念验证研究集中在微血管级导管（约300 μm），这些系统为管腔形成、内皮化和灌注提供了有价值的见解，可能为临床相关SDVGs的未来开发提供信息。这些工程化导管支持内皮和平滑肌细胞存活、增殖和组织化，同时在受控流动条件下维持稳定灌注。然而，向临床相关动脉应用的转化仍然具有挑战性。生理动脉血流动力学使移植物暴露于连续搏动性血流、周期性应变和升高的腔内压力，需要开发结合长期机械耐久性与足够弹性和生物功能性的生物材料。整合源自hiPSCs的患者特异性血管细胞进一步增强工程化血管移植物的转化潜力。早期研究展示了在可生物降解聚合物支架内使用SMCs生成血管样组织，产生机械性能接近天然血管的构建体。最近，Murillo等人通过将hiPSC来源SMCs接种到涂有丝素蛋白的聚(L-乳酸)（PLLA）支架上开发了患者特异性血管移植物，产生具有类似中膜组织和与自体移植物相当的生物力学特征的构建体。丝素蛋白因其优异的生物相容性、可调生物降解谱和与富含β-折叠结构相关的稳健机械强度而成为特别有吸引力的生物材料。尽管取得了这些进展，若干障碍继续阻碍临床转化。hiPSC来源血管细胞的不成熟表型、供体间变异性和大规模制造挑战仍是重大障碍。此外，基于自体细胞的方法本质上耗时且昂贵，而异体替代方案引发关于免疫原性和长期相容性的担忧。额外的挑战来自当前生物制造技术的局限性，其中管腔几何形状、壁厚度或表面拓扑的微小偏差可深刻改变局部血流动力学并增加血栓激活风险。因此，长期体内评估对于建立移植物通畅性、机械稳定性、血管重塑和生物相容性仍然至关重要。尽管若干临床前研究报道了令人鼓舞的结果，植入期仍相对较短。重要的是，移植物失败很少由单一因素驱动。相反，血栓形成、内皮化不足、机械不匹配、不良免疫反应和不完全血管重塑协同作用以损害长期通畅性。因此，未来的移植物设计将需要同时解决血液相容性、生物力学和生物整合的综合解决方案。值得注意的是，Dell等人展示了生物打印SDVGs作为动脉替代物植入大鼠长达60天的功能性能，代表了迄今为止报道的最长体内评估之一。然而，在考虑临床实施之前，将需要在大动物模型中进行大幅更长时间的研究，因为成功转化取决于在临床相关解剖、血流动力学、生物力学和免疫条件下证明持久的移植物性能。4.5. 大直径血管移植物大直径血管移植物（LDVGs；>6 mm）常规用于替换主要动脉，包括主动脉及其主要分支。与SDVGs相比，当前可用的合成移植物如ePTFE和PET在高流量大口径血管中表现出可接受的长期性能，其中血栓闭塞风险大幅降低。然而，这些假体仍然生物惰性，缺乏生长、自我修复和生理重塑的能力，限制了其与宿主组织的长期整合。与LDVGs相关的挑战与SDVGs中遇到的根本不同。虽然小直径移植物主要因血栓形成、内皮化受损和内膜增生而失败，临床上合成大直径移植物由于高血流速率和降低的血栓风险已实现可接受的长期通畅性。然而，它们仍然生物惰性，缺乏生长和重塑的能力，限制了其与宿主组织的长期整合。从工程角度来看，LDVGs仍然相当苛刻，因为较厚的血管壁需要广泛的血管化和多细胞组织化。与天然血管不同，天然血管壁内具有内在微血管供应，工程化厚壁移植物最初主要依赖扩散进行氧气和营养运输。虽然实现足够机械强度以承受全身动脉压力至关重要，但增加壁厚度通常损害氧气和营养扩散，从而损害细胞存活和不完全组织成熟。LDVG生物制造必须解决生成厚实、机械稳健的血管壁以支持细胞活力，从而建立层级组织化组织、细胞外基质沉积和渐进性组织成熟，同时在动脉负荷下维持结构完整性。因此，在工程化移植物内建立功能性微血管网络已成为该领域的核心目标。包括整合ECs、周细胞、SMCs和成纤维细胞以及从可生物降解微球控释促血管生成因子的策略已显示出促进血管浸润、组织灌注和长期移植物活力的前景。