《Materials Today Bio》：Neutrophil-hitchhiking and microglia-homing liposomes co-delivering artemisinin and edaravone for cerebral ischemia-reperfusion injury treatment
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脑缺血再灌注损伤（CIRI）的临床结局仍不理想，主要因血脑屏障（BBB）限制大多数神经保护剂向脑实质的递送。尽管青蒿素（ART）和依达拉韦（EDV）已显示出对CIRI的治疗潜力，但其体内半衰期短和水溶性差的缺陷阻碍了临床应用。CIRI触发的 neutro ph
脑缺血再灌注损伤（CIRI）的临床结局仍不理想，主要因血脑屏障（BBB）限制大多数神经保护剂向脑实质的递送。尽管青蒿素（ART）和依达拉韦（EDV）已显示出对CIRI的治疗潜力，但其体内半衰期短和水溶性差的缺陷阻碍了临床应用。CIRI触发的 neutro phil 浸润为药物跨越BBB提供了独特机会，而靶向调控微胶质细胞是减轻再灌注损伤的关键策略。然而，现有中性粒细胞搭便车递送系统主要关注BBB穿越，通常缺乏次级靶向机制以促进药物在缺血脑炎症核心的优先蓄积。本研究构建了经唾液酸（SA）和磷脂酰丝氨酸（PS）双重修饰的脂质体系统（ART/EDV-PS/SAL），用于ART和EDV的共递送。该系统通过SA介导的中性粒细胞搭便车实现BBB穿越，随后通过PS介导的微胶质细胞归巢实现缺血脑组织内的序贯两步靶向。在CIRI小鼠模型中，ART/EDV-PS/SAL显著缩小脑梗死体积、保护BBB完整性，并显著改善神经和行为学结局。机制上，ART/EDV-PS/SAL通过抑制NLRP3炎症小体活化、减轻细胞焦亡并促进微胶质细胞向抗炎M2表型极化发挥神经保护作用。通过利用内源性免疫细胞实现高效序贯药物靶向，本研究为缺血性卒中及其他神经炎症性疾病建立了有前景的纳米递送平台。
**研究背景与问题**：卒中为全球第二大死因，其中缺血性卒中（IS）占多数，由脑血流中断致氧和营养供应不足引起。及时恢复血流是急性IS治疗基石，但再灌注治疗可paradoxically诱导脑缺血再灌注损伤（CIRI），限制神经功能恢复。CIRI由缺血性细胞损伤启动，再灌注后经氧化应激、过度炎症和线粒体功能障碍等复杂病理级联加剧继发性脑损伤。神经炎症被确立为CIRI发病机制的关键 contributor，resident 胶质细胞尤其微胶质细胞为关键细胞介质，过度胶质活化促炎介质和活性氧（ROS）释放，进一步损害BBB完整性、加剧神经元损伤并延续神经炎症级联。现有神经保护剂临床转化有限，天然产物及中药活性成分因多靶点药理作用受关注。ART除抗疟外，已显示通过抑制凋亡、减轻氧化应激和炎症、促进神经修复等机制对CIRI的神经保护潜力；EDV通过清除自由基、激活Nrf2通路、抑制NLRP3炎症小体活化改善CIRI结局。鉴于二者互补的神经保护机制，研究人员假设其共给药可通过同时调控多条损伤通路增强对CIRI的保护。但二者水溶性差、系统半衰期短、生物利用度欠佳，且ART与EDV联合用于CIRI尚待探索，有效脑靶向共递送平台尚未建立。脂质体因良好生物相容性、可调药物释放及改善难溶性药物溶解性成为有前景的纳米载体。缺血再灌注诱导的BBB破坏促进纳米脂质体在缺血脑组织优先蓄积；脑缺血引发强烈炎症反应驱动循环中性粒细胞跨过受损BBB并募集至缺血灶，中性粒细胞搭便车策略因而成为跨BBB运输治疗货物并靶向缺血脑区的有吸引力方法。