《Materials Today Bio》：Retinal neuroprotection and microglia M1/M2 polarization modulation of triamcinolone acetonide and basic fibroblast growth factor co-delivered in liposomes after optic nerve injury
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视神经疾病可导致视网膜神经节细胞（RGCs）及其轴突的退变，最终引起不可逆性失明。当前常规治疗受限于疗效不一致、不良反应或耐受性差，亟需更有效的治疗策略。曲安奈德（TA）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）已被认定为神经保护剂，然而对其联合效应的研究仍然匮乏。
视神经疾病可导致视网膜神经节细胞（RGCs）及其轴突的退变，最终引起不可逆性失明。当前常规治疗受限于疗效不一致、不良反应或耐受性差，亟需更有效的治疗策略。曲安奈德（TA）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）已被认定为神经保护剂，然而对其联合效应的研究仍然匮乏。本研究描述了一种经PEG修饰、共包载TA和bFGF的脂质体，通过玻璃体腔注射施用于小鼠视神经夹伤（ONC）模型。该共递送系统在保护RGCs、促进轴突再生及调控小胶质细胞M1/M2转换方面优于单药治疗。RNA测序分析和分子实验揭示，TA/bFGF@Lipo参与核因子-κB（NF-κB）/p65信号通路和磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信号通路。值得注意的是，脂质体处理后金属蛋白酶组织抑制剂-1（TIMP1）的表达显著上调，并与小胶质细胞M2生物标志物的表达呈强相关。后续实验证明，重组小鼠TIMP1（rmTIMP1）以剂量依赖性方式促进BV2小胶质细胞M1/M2转换，而TIMP1敲低显著降低了TA/bFGF@Lipo诱导的RGCs存活率和视网膜小胶质细胞M2极化。综上，本研究确立了TA/bFGF@Lipo作为视神经损伤的有效治疗策略，并强调了TIMP1在RGCs保护和小胶质细胞M2极化中的关键作用，为视神经疾病的治疗提供了新见解。
视神经疾病包括青光眼、视神经炎和外伤性视神经病变，可通过视网膜神经节细胞（RGCs）及其轴突的退变导致不可逆性失明，目前临床尚无有效治愈手段，仅能延缓疾病进展。对于外伤性视神经病变，公认的药物治疗方案为个体化大剂量糖皮质激素冲击治疗，辅以改善血流动力学药物和神经营养药物；视神经炎和缺血性视神经病变也常采用糖皮质激素口服、静脉注射或玻璃体腔注射治疗。然而，大剂量糖皮质激素（如地塞米松）可引发应激性溃疡、骨质疏松和高血糖等严重不良反应，限制了部分患者的长期治疗。糖皮质激素的作用机制主要涉及抑制RGCs凋亡期间视网膜炎症反应的加剧。视神经损伤（ONI）发生时，视网膜驻留免疫细胞小胶质细胞被激活并分化为两种功能不同的表型：分泌促炎细胞因子[如白细胞介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）]的M1型小胶质细胞，以及释放抗炎细胞因子如IL-10的M2型小胶质细胞。曲安奈德（TA）是眼科临床广泛使用的抗炎皮质类固醇，研究显示TA可抑制小胶质细胞激活，减轻神经炎症反应并抵抗神经元凋亡。然而，玻璃体腔注射TA混悬液与白内障形成和眼压升高相关。近年来研究者探索了TA负载纳米生物材料用于黄斑水肿和年龄相关性黄斑变性（AMD）模型等眼后节疾病治疗，TA负载生物材料在青光眼模型中也表现出RGCs保护和抗炎特性。尽管如此，TA与其他神经保护剂联合递送治疗视神经疾病的研究仍然缺乏。成纤维细胞生长因子（FGFs）是由包含二十三个高度保守核心序列的基因家族编码的生长因子超家族，其中碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）已成功实现规模化生产并应用于临床。研究证明bFGF在促进视神经轴突再生和RGCs保护中发挥关键作用，但bFGF在ONI中的应用受限于其半衰期短、体内不稳定及过度血管生成风险，且通过纳米载体递送bFGF治疗ONI的研究仍然匮乏。