除实现初始血管化外，未来LDVG策略将需要重现天然血管的层级组织，从大而可灌注的管腔到嵌入移植物壁内的密集微血管网络。在天然动脉中，这种多尺度组织对于协调宏观血液运输与局部组织维持至关重要，因为血管壁依赖内皮、平滑肌和基质区室之间由内在微血管供应支持的复杂相互作用。重现这种结构在工程化LDVGs中仍然特别具有挑战性，其中增加构建体厚度在机械增强和生物可及性之间产生根本冲突。虽然需要稳健的细胞外基质沉积和机械稳定性以承受动脉压力，但高效血管化对于维持细胞活力和实现渐进性组织成熟是必需的。新兴策略，包括多材料生物打印、牺牲模板化和无支架自组装，已开始通过使得能够更大程度地控制血管拓扑和细胞组织来应对这一挑战。然而，在工程化微血管网络与宿主循环之间实现稳定吻合，同时维持长期结构完整性和生理重塑，仍然是临床转化的关键障碍。5. 血流模式对内皮完整性和出芽的影响该领域的一个主要挑战是血管结构的存在不一定表明功能性灌注。许多工程化构建体含有形态上看似成熟但不能在植入后支持持续血流的 endothelial networks。因此，未来研究应越来越多地使用灌注、血管通畅性和血流动力学功能的定量评估来区分结构性血管化和功能性血管整合。内皮细胞形成连续单层，调节血管屏障功能并介导循环血液与底层组织之间的相互作用。尽管通常处于静止状态，ECs对生化 and 机械刺激迅速响应，包括炎症介质和血流动力学力如壁面剪切应力（WSS）、周期性拉伸和跨壁压力。这些线索调控内皮连接动力学，这对维持屏障完整性和协调血管生成重塑至关重要。血管生成是一个严格调控的过程，其中新血管从预先存在的血管系统通过内皮出芽产生。激活后，ECs通过血管内皮生长因子（VEGF）-Notch信号进行尖端-柄细胞特化。尖端细胞延伸丝状伪足并引导定向芽生长，而相邻柄细胞增殖、形成血管管腔并维持连接稳定性。这些角色保持动态，根据局部微环境信号在表型之间连续相互转换。随后的分支、吻合和壁细胞（包括周细胞和SMCs）募集稳定新生血管系统并建立功能性灌注。5.1. 内皮功能的血流动力学调控血流是内皮行为的中心调节因素，WSS作为血管稳态和血管生成活性的关键决定因素。ECs将机械刺激转导为调控基因表达、代谢和细胞表型的生化信号，从而协调血管张力、通透性、炎症和ECM重塑等过程。重要的是，内皮出芽和灌注是紧密耦合的过程：出芽生成新血管网络，而血流随后精炼和稳定它们。体内血流由于复杂血管几何形状而高度异质，导致空间变化的剪切应力模式差异性调控内皮和壁细胞行为。这些生物力学线索关键性地决定ECs是采用静止、稳定化表型还是促血管生成、激活状态。在生理层流条件下，特征为单向、高幅度剪切应力（约10-15 dyn cm-2），ECs表现出保护性表型，与排列、伸长和增强的细胞间连接相关。屏障完整性通过紧密和黏附连接的稳定化维持，包括调控occludin表达和VE-钙黏蛋白动力学。在分子水平，层流诱导Krüppel样因子2（KLF2）激活，其通过下调PFKFB3抑制糖酵解代谢，从而限制内皮增殖和出芽。同时上调的内皮一氧化氮合酶（eNOS）增强一氧化氮（NO）产生，减弱VEGF响应性并增强Notch信号。总之，这些机制促进血管稳定性并抑制过度血管生成活性，在稳定血管区域维持非出芽内皮状态。相比之下，在血管分支、弯曲和分叉处通常观察到的扰动或振荡流，特征为低和多方向剪切应力（<5-10 dyn cm-2），促进内皮功能障碍。这些条件损害糖萼完整性、破坏细胞骨架组织并削弱细胞-细胞连接，导致通透性增加和管腔形成延迟。在信号水平，扰动流与KLF2下调和促炎通路激活相关，包括核因子κB（NF-κB），以及由还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶介导的氧化应激增加。