但现有中性粒细胞搭便车系统多主要促进BBB穿越，缺乏次级靶向机制以在BBB穿透后于炎症核心选择性蓄积和控制释放。L-选择素（CD62L）为组成性表达的中性粒细胞黏附受体，参与白细胞捕获、滚动和募集，其表面丰度在中性粒细胞活化时动态调节包括快速蛋白水解脱落，但循环中性粒细胞上功能可及的L-选择素可作为SA功能化纳米载体的识别位点，实现中性粒细胞介导的向炎症组织递送。基于中性粒细胞特洛伊木马策略的SA衍生物修饰脂质体已在肿瘤和炎症疾病模型中广泛研究，但在CIRI治疗中尚待探索。缺血损伤迅速激活微胶质细胞，其通过表型转换和趋化因子分泌调控神经炎症；PS与活化微胶质细胞高表达的PS受体（PSRs）结合，促进M2样极化和炎症消退。因此，微胶质细胞靶向成为减轻神经炎症和改善CIRI结局的有前景策略。本研究构建共载ART和EDV并经SA衍生物和PS功能化的双配体脂质体递送平台（ART/EDV-PS/SAL），实现中性粒细胞和微胶质细胞的序贯靶向以治疗CIRI。该系统旨在促进BBB转运、调控神经炎症并提高对CIRI的治疗效果：首先SA介导识别循环中性粒细胞上功能可及的L-选择素，促进中性粒细胞搭便车介导的BBB穿透并增强脂质体在缺血脑组织蓄积；随后入脑後PS-PSR相互作用促进微胶质细胞摄取并在炎症微环境内局部药物释放；最终ART/EDV-PS/SAL通过抑制炎症反应和促进微胶质细胞向M2样表型极化改善缺血性脑损伤。该工作建立整合中性粒细胞介导BBB转运与微胶质细胞导向免疫调节的序贯双靶向策略，为应对CIRI复杂病理过程和递送挑战提供有前景的方法。论文发表在《Materials Today Bio》。
**关键技术方法**：研究采用乙醇注入法制备脂质体并表征粒径、PDI、Zeta电位、包封率和载药量；建立小鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）模型及体外氧糖剥夺/复氧（OGD/R）模型；采用LC-MS/MS进行药代动力学和组织分布定量；通过流式细胞术和免疫荧光分析中性粒细胞与微胶质细胞摄取及共定位；运用RNA测序（RNA-seq）进行转录组分析；结合RT-qPCR、Western blot、ELISA及TTC染色、Evans blue渗漏、脑含水量、行为学测试和生物安全性评价。动物样本来源于贵州医科大学实验动物中心6-8周龄雄性C57BL/6J小鼠。
**研究结果**：3.1 脂质体制备与表征：成功合成SA-GAN-n-OCT并经质谱和1H NMR确证结构，确定ART与EDV摩尔比8:1；ART/EDV-L和ART/EDV-PS/SAL粒径分别约102.9和107.0 nm，PDI<0.2，呈球形囊泡，Zeta电位相近，4°C储存7天胶体稳定，体外呈相似缓释且无突释，包封率均超80%，双配体修饰未损害药物包封；分离中性粒细胞纯度约92%，制剂在2.5-50 μM对中性粒细胞活力无显著影响；LPS刺激下PE-CD62L免疫荧光增强，研究人员解释为方案依赖性CD62L免疫反应性差异而非活化诱导上调的直接证据；Cy5-SAL和Cy5-PS/SAL在活化中性粒细胞摄取显著高于Cy5-L而Cy5-PSL与Cy5-L相当，示SA而非PS主要增强中性粒细胞摄取；Cy5-PSL和Cy5-PS/SAL在BV2细胞摄取显著增强而Cy5-SAL无明显增强，示PS主要促成微胶质细胞内化，两配体功能互补互不损害。