《Journal of Extracellular Biology》：Hypoxic Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes Release Large Extracellular Vesicles That Promote a Pro-Inflammatory Phenotype in Macrophages
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心肌梗死后即刻，心肌组织释放信号触发急性炎症反应以清除碎片并启动心脏修复。然而，持续性炎症可能长期驱动不良重构和心力衰竭。因此，理解心肌梗死（MI）后急性和慢性炎症的机制对于开发靶向治疗至关重要。细胞外囊泡（EVs）通过携带多种生物分子（如蛋白质）介导细胞间通
心肌梗死后即刻，心肌组织释放信号触发急性炎症反应以清除碎片并启动心脏修复。然而，持续性炎症可能长期驱动不良重构和心力衰竭。因此，理解心肌梗死（MI）后急性和慢性炎症的机制对于开发靶向治疗至关重要。细胞外囊泡（EVs）通过携带多种生物分子（如蛋白质）介导细胞间通讯，影响受体细胞行为。心肌细胞来源EVs（CM-EVs）已知在MI后心脏修复和心力衰竭进展中发挥作用。然而，关于CM-EV亚群及其如何调节梗死后炎症知之甚少。本研究表明，人CM-EV亚群可调节巨噬细胞表型。研究人员鉴定了三种EV亚群，由其沉降系数定义，具有不同的密度和蛋白质组谱，由人诱导多能干细胞来源心肌细胞（hiPSC-CMs）释放。通过差异超速离心条件培养基收集的2K、10K和100K沉淀分别富集于肌节组分、代谢蛋白和参与质膜转运的蛋白。蛋白质组学分析揭示缺氧改变含EV沉淀的蛋白质组，富集参与细胞应激反应的蛋白，如分子伴侣、核糖体、蛋白酶体和代谢蛋白。接下来，研究人员观察到常氧和缺氧CM-EVs均被巨噬细胞内化，且缺氧10K沉淀诱导这些细胞的促炎表型。未来研究应阐明CM-EVs是否在体内 contribute to MI后过度炎症和不良心脏重构，以及是否可通过阻断特定CM-EV亚群的释放来调节。
心肌梗死（MI）后短期死亡率因过去几十年的医学进步而显著下降。然而，许多患者经历不良重构和进行性心力衰竭，这取决于梗死面积和心脏修复反应的质量。MI由冠状动脉阻塞引起，最终导致心肌组织缺血和坏死。缺血发生时，心肌细胞释放损伤相关分子模式（DAMPs），通过与存活心脏细胞和浸润炎症细胞上的模式识别受体（PRRs）相互作用启动炎症反应。对急性心肌损伤的免疫反应是一个协调过程，其中促炎细胞因子和趋化因子首先招募中性粒细胞和单核细胞，随后巨噬细胞介导清除坏死细胞并招募适应性免疫细胞。随后，来自巨噬细胞的抗炎信号促进组织修复，包括通过分泌纤维化和血管生成因子刺激成纤维细胞和内皮细胞增殖。因此，巨噬细胞作为初始炎症反应和随后修复阶段的核心调节者，协调组织损伤与修复之间的平衡。巨噬细胞和其他免疫细胞的持续或失调激活可导致不良左心室重构和心力衰竭。因此，梗死后心肌修复需要急性炎症反应的迅速激活，随后其消退并过渡到修复状态。早期试验显示免疫治疗对心血管患者具有潜在益处，尽管与致命感染发生率较高相关。为克服这一障碍，迫切需要理解MI后急性和慢性炎症的生物学机制以开发更精准的治疗。