这种转变伴随内皮更新增强，由通过涉及p53下调和蛋白激酶B（AKT）信号抑制的机制同时增加增殖和凋亡驱动。在功能上，这些变化促进促血管生成表型，特征为VEGF信号增加、血管生成基因表达升高和过度或紊乱的出芽。虽然这些响应可能贡献于新生血管化，但通常导致不稳定或病理性血管网络。5.2. 机械转导与内皮感知内皮对流动的响应由涉及多个机械敏感结构的复杂机械转导通路介导。来自局部ECM的机械线索（包括刚度和拓扑）以及剪切应力、周期性拉伸和跨壁压力是内皮行为的公认调节因素。例如，跨壁流产生从血管管腔到周围细胞外空间的压力梯度，通过削弱内皮细胞-细胞黏附促进血管生成出芽。内皮细胞通过机械敏感结构网络感知这些机械力，包括糖萼、整合素和初级纤毛，以及G蛋白偶联受体（GPCRs）和血小板内皮细胞黏附分子-1（PECAM-1）/血管内皮钙黏蛋白（VE-cadherin）/血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）机械感觉复合物。此外，流动敏感离子通道，特别是Piezo型机械敏感离子通道1（Piezo1），在将机械刺激转导为细胞内信号级联中发挥核心作用。这些机械转导通路对工程化血管化移植物尤为重要，因为重现生理机械线索对维持内皮稳定性和功能至关重要。5.3. 血管化和功能性灌注的定量评估除血管结构的定性鉴定外，需要标准化定量标准来评估血管化并促进工程化心脏移植物（ECGs）之间的比较。结构性血管化可通过血管或管腔密度、毛细血管间距、血管体积或面积分数、血管直径和网络组织来表征，这些共同提供血管丰度、空间分布和成熟的信息。天然成人心肌表现出约2,000毛细血管/mm2的高毛细血管密度，平均毛细血管间距约20 μm。ECTs通常低于此生理血管密度。然而，植入后血管化可通过宿主血管长入、吻合和与预先存在的工程化血管网络整合而渐进性增加。重要的是，研究之间的直接比较仍然具有挑战性，因为血管化使用不同终点量化，包括血管或管腔密度、血管面积或体积分数、血管长度和直径以及灌注血管比例。重要的是，仅结构性血管化不能证明血管通畅或能够维持流动。功能性灌注需要流体或血液通过血管网络运输的直接证据，因此应使用互补的灌注、运输和屏障功能指标评估。关键定量参数包括流速、体积流量、灌注血管密度或灌注覆盖率、血管通透性和组织氧合。流速可使用荧光珠粒子追踪、光学微血管造影（OMAG）或多普勒技术量化，而体积灌注率提供通过构建体的流体输送测量。灌注血管密度或灌注血管面积百分比可进一步区分活跃灌注血管与非功能性血管结构。内皮屏障功能提供血管功能性的额外测量，可使用荧光示踪剂如定义分子量的葡聚糖评估。低示踪剂渗漏或通透性系数表明完整内皮屏障，而过量渗漏可能表明血管不稳定性。组织氧合可使用氧敏感探针或传感器和缺氧标志物评估。总之，这些测量可确定血管灌注是否提供有效对流运输并防止厚工程化构建体内缺氧区域的发展。功能性灌注随时间的稳定性同样重要。灌注稳定性可在体外数天至数周内通过监测持续流动、血管持续性和无闭塞来评估。相比之下，长期体内血管通畅性的主张需要适当延长和标准化的随访，包括评估宿主来源灌注、血管重塑、血栓形成和血管退化。植入后，功能性宿主整合可通过量化宿主-移植物血管连接、吻合以及存在与宿主循环连接的灌注或混合血管来额外评估。例如，Riemenschneider等人开发的对齐预血管化纤维蛋白补片在植入前含有940 ± 240微血管管腔/mm2，而植入梗死大鼠心脏六天后，173 ± 97人血管管腔/mm2被灌注，对应于移植物内人血管的40 ± 23%。这些观察强调植入前高密度血管结构不一定预测体内持续功能性灌注的程度。总之，这些互补的结构和功能读数使得能够全面评估工程化心脏移植物内的血管功能性。