3.2 炎症响应脂质体增强缺血脑靶向并改善药代动力学：ART/EDV-L和ART/EDV-PS/SAL较ART/EDV-S显著延长系统暴露，t1/2、MRT、Cmax和AUC更高，二者药代特征相当，示SA和PS修饰对循环动力学影响小；DiD-SAL和DiD-PS/SAL显著增加Ly6G+DiD+中性粒细胞比例，示体内SA依赖性中性粒细胞摄取；DiD-PS/SAL在缺血侧半球呈时间依赖性蓄积并于24 h达峰，假手术组和DiD-L组脑荧光显著较弱，离体成像证实缺血脑区信号最强；LC-MS/MS示ART/EDV-PS/SAL组缺血侧半球ART和EDV浓度显著高于对侧，示缺血脑区优先蓄积；较ART/EDV-L，ART/EDV-PS/SAL肝清除更快、心脏分布更低而脾脏水平显著升高，可能反映炎症响应脂质体和/或脂质体相关免疫细胞向脾脏再分布；免疫荧光示DiD-PS/SAL给药后缺血半暗带区DiD信号与Ly6G阳性中性粒细胞及Iba-1阳性微胶质细胞共定位增加，提供组织学证据。3.3 神经保护作用：MCAO后3天TTC染色示各治疗组梗死体积显著减小，ART/EDV-PS/SAL减小最显著；EB渗漏示各治疗组显著降低而ART/EDV-PS/SAL抑制最强，证其保护BBB完整性；各治疗组减轻脑水肿，ART/EDV-PS/SAL使脑含水量近恢复至假手术水平；Longa评分示术后第3天起各干预组神经损伤减轻，ART/EDV-PS/SAL最显著且优于ART/EDV-L；转棒试验示各治疗组跌落潜伏期延长，ART/EDV-PS/SAL运动协调改善明显；体重监测示MCAO组和ART/EDV组分别于术后第8和10天全部死亡，ART/EDV-L组第15天全部死亡，而ART/EDV-PS/SAL组自第3天恢复体重并观察期内100%存活；OFT示各干预组总移动距离、中央区移动距离和停留时间改善，ART/EDV-PS/SAL逆转最显著；MWM示ART/EDV-PS/SAL组逃避潜伏期缩短最明显，探索试验中入目标区潜伏期缩短、穿台次数增加、目标象限停留时间增强，示空间学习和记忆改善。3.4 转录组分析：共检测32,612个基因，以FDR<0.05且|log2FC|>1为阈值，假手术组vs MCAO组1070个DEGs（255上调、815下调），ART/EDV-PS/SAL组vs MCAO组292个DEGs（102上调、190下调）；KEGG富集示DEGs显著富集于MAPK、TNF、NF-κB和JAK-STAT等炎症和应激相关信号通路；GO富集突出炎症反应相关生物学过程；层次聚类示三组DEG表达模式 distinct，示治疗相关转录组重塑；研究人员指出富集分析识别通路关联而非直接因果机制，需额外实验验证。3.5 ART/EDV-PS/SAL经抑制NLRP3炎症小体活化调控微胶质细胞极化和焦亡：MCAO后3天免疫荧光示M1样（CD16+/Iba-1+）和M2样（CD206+/Iba-1+）微胶质细胞均增多，各治疗组显著减少M1样而以ART/EDV-PS/SAL最显著，M2样显著升高亦以ART/EDV-PS/SAL最显著；RT-qPCR示各治疗组降低M1相关基因CD16、CD32、iNOS表达并升高M2相关基因CD206、Arg1、CCL22表达，ART/EDV-PS/SAL变化最显著；免疫荧光示MCAO后GSDMD阳性微胶质细胞显著增多，各治疗组降低而以ART/EDV-PS/SAL最显著，免疫印迹示GSDMD蛋白水平显著降低；NLRP3免疫反应性与Iba-1明显共定位示NLRP3相关信号主要定位于活化微胶质细胞，免疫印迹示MCAO后NLRP3、ASC和caspase-1升高而ART/EDV-PS/SAL显著抑制，并降低IL-18和IL-1β、升高TGF-β1和IL-10；综上支持ART/EDV-PS/SAL促进M2样微胶质细胞表型同时抑制NLRP3炎症小体活化、焦亡信号和下游神经炎症的机制。