细胞外囊泡（EVs）是细胞产生的膜囊泡，在稳态和疾病中发挥细胞间通讯作用。EVs大小不一，可携带多种生物分子，如蛋白质和RNA，反映来源细胞的生理状态。它们可将生物物质转移至受体细胞并影响其行为。心肌细胞来源EVs（CM-EVs）已知在MI后促进心脏修复和心力衰竭进展，例如通过促进血管生成、纤维化和脂肪细胞内质网应激。在小鼠中，MI后左心室EV释放在前24小时内增加，主要来源于心肌细胞，大型心脏EVs诱导心脏单核细胞炎症反应。此外，MI后释放的循环EVs携带心肌微小RNAs（miRNAs），优先到达骨髓，其中miRNAs下调CXCR4表达并动员骨髓祖细胞。循环EVs还据报道在MI期间将CM来源miRNAs从心脏运输至肺，在那里上调内皮黏附分子并促进促炎单核/巨噬细胞浸润。除这些病理作用外，心肌细胞通过一种称为exophers的大型EV亚型将受损线粒体释放到细胞外空间，随后由组织驻留巨噬细胞通过异噬作用清除，维持心脏稳态。此外，MI和溶酶体功能受损增加含线粒体心脏EVs的数量。总之，临床前研究表明CM-EVs在稳态和MI后发病机制中发挥关键作用。最近，给予tipifarnib（一种EV释放抑制剂）在心脏压力超负荷小鼠模型中显示出有希望的结果，通过减少循环EVs从而减少左心室功能障碍和纤维化。这突显了EV分泌调节作为心力衰竭治疗策略的潜力。
尽管越来越多的证据表明CM-EVs协调MI后心脏修复和炎症，但对其调控机制知之甚少。大多数研究集中在CM-EVs的miRNA谱上，但有人提出主要来自坏死细胞的蛋白质负责启动巨噬细胞炎症，且缺血CM-EV表面蛋白参与巨噬细胞激活。此外，关于CM-EVs对巨噬细胞影响的研究主要集中在促炎或抗炎标志物上，未提供对巨噬细胞极化影响的概述或区分EV异质性。最后，大多数研究使用小鼠模型，可能不总能准确反映人类生物学，阻碍了这些发现的转化相关性。
本研究旨在进一步阐明CM-EVs在人类背景下缺氧期间调节炎症的作用。为此，研究人员使用人诱导多能干细胞来源心肌细胞（hiPSC-CMs）研究由其沉降系数定义的CM-EV亚群。研究人员进行蛋白质组学研究缺氧如何影响含CM-EV沉淀的蛋白质组。接下来，研究人员通过修饰hiPSC-CMs表达肉豆蔻酰化-NanoLuc（一种定向至EV膜的明亮荧光素酶）来检测巨噬细胞中的CM-EVs，通过生物发光实现。最后，研究人员采用转录组学探究常氧和缺氧含CM-EV沉淀如何影响人单核细胞来源巨噬细胞。本研究表明hiPSC-CMs释放具有不同蛋白质组谱的EV亚群，缺氧后发生变化，富集分子伴侣、核糖体、蛋白酶体和代谢蛋白。研究人员观察到常氧和缺氧含CM-EV沉淀均被巨噬细胞摄取，且缺氧10K沉淀驱动巨噬细胞向促炎极化。
技术方法概述：研究使用健康对照hiPSC系（SCVI-273）分化心肌细胞并代谢成熟至少21天。通过差异超速离心（dUC）分离条件培养基中EV亚群（2K、10K、100K沉淀），采用透射电子显微镜（TEM）、纳米颗粒跟踪分析（NTA）和蛋白质印迹（WB）表征。使用碘克沙醇密度梯度超速离心进一步分离EV与非囊泡颗粒。通过LC-ESI-MS/MS进行蛋白质组学分析，使用Vesiclepedia数据库比较，Enrichr进行基因本体（GO）分析。构建肉豆蔻酰化-HA-NanoLuc（Myr-NL）慢病毒质粒转导hiPSC-CMs，通过生物发光检测EV摄取。人单核细胞来源巨噬细胞从健康供体外周血分离（UMC Utrecht METC 07–125/O伦理批准），用M-CSF分化6天。RNA测序使用CEL-Seq协议，DESeq2分析差异基因表达，clusterProfiler进行基因集富集分析（GSEA）。RT-PCR验证IL1-β和CXCL5表达。
结果部分：