为支持研究之间更一致的比较，功能性血管化应使用分层的结构、灌注相关、屏障、血流动力学、宿主整合和组织水平功能读数报告。区分结构性血管化与功能性灌注和宿主整合血管功能性的拟议框架已总结。重要的是，这些读数不应被解释为通用强制检查清单。相反，它们定义了证据水平，允许研究指定其是否证明血管结构、体外可灌注性、宿主连接灌注、长期通畅性或整合心脏移植物功能。5.4. 灌注模型和生物反应器系统2D和3D灌注模型广泛用于在受控流动条件下模拟内皮屏障功能和出芽血管生成。在2D系统中，ECs通常作为单层培养在渗透膜或微流体通道内，通常由聚二甲基硅氧烷（PDMS）制造并涂有ECM蛋白。这些平台使得能够精确施加剪切应力并允许实时评估屏障完整性和流动介导的连接重塑。更复杂的心脏芯片系统越来越多地整合多种iPSC来源心脏细胞群体以更好地在受控微流体条件下重现旁分泌、收缩和血管相关响应。例如，结合iPSC来源心脏细胞的三培养平台已被开发用于预测性心脏毒性测试，说明血管化或血管相关心脏微生理系统如何通过使得能够受控评估组织响应、药物暴露和细胞-细胞相互作用来补充移植物导向研究。3D灌注模型将ECs嵌入ECM水凝胶如胶原或纤维蛋白中，在微流体装置或生物反应器中。这种方法使得能够形成有管腔的可灌注血管样结构，更紧密地重现体内血管结构和功能。包括支持细胞如周细胞进一步增强生理相关性，通过促进血管稳定和成熟。在管腔和跨壁流动条件下，这些系统重现血管形态发生的关键方面，包括内皮出芽、尖端细胞迁移、管腔形成和吻合，同时使得能够定量评估响应机械刺激的屏障功能。灌注生物反应器的选择取决于所需流动控制程度、构建体尺寸、实验通量和预期功能读数。重力驱动或摇摆平台系统提供相对简单和低成本灌注，设备需求最少但提供对流速、剪切应力和流动模式的有限控制。泵基系统，包括蠕动配置，使得能够更精确控制连续或搏动性流动并适合较大构建体的长期灌注，尽管其增加的机械复杂性和广泛管道可能引入额外技术挑战。相比之下，微流体和心脏芯片平台提供血管微环境的精确时空控制并特别适合实时成像和功能读数整合，但其向较大组织构建体的可扩展性仍然有限。总之，这些发现表明成功的血管化心脏移植物不仅需要生成血管结构，还需要重现能够促进长期血管成熟和稳定性的生理血流动力学环境。5.5. 血管与机电功能的整合功能性血管化仅代表成功心脏移植物整合的一个组成部分。为恢复心肌功能，工程化组织必须结合足够的氧气和营养输送与协调机械收缩和电信号传播。因此，血管灌注评估应与心脏功能读数整合而非视为孤立终点。微流体和灌注基心脏平台在此背景下特别有用，因为它们使得能够在受控流动同时整合评估血管屏障功能和心脏功能读数。在组织水平，机电功能性可通过收缩力或应力、传导速度、钙瞬变特征和其他兴奋-收缩耦合测量来评估。这些测量连同心脏特异性蛋白、细胞排列和成熟标志物的结构评估，可确定改善的血管化是否与心脏组织功能相关。因此，血管化心脏移植物的整体功能性应被视为血管灌注与收缩和电生理性能的整合，而非仅血管化。6. 血管化心脏移植物的临床前评估血管化心脏移植物的开发关键取决于建立能够支持植入后组织存活和整合的功能性可灌注血管网络。由于仅靠扩散不足以维持临床相关组织厚度，体内模型对于评估移植物灌注、血管整合和长期功能性仍然至关重要。重要的是，模型选择应反映所研究的终点：异位植入可提供血管吻合和移植物灌注的证据，而心肌内植入是评估移植物在收缩和损伤心脏环境内性能所必需的。临床前研究遵循跨物种的层级进展。小动物模型提供早期血管化和宿主-移植物相互作用的机制见解，而较大模型使得能够在生理相关血流动力学条件下评估移植物灌注、通畅性和长期重塑。然而，大多数研究依赖血管化的结构标志物，而功能性灌注的直接证据仍然有限。