3.6 OGD/R后促进M1样向M2样表型转变：BV2细胞OGD/R后M1样比例显著增加、M2样亦中度增加，各制剂显著降低M1样而以ART/EDV-PS/SAL最显著，M2样进一步增加亦以ART/EDV-PS/SAL最显著；RT-qPCR示ART/EDV-PS/SAL显著抑制OGD/R诱导的CD16、CD32、iNOS并增强CD206、Arg1、CCL22表达；单独PSL（不含ART/EDV）中度降低CD16和iNOS、升高CD206和Arg1，而ART/EDV-PS/SAL作用显著更强，示PS本身参与微胶质细胞表型调控但不足以解释其强效M2样极化。3.7 抑制微胶质细胞焦亡和炎症反应：CCK-8示各制剂尤其ART/EDV-PS/SAL显著改善OGD/R损伤BV2细胞活力；OGD/R显著增加LDH释放而ART/EDV-PS/SAL显著减轻，示质膜损伤减少；免疫荧光示OGD/R后GSDMD阳性BV2细胞显著增多而ART/EDV-PS/SAL显著降低，免疫印迹示GSDMD蛋白受抑；OGD/R诱导NLRP3、ASC、caspase-1升高及IL-1β、IL-18表达分泌增加，ART/EDV-PS/SAL显著减弱并升高IL-10和TGF-β1分泌；MCC950抑制实验示OGD/R升高GSDMD、NLRP3、ASC和caspase-1而MCC950显著减弱，MCC950基础上加ART/EDV-PS/SAL较单用MCC950进一步降低这些焦亡相关蛋白，示ART/EDV-PS/SAL部分经抑制NLRP3炎症小体活化调控焦亡；DCFH-DA和MitoSOX Red示OGD/R显著增加总细胞内和线粒体ROS而ART/EDV-PS/SAL显著抑制，JC-1示OGD/R降低聚合/单体比值而ART/EDV-PS/SAL显著逆转线粒体损伤；综上示减轻ROS相关NLRP3炎症小体信号和焦亡反应并结合微胶质细胞极化调控可能 contribute 其保护作用。3.8 生物安全性和相容性：CCK-8示ART/EDV-PS/SAL在测试浓度范围内对HT22、BV2和SH-SY5Y细胞活力无显著降低；溶血率低于2%，按生物材料溶血分类属非溶血性，满足静脉注射安全要求；末次给药后7天血液学指标（RBC、HGB、HCT、MCV、MCH、MCHC、WBC、LYMPH、NEUT、EOS、PLT、MPV、PDW）无显著异常，血清肝肾功能和代谢指标（ALT、AST、ALB、BUN、CREA、UA、TCH、TG、LDL）与假手术组相当，CK和LDH无显著异常，主要器官H&E染色未见明显治疗相关形态异常；综上示良好细胞相容性、血液相容性和系统耐受性。
**讨论与结论**：讨论部分指出BBB为限制药物向中枢神经系统有效转运的关键屏障，中性粒细胞作为CIRI早期应答者迅速募集至缺血区并可跨BBB迁移，提供生理性特洛伊木马用于脑靶向递送；SA修饰促进活化中性粒细胞经SA-CD62L相互作用识别和摄取ART/EDV-PS/SAL，使脂质体搭便车于浸润中性粒细胞并蓄积于缺血灶；CD62L在中性粒细胞活化时动态调节并可快速胞外域脱落，故所提SA介导搭便车机制不应解释为需要活化诱导CD62L上调，而取决于递送窗口期循环中性粒细胞上功能可及L-选择素的可用性，既往受体竞争研究已证实SA功能化纳米载体的L-选择素依赖性摄取。