鉴于TA和bFGF在ONI治疗中的巨大潜力，开发合适的药物递送系统以施用这些药物并验证其联合疗效十分必要。脂质体等纳米载体已被广泛设计用于体内治疗化合物的靶向递送，具有维持药物持久活性、减轻药物不良反应和实现精准靶向递送的能力。脂质体由磷脂和胆固醇形成的双层膜构成，可包载多种药物和生物分子包括蛋白质，是广泛使用的药物递送平台，目前被认为是治疗多种眼部疾病特征明确且相对安全的递送载体。本研究将TA和bFGF共包载于聚乙二醇（PEG）修饰的脂质体（TA/bFGF@Lipo）中以增强药物稳定性并延长治疗效果持续时间，主要目的是在小鼠视神经夹伤（ONC）模型中研究TA和bFGF的联合神经保护作用及其潜在分子通路。研究表明TA/bFGF@Lipo通过促进RGCs存活、促进轴突再生和调控小胶质细胞从M1向M2表型极化发挥优越的神经保护作用。RNA测序和分子实验揭示TA/bFGF@Lipo参与核因子-κB（NF-κB）/p65信号通路和磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信号通路。值得注意的是，TA/bFGF@Lipo上调ONC视网膜中金属蛋白酶组织抑制剂-1（TIMP1）的表达，进一步敲低实验揭示TIMP1在TA/bFGF@Lipo诱导的RGCs保护和小胶质细胞M2极化中发挥关键作用。综上，本研究确立了TA/bFGF@Lipo作为视神经损伤的有效治疗策略，强调了TIMP1在RGCs保护和小胶质细胞M2极化中的关键作用，为视神经疾病的治疗提供了新见解。该论文发表在《Materials Today Bio》。
研究人员开展研究用到的主要关键技术方法包括：采用微流控技术制备PEG修饰的TA/bFGF共包载脂质体，通过动态光散射（DLS）和透射电子显微镜（TEM）表征理化性质；建立小鼠视神经夹伤（ONC）模型（165只雌性C57BL/6J小鼠，6-8周龄）并经玻璃体腔注射给药；采用批量RNA测序（RNA-seq）分析视网膜差异表达基因及相关信号通路；通过玻璃体腔注射AAV2-shTIMP1实现TIMP1视网膜内敲低；结合免疫荧光、Western blotting、qRT-PCR和流式细胞术评估RGCs存活、轴突再生及小胶质细胞极化；采用闪光视觉诱发电位（f-VEP）评估视觉功能。
研究结果如下：（1）脂质体的制备与表征：TA被嵌入脂质体脂质双层，bFGF包封于中央亲水腔，空白@Lipo、TA@Lipo、bFGF@Lipo和TA/bFGF@Lipo的平均粒径分别为53.32 ± 1.71 nm、61.55 ± 2.22 nm、61.54 ± 1.84 nm和62.53 ± 2.02 nm，TA包封率为15.00 ± 1.87%，bFGF包封率为45.03 ± 4.61%，第14天TA和BSA-FITC累积释放分别约达75.33 ± 2.05%和72.63 ± 4.27%，TEM显示脂质体呈均匀球形。细胞摄取实验显示三种细胞系（661W、ARPE-19、BV2）在6 h时细胞内荧光强度显著增加，尤以BV2小胶质细胞最为明显。CCK-8和活/死细胞染色显示各组细胞存活率均超过95%。划痕实验显示bFGF@Lipo（p = 0.0051）和TA/bFGF@Lipo（p = 0.0012）组细胞迁移率显著升高。Cou6标记脂质体在眼内荧光持续约6天，视网膜bFGF水平在第3天显著升高（p < 0.0001），第7天略高于基线但无统计学差异，提示脂质体及其载荷在视网膜内滞留约一周。（2）体内疗效评价——RGCs保护：Western blotting显示三个脂质体治疗组Bcl-2/Bax相对蛋白水平较对照组显著升高，分别约增加2.98倍（p = 0.0001）、1.94倍（p = 0.0217）和3.45倍（p < 0.0001）；bFGF@Lipo和TA/bFGF@Lipo组GAP43相对蛋白水平分别上调约2.13倍（p = 0.0227）和2.50倍（p = 0.0039）。Rbpms阳性细胞定量显示三个脂质体治疗组视网膜周边、旁中央和中央区域RGCs数量均显著多于对照组，TA/bFGF@Lipo组RGC密度最高；Tuj1免疫荧光显示脂质体治疗组神经节细胞层厚度超过对照组，联合治疗组增加最显著。