相应地，研究间的解释应区分移植物灌注的直接证据与血管生成的组织学证据和心脏功能整体改善。因此，在比较临床前结局时应考虑移植物位置、细胞来源和物种、免疫状态、随访持续时间和用于鉴定灌注血管的方法。6.1. 小动物模型：血管整合的机制见解小动物模型，包括小鼠和大鼠，提供血管网络形成和宿主整合的机制见解，大鼠模型与小鼠相比提供改善的生理相关性。由hiPSC-CMs和hiPSC-ECs组成的预血管化构建体在体外形成功能性血管网络并在植入后快速建立宿主-移植物吻合，实现早期灌注。这些构建体表现出高收缩力（>15 mN mm-2）和快速传导（约21 cm s-1），表明先进的组织组织化，可能支持有效血管整合。重要的是，该模型提供将预血管化与移植物灌注联系起来的直接证据，但其异位植入部位不能证明与宿主心肌的电或机械耦合。海藻酸盐-明胶（AlgGel）构建体支持内皮自组装，而基于球体的系统改善细胞存活（约72% vs 约53-61%）并增强血管整合。在心肌梗死（MI）模型中，此类构建体改善功能结局，包括增加左心室射血分数（LVEF），支持多细胞移植物组织化的治疗潜力。同样，移植物植入后改善的心室功能不应归因于机电耦合，除非有宿主-移植物电和机械整合的直接测量可用。互补的基于生物材料的策略进一步证明持续递送促再生因子（>28天）增强血管化、减少纤维化并改善组织重塑。然而，此类方法主要证明损伤心肌的治疗性调节，应与预形成可灌注心肌移植物的植入区分。因此，血管生成或旁分泌益处不应被视为等同于用血管化收缩组织替代。总之，这些研究表明仅预血管化不足以保证功能恢复，强调ECTs内协调血管、电和机械整合的必要性。6.2. 大鼠模型：连接机制研究与功能性能大鼠模型提供中间平台，比小鼠系统更好地近似心脏生物力学和电生理，使得能够更稳健地评估移植物整合和血管功能。跨研究，移植物与宿主组织之间的机械匹配成为血管稳定性和整合的关键决定因素。使用机械匹配水凝胶的研究说明材料特性对组织保存和重塑的重要性。然而，相关刚度取决于组织状态和所用测量方法，单一标称模量不应被视为心脏移植物工程的通用目标。结构优化移植物改善血管化和宿主整合，如增加血管密度、增强血管生成和减少纤维化所证明。使得能够与宿主组织直接界面的先进结构进一步增强整合。例如，基于微针的构建体促进与底层组织的快速耦合并促进血管生成。然而，这些终点应根据直接测量的内容来解释：增加血管生成、减少纤维化和改善心室性能支持心脏修复，而需要灌注示踪剂或流动成像来证明工程化血管区室的功能性灌注。除结构线索外，生物活性和黏附性生物材料改善移植物保留并支持血管重塑。这些系统增强细胞存活和血管生成，贡献于改善组织保存和血管整合。然而，与小动物模型类似，大多数研究主要使用组织学标志物评估血管化，对功能性灌注和血管通畅性的评估有限。6.3. 大动物模型：移植物灌注和功能的转化评估大动物模型通过使得能够在生理相关血流动力学条件下评估血管化移植物，包括血流、压力和组织力学，提供临床转化的关键桥梁。在猪系统中，工程化移植物展示改善的心脏功能、减少的纤维化和增强的血管心肌生成，同时显示改善的保留和减少的脱靶生物分布，解决细胞治疗的关键局限性。重要的是，这些模型使得能够直接评估工程化血管网络在生理流动条件下是否保持可灌注和稳定。兔模型进一步强调功能改善通常主要由增强的血管化和灌注驱动而非从头CMs形成，强调血管功能在移植物效力中的核心作用。除心肌修复外，大动物研究还使得能够评估具有改善血液相容性、抗血栓性和长期通畅性的工程化血管移植物。此类系统在体内长时间维持结构完整性和功能性能，证明能够将血管功能与长期稳定性整合的先进生物材料的出现。建立标准化方法以区分结构性血管化和功能性灌注代表该领域和血管化心脏移植物转化的关键需求。