异物反应与生物材料相关感染免疫细胞时空分布的活体成像小鼠模型概念验证

《Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials》：Proof-of-Concept of an Intravital Murine Model to Observe the Spatiotemporal Distribution of Immune Cells Constituting the Foreign Body Response and Biomaterial Associated Infections

　　

生物材料越来越多地用于人类永久性植入以替代身体部位。生物材料植入常并发慢性免疫激活、异物反应（foreign body response, FBR）和生物材料相关感染（biomaterial-associated infections, BAI）。虽然生物材料设计日益关注免疫调节，但预测复杂的生物学结果仍然具有挑战性。现有模型通常针对单一细胞类型或分子参数，忽视了定义FBR的动态空间和时间相互作用。在此，研究人员建立了一种活体“通过窗口观察FBR”模型，将小鼠腹部成像窗口的内表面设置为未涂层或生物材料涂层，从而能够对同一只小鼠的深层组织进行纵向显微镜观察。利用带有荧光探针的转基因小鼠，巨噬细胞或中性粒细胞、肌成纤维细胞和胶原蛋白被同时可视化。在存在和不存在BAI的情况下，观察到不同细胞类型的独特时空模式：巨噬细胞和中性粒细胞定位于窗口附近，随后在深度上为肌成纤维细胞和胶原蛋白，其深度和数量随时间纵向变化。该模型能够对FBR和BAI进行综合研究，增进对体内宿主-生物材料相互作用的理解。

生物材料在人体永久性植入中的使用日益广泛，用于恢复解剖形态和生理功能，但植入物常因异物反应（foreign body response, FBR）和生物材料相关感染（biomaterial-associated infections, BAI）而引发并发症。FBR是免疫介导的级联事件，BAI源于细菌黏附于材料表面。仅凭材料表面物理化学特性难以预测体内生物学反应，因为植入部位微环境复杂。现有离体组织学方法无法动态观察FBR，许多体内模型仅聚焦细胞因子等分子参数，缺乏时间与空间信息。尽管双光子活体显微镜已应用于实验动物，但既有成像窗模型因窗口本身为异物而引入额外炎症；背侧皮褶腔模型使皮肤与周围组织隔离，并对动物造成物理负荷。FBR的时空维度中，时间维度研究较多，空间维度明显不足。因此，需要一种能够纵向、三维观察宿主-生物材料相互作用的体内模型。

为此，研究人员建立了一种“通过窗口观察FBR”的活体成像模型。该模型将用于腹部成像的钛环玻璃窗植入小鼠侧腹，窗内表面本身作为实验对象，可保持未涂层或涂覆生物材料（如I型胶原），使窗口自身成为待研究的异物，同时作为透明光学接口。通过结合转基因小鼠和荧光标记抗体，研究人员在双光子显微镜下实现了巨噬细胞、中性粒细胞、肌成纤维细胞、胶原蛋白和细菌的可视化，并在空间和时间维度上纵向定量分析。该模型允许同一动物在多个时间点重复成像，直接观察FBR和BAI的演化过程，并发现巨噬细胞和中性粒细胞主要靠近窗口分布，而肌成纤维细胞与胶原则位于更深层，且随时间和感染状态动态变化。这一模型为综合研究宿主-生物材料相互作用提供了新平台，有助于减少实验动物用量并推动体内研究的发展。

研究人员使用了三种小鼠品系：MaFIA小鼠（21只，CD115+细胞表达eGFP）、αSMA小鼠（11只，肌成纤维细胞表达DsRed）和野生型C57BL/6J小鼠（18只）。关键技术方法包括：窗口的胶原涂层与无菌处理；手术植入与固定；两种细菌接种方式（窗口预污染1.8×10⁷细菌/cm²或术后注射10⁷细菌）；低剂量荧光标记抗体（F4/80、Ly6G）尾静脉注射；双光子激发（840 nm和1050 nm）并采集Z系列图像；基于Ilastik和CellProfiler的自动化图像分析；扫描透射电子显微镜（STEM）验证组织学结构。该模型显著减少了研究所需的动物数量，例如分析一个材料在5个时间点使用5只/组，终点法需25只，而纵向成像仅需5只。

结果如下：

3.1 窗口成像模型
植入后肉眼可见组织向玻璃窗生长和新生血管形成。使用特制固定夹可稳定小鼠，但呼吸伪影和窗口微倾斜难以完全避免。无菌窗口在MaFIA小鼠中保留率良好，3/4窗口保持至第20天；感染模型中窗口脱落发生于第9-17天。根据窗口保留曲线和慢性FBR研究需求，确定最大观察时限为14天。