（3）视神经轴突再生：ONC后第12天玻璃体腔注射CTB-FITC评估再生轴突，对照组可见较多碎片化和紊乱的CTB荧光球，而bFGF@Lipo和TA/bFGF@Lipo组在夹伤 site 近端可见明显轴突再生，后者轴突计数更高，提示TA可能增强bFGF在ONC模型中的再生功效。（4）闪光视觉诱发电位：14 dpi时bFGF@Lipo和TA/bFGF@Lipo组N1-P1波振幅较对照组适度增加（3.81 ± 1.83 μV vs 9.92 ± 2.49 μV；3.81 ± 1.83 μV vs 11.57 ± 3.30 μV），差异有统计学意义（p = 0.0236和0.0044），TA/bFGF@Lipo组增加更明显。（5）TA/bFGF@Lipo对小胶质细胞M1/M2极化的调控：LPS刺激BV2小胶质细胞后，qRT-PCR和Western blotting显示TA@Lipo和TA/bFGF@Lipo组促炎标志物（iNOS/NOS2、IL-1β和TNF-α）较LPS组显著下调，bFGF@Lipo组未见此效应；TA/bFGF@Lipo组抗炎标志物（Arg-1、IL-10和CD206）较LPS组显著上调；TA@Lipo和TA/bFGF@Lipo组NF-κB p65磷酸化水平显著降低。流式细胞术显示含TA脂质体组CD86水平显著降低（39.1% vs 15.6%和16.3%），CD206水平显著升高（13.3% vs 24.6%和28.6%）。体内免疫荧光显示TA@Lipo和TA/bFGF@Lipo组CD86+小胶质细胞密度及CD86+ vs Iba1+荧光强度显著降低，TA@Lipo、bFGF@Lipo和TA/bFGF@Lipo组Arg1+小胶质细胞密度显著升高，TA/bFGF@Lipo组Arg-1+ vs Iba1+荧光强度显著升高。GFAP荧光强度在各脂质体组与对照组相当，提示脂质体对7 dpi星形胶质细胞增殖无显著影响。（6）视网膜批量RNA测序：KEGG通路分析显示TA@Lipo和bFGF@Lipo均影响吞噬体和TGFβ信号通路，TA@Lipo组NOD样受体信号通路显著降低，bFGF@Lipo组PI3K/AKT信号通路显著促进；TA@Lipo组Fgfr2和Fgfr3 mRNA表达显著上调。与TA@Lipo相比，TA/bFGF@Lipo显示PI3K/AKT信号通路增强激活；与bFGF@Lipo相比，TA/bFGF@Lipo显著抑制细胞因子-细胞因子受体相互作用和NOD样受体信号。Western blotting验证显示TA/bFGF@Lipo组视网膜p-PI3K和p-AKT水平较对照组显著升高，且高于bFGF@Lipo组。Venn图显示Timp1在四组比较的DEGs中持续存在，三个脂质体治疗组TIMP1蛋白水平较对照组显著升高。相关性分析显示Timp1 mRNA与Arg1和Tgfb1显著正相关（相关系数 > 0.8），提示Timp1可能作为ONC模型中M2小胶质细胞的潜在标志物。（7）TIMP1对TA/bFGF@Lipo诱导的RGCs保护和小胶质细胞M1/M2转换的影响：体外实验显示梯度浓度rmTIMP1处理后M2表型标志物（IL-10、Arg-1和CD206）表达上调、M1表型标志物（iNOS/NOS2、IL-1β、IL-6和TNF-α）表达下调，表明rmTIMP1以剂量依赖性方式促进BV2小胶质细胞M1/M2极化转换。体内TIMP1敲低实验显示TA/bFGF@Lipo+AAV2-shTIMP1组TIMP1蛋白水平较TA/bFGF@Lipo+AAV2-shNC组显著降低；TIMP1敲低显著降低两个TA/bFGF@Lipo治疗组间Bcl-2/Bax比值，RGC层Rbpms+细胞密度显著降低，全视网膜厚度显著降低；TIMP1敲低显著加剧视网膜小胶质细胞M1极化并抑制TA/bFGF@Lipo对小胶质细胞M2极化的促进作用。总体表明TIMP1表达对ONC模型中RGCs存活和视网膜小胶质细胞M2极化至关重要，但对TA/bFGF@Lipo抑制小胶质细胞M1极化的作用并非关键。（8）脂质体体内毒性评估：14天观察期内玻璃体腔注射脂质体未引起眼压显著升高，裂隙灯摄影未见严重眼表炎症和角膜病变，眼底OCT未见视网膜结构损伤或新发病灶，H&E染色显示角膜上皮和基质结构完整、视网膜分层形态良好，主要器官（心、肝、脾、肺、肾）未见明显结构异常、炎症浸润或坏死病变。