总之，当前临床前研究表明结构性血管化可在多个模型系统中实现。然而，功能性灌注、长期血管通畅性和宿主-移植物血流动力学整合的严格评估仍然相对有限，构成临床转化的主要障碍。7. 转化挑战与临床前景血管化心脏移植物的转化现在较少取决于是否能生成血管样结构，而更多取决于这些结构是否能在长时间内保持可灌注、稳定并与宿主组织功能耦合。组织学上看似密集血管化但植入后失去管腔连续性的构建体转化价值有限。因此，未来研究应将常规结构读数如CD31或VE-钙黏蛋白染色与灌注、通畅性、屏障完整性、血栓激活和宿主-移植物血流动力学整合的直接评估相结合。这一区分对心脏移植物尤为重要，其中血管整合必须与机械负荷和与损伤心肌的电耦合并行发生。未来策略还应考虑淋巴血管化作为心脏移植物整合的重要组成部分。心脏淋巴管贡献于间质液引流和炎症及免疫反应的调节，而淋巴功能受损可促进心肌水肿、炎症和纤维化。相应地，刺激淋巴管生成通路，特别是VEGF-C/VEGFR-3信号，可能代表未来ECGs中补充血管血管化的潜在策略。宿主免疫反应代表植入后移植物结局的额外决定因素。血管化心脏移植物含有多种潜在免疫原性组分，包括植入细胞、生物材料基质、降解产物和暴露于血流的新形成血管界面。在基于细胞的移植物中，自体hiPSC来源细胞可能减少免疫不匹配但仍难以放大，而异体hiPSC来源产品需要HLA匹配、免疫相容细胞库、遗传免疫编辑或短暂免疫抑制等策略。同时，生物材料可触发异物反应、巨噬细胞激活、纤维化包裹或慢性炎症，特别是当降解动力学、刚度或表面化学与宿主环境不匹配时。这些免疫反应可损害内皮化、促进血栓形成或纤维化并破坏宿主-移植物血管整合。因此，未来研究应将免疫相容性与灌注、内皮屏障完整性、血液相容性和长期通畅性一起评估，而非将免疫反应视为单独终点。从结构性血管化和工程化移植物结构到宿主血管整合和持续功能性血液灌注的概念进展已总结。第二个障碍是制造可重复性。hiPSC-CMs和血管细胞提供人相关且潜在患者特异性的细胞来源，但其不成熟性、批次间变异性和长生产时间线仍是临床转化的主要障碍。自体方法可能减少免疫不匹配但难以放大用于急性适应症，而异体产品需要稳健的免疫相容性策略、冷冻保存方案和放行标准。对于含有多种细胞类型和生物材料组分的复杂移植物，临床有用产品将需要标准化效力测定，不仅测量细胞身份和活力，还测量内皮屏障功能、血管响应性、收缩性能和电安全性。生物制造和灌注系统还需要在更接近预期植入环境的条件下评估。当前许多研究在短期、低负荷培养条件下进行，而植入的心脏移植物遇到周期性变形、炎症重塑、血液接触和空间异质流动。这些条件可使未成熟内皮不稳定、暴露血栓生成表面或促进不良重塑，如果材料降解过快或保持机械不匹配。相应地，未来移植物设计应将生物墨水选择、通道结构、内皮成熟和灌注调理作为相互依赖的参数而非单独优化步骤整合。从材料角度，这要求超越简单生物相容性 toward 定义明确的生物活性性能标准。未来生物材料应评估其促进快速内皮覆盖、在流动下维持屏障完整性、抵抗血栓激活、引导受控基质重塑和保持与收缩心肌机械相容性的能力。这些材料水平功能可能决定血管化构建体植入后是否保持稳定或退化为非灌注、纤维化或血栓生成组织。最后，临床前验证应转向在临床相关模型中更长、更标准化的研究。小动物模型对吻合、血管生成和早期移植物存活的机制研究仍然至关重要，但它们不能完全捕捉人尺度壁应力、免疫反应、致心律失常风险或手术处理约束。因此，需要大动物研究来评估在生理相关负荷条件下的持久灌注、长期通畅性、机电耦合、脱靶生物分布和安全性。在此背景下，血管化心脏移植物应作为整合活体装置而非静态组织替代物评估：其成功将取决于持续血管功能、受控重塑和与宿主心肌的稳定耦合。