2.1 hiPSC-CMs释放不同EV亚群：通过dUC分离条件培养基获得2K、10K和100K沉淀。TEM显示所有沉淀中均有膜囊泡，100K沉淀中囊泡更多更小。NTA显示三个沉淀主要尺寸范围80-200 nm，100K沉淀颗粒浓度最高。WB显示膜联蛋白A1在所有沉淀中表达，小EV标志物syntenin和CD81在100K沉淀中富集，细胞标志物GM130缺失表明EV纯度。线粒体标志物ATP5A在所有三个沉淀中检测到。密度梯度超速离心显示syntenin和CD81在100K沉淀低密度组分（1.09-1.12 g/mL）中检测到，膜联蛋白A1在不同沉淀中显示不同密度谱，ATP5A主要存在于2K沉淀密度1.12-1.18 g/mL组分中。结果表明hiPSC-CMs释放具有不同尺寸分布、蛋白质组成和密度谱的EVs。
2.2 hiPSC-CMs释放具有不同蛋白质谱的EV亚群：对每个沉淀进行质谱分析，仅包括在至少两个生物学重复中检测到的蛋白质。排除非条件培养基中检测到的蛋白质后，在2K、10K和100K沉淀中分别鉴定68、120和368种不同蛋白质。与Vesiclepedia数据库比较显示大多数蛋白质先前已在EVs中鉴定。GO分析显示2K沉淀独特蛋白与肌节相关，10K沉淀与代谢过程相关，100K沉淀与EV生物发生中货物分选及整合素相关。100K沉淀中顶级GO术语蛋白进一步分析揭示某些蛋白参与内吞循环、细胞钾/钠稳态和桥粒组装。总之，基线条件下hiPSC-CMs释放具有不同蛋白质组谱的异质性EV亚群，可能支持心肌细胞稳态并调节其与巨噬细胞的相互作用。
2.3 缺氧改变CM-EVs蛋白质谱：48小时缺氧暴露增加100K沉淀颗粒数。质谱分析显示缺氧强烈增加2K和100K沉淀中检测到的不同蛋白质数量，同时减少10K沉淀中发现的蛋白质数量。缺氧期间2K沉淀蛋白质组显示最大改变，约10%蛋白质与常氧重叠，10K和100K沉淀重叠分别为50%和35%。GO分析显示缺氧期间2K和100K沉淀共享核糖体、肌节和蛋白酶体蛋白，参与翻译、心脏收缩和泛素标记蛋白降解。分子伴侣和代谢酶在所有沉淀中发现。WB验证显示分子伴侣CRYAB和HSP70在缺氧EV样本中更丰富，糖酵解酶PFKM在缺氧期间EVs中表达更高，线粒体标志物ATP5A及膜联蛋白V和A1在所有含EV沉淀中缺氧应激下增加，小EV标志物CD81在缺氧100K中增加。总之，缺氧增强人含CM-EV沉淀的蛋白质多样性，可能影响CM-EV与巨噬细胞的相互作用。
2.4 CM-EVs被人巨噬细胞摄取：研究人员使用Myr-NL报告基因修饰hiPSC-CMs分泌标记CM-EVs。免疫荧光显微镜确认报告基因主要在质膜和核膜检测到。dUC分离EVs测量每个沉淀发光显示2K和100K沉淀发光相似，尽管100K沉淀颗粒数多15倍。常氧和缺氧条件下沉淀显示相似发光值。巨噬细胞在37°C或4°C（阴性对照）与CM-EVs孵育6小时，测量NanoLuc发光评估摄取。结果显示巨噬细胞与2K和100K沉淀在37°C孵育相比4°C摄取增加，表明这些含EV沉淀被主动摄取。巴弗洛霉素处理增加所有常氧和缺氧含CM-EV沉淀发光，表明对照条件下部分EV内容物导向溶酶体降解。总之，CM-EVs与巨噬细胞相互作用并被内化。