3.2 使用转基因小鼠模型成像细胞
MaFIA小鼠中，巨噬细胞在植入后前8天出现明显涌入，第11天出现扩散和成簇。胶原涂层不干扰荧光信号，但细胞簇出现时间从第8天延至第13天，说明涂层可改变细胞行为。αSMA小鼠中，肌成纤维细胞首次在第6天检测到，第2天几乎不存在。二次谐波（SHG）成像在第2天检测到胶原信号，但根据纤维形态和深度判断为预先存在的筋膜胶原；第6天窗下胶原消失，第10和14天细纤维再现，提示新胶原沉积。

3.3 使用荧光探针成像细胞
为在野生型和αSMA小鼠中标记巨噬细胞和中性粒细胞，研究人员优化了抗体剂量和给药时间。F4/80-FITC和Ly6G-Atto390的最佳剂量为10 μg/只，给药后24小时成像可获得清晰信号；注射后5天信号消失，因此需每次成像前重新注射。同时注射两种抗体引起小鼠短暂嗜睡，且Atto390与FITC发射光谱重叠，故未在同一小鼠中同时标记两种细胞。将F4/80抗体从FITC改为Atto390可减少绿色自发荧光干扰，获得可比图像。

3.4 生物材料相关感染成像
将mCherry表达金黄色葡萄球菌预污染到窗口上（1.8×10⁷/cm²）后，细菌与巨噬细胞共定位，在胶原涂层窗口上多位于巨噬细胞簇周边。注射10⁷细菌入窗下，感染第8天消退后第14天复现；注射方式未观察到巨噬细胞簇形成，而预污染方式则有。该模型未进行CFU计数和多种菌株扩展研究，但证明了同时研究BAI的可行性。

3.5 窗口下方细胞时空涌入的定量
研究人员建立了基于机器学习的图像分析流程。细胞计数验证精度分别为：巨噬细胞82%、中性粒细胞96%、肌成纤维细胞58%。定量结果显示，第6天肌成纤维细胞贴近窗口，第14天扩展至300 μm深度；感染条件下肌成纤维细胞仅在第6天检出。巨噬细胞在无菌和感染条件下于第6和第10天主要位于0-60 μm深度；中性粒细胞主要在最初几天出现。这些发现与离体组织学文献一致：巨噬细胞靠近材料，肌成纤维细胞分布在较远处。STEM图像进一步证实胶原束深层分布和免疫细胞贴近材料表面，以及感染导致的组织学改变。

3.6 模型考虑
该模型的优点是可纵向分析同一动物，实时获取三维信息，减少动物用量。但存在限制：无真正假手术对照（窗口本身即异物）；成像深度和分辨率随深度下降（约100-200 μm内）；重复麻醉可能影响炎症；窗口暴露筋膜，可能不适用于其他解剖部位。尽管有这些限制，模型适用于比较不同涂层或材料对细胞动态的影响。

讨论部分强调，该模型揭示了FBR和BAI中细胞分布随时间和深度的动态变化，深化了对宿主-生物材料相互作用的理解。与终点法相比，该模型可捕捉急性炎症向早期慢性FBR的转变，包括肌成纤维细胞出现和胶原沉积。未来可通过改进检测器和光学系统进一步提高分辨率，实现细胞分割和形态分析。该研究结论为：本研究提出一种活体成像模型，旨在增强生物材料研究从体外到体内的可转化性，能够直接分析异物反应的时空动态，同时允许研究生物材料相关感染。不同于传统终点分析，该模型捕捉了细胞浸润和组织结构随时间及距生物材料距离的变化，提供了此前未见报道的动态视角。研究人员将转基因小鼠与荧光抗体标记相结合，成功可视化细菌、巨噬细胞、中性粒细胞、肌成纤维细胞和胶原，植入的窗口同时充当异物和永久性透明光学接口。窗口表面的功能化或涂层可在保持足够透明度的前提下直接评估生物材料表面特性对细胞浸润的调节作用。该一体化设计便于在同一平台中同时研究FBR涉及的多种细胞类型及其相互作用，并纵向追踪FBR和BAI，为阐明潜在机制和开发预防或治疗生物材料相关并发症的新策略提供了强大平台。