除这些生物学和技术挑战外，临床转化将需要适合大规模生产的制造和监管策略。在欧盟，符合适用标准的基于细胞的组织工程构建体根据法规（EC）No. 1394/2007作为先进治疗药品（ATMPs）监管。其开发需要受控和可重复的制造过程、符合适用良好生产规范（GMP）要求和适当的质量、非临床和临床证据。对于复杂血管化心脏移植物，向临床规模生产的转化因此将取决于可扩展且优选封闭或自动化的制造系统、标准化细胞和生物材料输入以及稳健的质量控制和放行程序以最小化批次间变异性。尽管组织工程ATMPs已在其他再生医学应用中达到临床使用，血管化心脏移植物仍处于较早转化阶段，突出表明需要在开发早期整合监管和制造考虑。8. 结论血管化心脏移植物的开发不仅需要形成血管结构，而且关键需要建立支持长期组织存活和整合的功能性可灌注网络。尽管在干细胞技术、生物材料和生物打印方面取得了重大进展，实现成熟、层级组织的血管系统仍是重大挑战。该领域日益从生成孤立血管结构转向工程化能够支持长期灌注、组织重塑和生理功能的整合血管系统。整合灌注、机械转导和多细胞组织化的新兴策略强调重现生理条件以驱动血管成熟和稳定性的重要性。然而，生成在植入后保持稳定、可灌注并与工程化心肌功能耦合的血管网络的能力在很大程度上仍未解决。重要的是，改善的血管化不一定转化为增强的心脏功能，强调工程化组织与宿主心肌之间有效机电整合的必要性。最终，成功的临床转化不仅取决于生成血管化构建体，还取决于建立能够长期再生和修复的持久、可灌注和功能整合的心脏组织。

该综述系统论述了血管化心脏移植物从结构性血管化向功能性灌注转变的核心问题。研究背景方面，工程化心脏组织虽能重现心肌部分结构与收缩特征，但临床转化受限于血管化不足、移植物存活差及与宿主循环整合不完全；氧气与营养扩散距离有限（约100-200 μm），厚层构建体必须依赖稳定可灌注血管网络维持长期活力。当前领域存在的关键问题是：多数研究以CD31或VE-cadherin等结构标志物评估血管化，缺乏灌注、通畅性、屏障功能及宿主-移植物血流动力学整合的直接证据，导致结构性血管化被误读为功能性灌注；同时hiPSC-CMs不成熟、批次间变异、免疫原性及制造可重复性等问题制约转化。作者开展此项综述的目的在于梳理细胞组成、生物制造、灌注策略与临床前评估，论证稳定、可灌注且血流动力学整合的血管网络是ECTs临床转化的核心前提。论文发表于《Materials Today Bio》。研究人员采用文献综述方法，整合干细胞生物学、生物材料学、生物打印、灌注生物反应器及临床前模型等多领域证据；关键技术方法包括：生物打印（液滴基、挤出基、激光辅助及容积生物打印）、牺牲模板化与同轴打印构建可灌注通道、微流控与心脏芯片平台及泵基/重力驱动灌注生物反应器、计算流体动力学（CFD）与人工智能辅助设计、以及跨物种临床前评估（小动物、大鼠及猪/兔大动物模型）。研究结果方面：（1）心脏移植物中的功能性血管系统——预血管化构建体可促进宿主-移植物快速吻合与早期灌注并改善存活，但内皮染色不能证明功能性灌注，需灌注示踪剂、血流成像或运输测量验证。（2）血管化心脏移植物的细胞组成——CMs决定收缩身份，hiPSC-CMs具患者特异性优势但结构功能不成熟且存在畸胎瘤风险；ECs形成微血管网络并通过旁分泌调控CM存活与成熟，HUVECs不能完全代表心脏微血管内皮；CFs、周细胞和SMCs通过ECM重塑和血管稳定化支持移植物，内皮-壁细胞协调互作是层级血管组织与长期稳定所必需。（3）生物打印策略——支架支持策略提供结构控制与预定义灌注通道但外源材料限制重塑，无支架策略利于内皮自组织但缺乏灌注路径控制；挤出、同轴、牺牲模板和激光辅助打印各有分辨率、通量与生物墨水相容性权衡；容积生物打印可快速生成复杂模板但仍处早期；CFD与AI可辅助血管几何优化和打印参数筛选，但需实验验证。