炎症微环境中活化中性粒细胞可形成中性粒细胞胞外诱捕网（NET），既往研究示被中性粒细胞内化的纳米载体可在NET形成时释放至胞外，提示炎症响应性卸载机制；据此研究人员提出中性粒细胞相关ART/EDV-PS/SAL在CIRI灶中性粒细胞活化和NET形成时局部释放，释放后脂质体表面PS与活化微胶质细胞高表达PSRs结合促进次级微胶质细胞靶向和摄取，ART和EDV随后逐渐释放实现炎症核心持续药物暴露；虽该释放过程未直接可视化，但研究结果和既往证据支持所提序贯递送机制。药代和活体成像研究示脂质体可利用CIRI后BBB通透性短暂增加被动蓄积于缺血区，但该递送很大程度上依赖BBB破坏程度和时序动态；相较之下本研究系统结合SA介导中性粒细胞搭便车与PS介导次级微胶质细胞靶向，促进缺血脑高效富集同时减少对被动BBB渗漏的单一依赖；双配体设计进一步增强BBB穿越后细胞特异性药物滞留；PS似通过促进微胶质细胞识别和摄取并发挥中度内在免疫调节作用而具双重角色，ART/EDV-PS/SAL更强的M2样极化可能反映PS介导靶向与ART和EDV药理作用的综合效应。治疗上ART/EDV-PS/SAL在MCAO模型显示强效神经保护，产生最大梗死体积减小、减轻脑水肿、保护BBB完整性并显著改善长期神经结局包括神经功能缺损评分、运动协调、探索行为和空间学习记忆，且实现100%存活和加速体重恢复而其他治疗组观察期内出现不同程度死亡。转录组示治疗效应与主要炎症信号通路包括MAPK、NF-κB和JAK-STAT及焦亡相关过程调控密切相关，体内外机制研究进一步验证；与既往报道一致，ART通过激活PPARγ通路和促进M2微胶质细胞极化减轻缺血性脑损伤并促进神经发生，EDV亦通过促进M1向M2表型转变抑制微胶质细胞介导的神经炎症；同时ART/EDV-PS/SAL显著抑制NLRP3炎症小体活化，表现为NLRP3、ASC和caspase-1水平降低及下游炎症介质IL-18、IL-1β和焦亡执行分子GSDMD表达减少，与ART经抑制ROS/TXNIP/NLRP3/Caspase-1信号级联减轻缺血触发焦亡及EDV通过阻断NLRP3炎症小体相关微胶质细胞焦亡发挥神经保护的已知抗焦亡效应一致；细胞水平ART/EDV-PS/SAL恢复OGD/R损伤后BV2细胞活力、减少LDH释放、降低细胞内和线粒体ROS并改善线粒体膜电位，且在所有检测中显著强于游离药物组合或非靶向脂质体，示精准双靶向递送策略进一步放大ART与EDV的药理协同。生物安全性方面制剂对多种神经细胞系细胞毒性可忽略、溶血率低于2%，体内未见血液学参数、肝肾功能标志物或心肌酶水平异常，主要器官组织病理学未见明显组织损伤或形态异常，示良好生物相容性和初步安全性。局限性包括脂质体在中性粒细胞和微胶质细胞内的胞内运输途径和时空药物释放行为尚待阐明；脂质体组分尤其SA衍生物和PS的长期体内命运及重复给药后潜在免疫原性需系统评价；研究主要聚焦微胶质细胞焦亡和表型极化，对神经血管单元其他细胞组分包括星形胶质细胞和神经元的影响尚不清楚；其他调节性细胞死亡通路如凋亡和铁死亡对整体神经保护作用的潜在贡献值得进一步研究；未来可优先扩展该双靶向平台至其他神经疾病如阿尔茨海默病和多发性硬化等神经炎症条件下的靶向药物递送。结论部分译为：研究人员开发了双配体脂质体系统，实现中性粒细胞和微胶质细胞的序贯靶向，以高效共递送ART和EDV至缺血脑组织；该策略利用内源性炎症反应促进BBB穿越及随后靶向缺血灶内效应细胞；该系统通过抑制NLRP3炎症小体活化和微胶质细胞焦亡同时促进微胶质细胞向抗炎、组织修复性M2样表型极化而发挥强效神经保护；该工作不仅为IS提供有效联合纳米治疗，也提供有潜力用于其他神经炎症疾病治疗的多功能纳米递送平台；通过整合智能生物材料设计与多靶点药理学，结果突显病理响应性纳米医学平台干预复杂神经疾病的治疗前景。