讨论部分总结：糖皮质激素和神经营养因子传统上被视为视神经损伤和修复的主要药物，既往研究报道含地塞米松或TA与睫状神经营养因子（CNTF）的生物材料在视神经疾病中具有明显神经保护作用，但不同糖皮质激素与不同神经营养因子联合应用及其潜在分子变化的研究仍然有限。本研究合成并表征了PEG修饰脂质体共递送TA和bFGF，在ONC模型中展示了增强的神经保护疗效，据研究人员所知，这是首次阐明TA和bFGF共递送在视神经损伤中的治疗效果。纳米材料在眼科疾病治疗中已被广泛研究，脂质体具有生物相容性优异、安全性高和适合注射等多重优势。本研究通过表征分析确认TA和bFGF成功共包载于脂质体载体中；体外药物释放研究采用BSA-FITC作为模型蛋白模拟释放曲线，但需注意BSA-FITC与bFGF理化性质差异及透析法膜屏障效应可能导致与实际释放动力学的偏差；体内成像和ELISA分析显示脂质体及其包载药物滞留时间约一周，与既往研究一致，但ELISA主要检测视网膜中游离bFGF，可能不能准确反映bFGF体内实际生物活性；玻璃体腔注射后第3天bFGF相对水平峰值可能归因于脂质体从玻璃体扩散至视网膜并随后释放药物所需时间。鉴于视神经损伤长期治疗的临床需求，未来应优先开发长效缓释制剂。本研究脂质体包载药物以相对低剂量和缓释曲线给药，可能减轻高剂量bFGF和皮质类固醇治疗常见的不良反应；但鉴于脂质体粒径小且经玻璃体腔注射给药，监测其局部和全身毒性十分重要，小鼠安全性数据包括眼压测量、眼表照片、眼后节OCT及视网膜和主要器官H&E染色在注射后14天内未见明显异常，但仍需在非啮齿类动物和非人灵长类模型中进一步验证，未来应开发纳米材料滴眼液等无创且更适应临床的方法。在抗炎效果评估中，含TA脂质体通过抑制NF-κB/p65信号通路显著抑制小胶质细胞M1激活并促进M2激活；bFGF不影响小胶质细胞M1激活但适度促进M2激活，bFGF的免疫调节作用既往报道存在争议，研究人员推测bFGF@Lipo诱导的M2小胶质细胞增加可能与其通过PI3K/AKT信号通路刺激细胞增殖的能力有关。RNA-seq数据分析揭示TA具有显著抗炎特性，bFGF可通过PI3K/AKT信号通路促进细胞存活相关基因转录；TA上调bFGF受体表达可能部分解释TA/bFGF@Lipo促进轴突再生的优越效果；TA/bFGF@Lipo同时调控炎症相关通路和PI3K/AKT信号通路，结合了两种单药的治疗优势；分子实验证实TA/bFGF@Lipo相对于单药在NF-κB/p65通路和PI3K/AKT通路方面具有增强的抗炎和神经保护功效，但ERK/STAT3信号通路等视网膜炎症相关通路仍需未来研究探索。RNA-seq结果强调TIMP1在ONC模型免疫过程中的潜在意义，TA/bFGF@Lipo处理后ONC视网膜中TIMP1表达显著上调，提示TIMP1可能与TA和bFGF的神经保护作用相关；TIMP1是一种多功能细胞因子，在细胞外基质稳态、免疫调节和代谢调节中发挥重要作用，通过经典MMP通路抑制细胞外基质金属蛋白酶维持细胞外基质稳态，还可通过与CD63/integrin β1和LRP1等细胞表面受体相互作用激活细胞内信号级联；近期研究还发现TIMP1具有抗衰老和神经保护特性，Zhao等报道TIMP1在缺血性卒中模型中促进小胶质细胞M1/M2转换，但TIMP1在视网膜小胶质细胞中的功能尚未完全阐明；本研究TIMP1敲低实验证明TIMP1在介导RGCs存活和视网膜小胶质细胞M2极化中发挥关键作用，但对TA/bFGF@Lipo诱导的小胶质细胞M1极化抑制并非关键；虽然本概念验证研究证明TIMP1对RGCs存活和小胶质细胞M2极化的重要贡献，但TIMP1在视神经疾病中的具体作用和通路仍探索不足，未来采用TIMP1相关转基因小鼠模型和原代细胞模型的研究将有助于阐明TIMP1在这些疾病中的功能。研究结论翻译：综上，研究人员报道了TA/bFGF@Lipo在小鼠ONC模型中的优越神经保护作用及相应分子通路。研究发现TA/bFGF@Lipo在RGCs保护、轴突再生和炎症控制方面优于单药治疗，基于RNA-seq分析和分子实验，其涉及NF-κB/p65通路和PI3K/AKT通路。此外，研究结果表明TIMP1在TA/bFGF@Lipo诱导的RGCs保护和小胶质细胞M2极化中发挥关键作用。这些发现可能推广至其他神经退行性疾病，值得未来进一步探索。总之，本研究确立了TA/bFGF@Lipo作为视神经损伤的有效治疗策略，强调了TIMP1在RGCs保护和小胶质细胞M2极化中的关键作用，为视神经疾病的治疗提供了新见解。