2.5 缺氧10K沉淀诱导人巨噬细胞促炎表型：人原代巨噬细胞与常氧或缺氧hiPSC-CMs条件培养基分离的CM-EVs孵育24小时，RNA测序分析转录组基因谱。非条件培养基沉淀用于控制培养基影响，PBS处理巨噬细胞作为阴性对照。结果显示缺氧10K和较小程度100K沉淀改变巨噬细胞基因表达谱。GO分析显示缺氧10和100K沉淀下调有丝分裂通路，但常氧和缺氧100K沉淀显示与非条件对照相似效果。相反，缺氧10K沉淀诱导更强且缺氧特异性炎症信号反应激活。差异基因表达分析发现缺氧10K处理巨噬细胞中897个差异上调基因。GSEA识别多个与炎症反应相关上调通路，中性粒细胞趋化性作为顶级生物过程，趋化因子CCL23、CXCL5和CCL7及警报素S100A8强烈上调。其他富集炎症通路包括对IL-1、IFN-γ、LPS和TNF的反应。这些通路共同因子是I-kappaB激酶/NF-kappaB信号通路。TLR8和MYD88上调进一步强调其在中介MI后炎症反应中的核心作用。RT-PCR验证显示缺氧10K沉淀显著上调巨噬细胞中IL1-β和CXCL5，而2和100K沉淀未显示这些基因表达显著变化。总之，缺氧10K沉淀刺激巨噬细胞采用促炎表型，与经典MI后炎症反应一致，可能由该含EV沉淀中DAMPs触发。
讨论部分总结：MI后急性炎症反应中免疫细胞包括巨噬细胞浸润缺血组织清除凋亡细胞并促进炎症支持心脏修复。CM-EVs调节此过程，但其在人类MI后炎症中的作用仍不清楚。本研究使用hiPSC-CMs作为体外模型检查缺氧期间CM-EV亚群释放及其对原代单核细胞来源巨噬细胞的影响。hiPSC-CMs释放三种不同EV亚群，具有不同密度和蛋白质组谱。缺氧改变CM-EV蛋白质组，富集与细胞应激反应相关蛋白包括分子伴侣、核糖体、蛋白酶体和代谢蛋白。此外，巨噬细胞内化常氧和缺氧CM-EVs，缺氧10K沉淀促进促炎巨噬细胞表型。这表明心肌细胞和巨噬细胞可通过EVs通讯，提示CM-EVs可能影响MI后炎症。关于2K亚群知之甚少，除外小鼠心肌细胞在exophers中释放线粒体和肌节片段可能存在于2K沉淀中。代谢蛋白参与丙酮酸代谢和糖酵解主要位于10K沉淀。100K沉淀含蛋白质运输至质膜和整合素介导信号关键蛋白。缺氧增加人CM-EVs蛋白质多样性，可能影响其与巨噬细胞相互作用和效果。这些缺氧CM-EVs作为DAMPs载体包括组蛋白和热休克蛋白，被巨噬细胞PRRs识别诱导促炎表型。有趣的是，虽然缺氧10K沉淀诱导巨噬细胞促炎信号，蛋白质组分析未鉴定10K缺氧沉淀中独有蛋白质可解释此效果。这表明观察到的选择性巨噬细胞激活可能源于已鉴定蛋白质组之外组分，如线粒体DNA、代谢物和氧化磷脂或其他脂质。小鼠和斑马鱼模型揭示心肌细胞可通过EVs与心脏巨噬细胞相互作用并转移物质。本研究证明人巨噬细胞摄取CM-EVs。尽管常氧和缺氧含CM-EV沉淀摄取相当，缺氧10K沉淀通过上调炎症信号基因包括CXCL5和CXCL1（有效中性粒细胞趋化剂）诱导人巨噬细胞促炎表型，提示在MI后早期炎症反应中潜在作用。未来研究应阐明CM-EVs是否在体内导致MI后过度炎症和不良心脏重构，以及是否可通过选择性调节或抑制特定CM-EV亚型来减轻这些效果。本研究聚焦人单核细胞来源巨噬细胞，但它们未完全重现组织驻留心脏巨噬细胞生物学。此外其他免疫细胞群体包括循环单核细胞、中性粒细胞和T细胞在MI后炎症和修复中发挥重要作用，其与CM-EVs相互作用值得进一步研究。EV领域主要技术挑战是EV分离方法可共富集非囊泡组分。本研究密度梯度超速离心证明dUC沉淀含密集组分未进一步表征。由于密集组分未通过超微结构成像表征，非囊泡污染物存在不能正式排除。总之，研究发现揭示人CM-EVs在基线和缺氧条件下释放具有不同蛋白质组的EV亚群并与巨噬细胞相互作用。CM-EVs调节巨噬细胞表型，特别是缺氧10K沉淀可能在MI后早期炎症反应中发挥重要作用。虽然心脏炎症对修复至关重要，但过度和持续炎症可加剧心脏损伤导致心力衰竭。未来研究应阐明CM-EVs是否在体内导致MI后过度炎症和不良心脏重构，以及是否可通过阻断特定CM-EV亚群释放来调节。