（4）生物材料与生物墨水——天然聚合物生物相容但机械强度有限，合成聚合物机械优越但缺乏生物活性，GelMA因RGD基序和可调交联受关注但需增强；复合生物墨水是兼顾机械与生物功能的最有前景策略，设计需求随血管直径而异。（5）血管移植物生物制造——SDVGs（<6 mm）仍受血栓、内膜增生和缺乏生长能力限制，hiPSC-SMCs联合丝素蛋白涂层PLLA支架可生成类中膜结构，但细胞不成熟、供体变异和长期体内评估不足仍是障碍；LDVGs（>6 mm）合成移植物短期通畅可接受但生物惰性，厚壁构建体面临机械增强与血管化之间的矛盾，需重现从大管腔到壁内微血管的层级结构。（6）血流模式对内皮完整性与出芽的影响——生理层流（约10-15 dyn cm-2）通过KLF2/eNOS/Notch维持屏障与静止表型，扰动流（<5-10 dyn cm-2）激活NF-κB、ROS和VEGF促炎促血管生成通路导致血管不稳定；EC通过糖萼、整合素、PECAM-1/VE-cadherin/VEGFR2复合物及Piezo1感知力学信号；作者提出分层评估框架，区分结构性血管化、体外管腔通畅性、功能性灌注/运输、内皮屏障完整性、血流动力学成熟、氧输送、血液相容性、宿主-移植物整合、长期通畅性与心肌组织水平功能，并指出植入前高血管密度不必然预测体内持续灌注（如预血管化补片植入后仅40±23%人血管被灌注）。（7）灌注模型与生物反应器——2D/3D灌注模型可模拟屏障功能与出芽；重力/摇摆平台简单低成本但流动控制有限，泵基系统可精确控制搏动流适合长期灌注但机械复杂，微流控/心脏芯片时空控制精确适合实时成像但难以放大；血管灌注评估应与收缩和电生理读数整合。（8）临床前评估——小动物模型提供吻合与早期存活机制证据但异位植入不能证明与宿主心肌机电耦合；大鼠模型强调机械匹配重要性但多以组织学评估血管化；大动物模型（猪、兔）可在生理血流动力学下评估灌注、通畅性与血液相容性，但功能性灌注与长期通畅性的严格评估仍有限。讨论部分指出，转化瓶颈已从能否生成血管样结构转向能否长期保持可灌注、稳定并与宿主功能耦合；未来需将结构读数与灌注、屏障、血栓激活和宿主整合评估结合，考虑淋巴血管化（VEGF-C/VEGFR-3）以补充血液血管化；宿主免疫反应（细胞、生物材料、降解产物及血管界面）应与灌注和通畅性共同评估；制造可重复性要求标准化分化、效力测定（含内皮屏障功能、血管响应性、收缩性能和电安全性）及封闭/自动化生产；生物材料应超越简单生物相容性，转向促进快速内皮覆盖、流动下屏障维持、抗血栓激活和受控重塑的生物活性性能标准；临床前需在临床相关大动物模型中进行更长、标准化研究，并将血管化心脏移植物作为整合活体装置评估；欧盟将符合标准的细胞基组织工程构建体作为先进治疗药品（ATMPs）监管，需符合GMP及质量、非临床和临床证据要求。结论部分翻译：血管化心脏移植物的开发不仅需要形成血管结构，而且关键需要建立支持长期组织存活和整合的功能性可灌注网络。尽管在干细胞技术、生物材料和生物打印方面取得了重大进展，实现成熟、层级组织的血管系统仍是重大挑战。该领域日益从生成孤立血管结构转向工程化能够支持长期灌注、组织重塑和生理功能的整合血管系统。整合灌注、机械转导和多细胞组织化的新兴策略强调重现生理条件以驱动血管成熟和稳定性的重要性。然而，生成在植入后保持稳定、可灌注并与工程化心肌功能耦合的血管网络的能力在很大程度上仍未解决。重要的是，改善的血管化不一定转化为增强的心脏功能，强调工程化组织与宿主心肌之间有效机电整合的必要性。最终，成功的临床转化不仅取决于生成血管化构建体，还取决于建立能够长期再生和修复的持久、可灌注和功能整合的心脏组织。