髓系来源ITGAM+细胞外囊泡经S100a9介导的代谢重编程触发急性肾损伤中CD8+T细胞活化

《Journal of Extracellular Vesicles》：ITGAM+ Extracellular Vesicles Trigger CD8+ T Cell Activation via S100a9-Mediated Metabolic Reprogramming in Acute Kidney Injury

　　

急性肾损伤（AKI）是一种临床常见综合征，治疗选择有限，其中炎症驱动的持续性肾损伤仍是核心病理挑战。本研究鉴定了一个特定的细胞外囊泡（EVs）亚群，作为将早期髓系炎症转化为代谢驱动的CD8⁺T细胞致病性的关键纽带。研究人员在小鼠缺血-再灌注损伤模型中采用邻近条形码检测（PBA）进行单囊泡表面蛋白质组学分析，绘制了肾脏EVs图谱，发现损伤后丰度显著增加的髓系来源ITGAM⁺EVs亚群。利用遗传性增强ITGAM⁺EVs释放的CD63-PAGFP^ITGAM-KI报告小鼠，研究人员进一步验证了这些EVs在肾脏淋巴微环境中与CD8⁺T细胞相互作用，驱动其促炎性活化。蛋白质组学分析确定S100a9为这些ITGAM⁺EVs上的功能性货物。在机制上，EVs递送的S100a9稳定了受体CD8⁺T细胞中的线粒体天冬氨酸-谷氨酸载体Slc25a12，从而增强谷氨酸代谢以驱动致病性转录程序。使用tasquinimod对S100a9进行药理学抑制，联合骨髓来源髓系细胞中S100a9的遗传缺失，确立了EV相关S100a9在驱动CD8⁺T细胞活化中的必要性。研究结果确立了ITGAM⁺EVs作为AKI中促代谢和促炎信号的重要介质，并强调S100a9–Slc25a12轴作为拦截无菌性炎症的有前景的治疗靶点。

急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）是住院患者中高发的临床综合征，死亡率高，目前临床管理仅限于血流动力学优化和肾脏替代等非特异性干预，靶向治疗手段匮乏，其根本原因在于对致病机制认识不足。损伤肾细胞释放的危险相关分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs）启动由固有免疫细胞驱动的无菌性炎症级联反应，进而 orchestrate 适应性免疫应答，其中CD8⁺T细胞的致病性活化是加重肾小管损伤和阻碍肾脏恢复的关键因素。然而，经典T细胞活化模型要求抗原提呈细胞（antigen-presenting cells，APCs）与T细胞直接接触，无法完全解释急性损伤后肾实质内T细胞的极早期浸润和活化现象。细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）作为细胞间通讯的关键介质，能够保护其内容物并靶向递送至受体细胞，但EVs介导的通讯是否在AKI等无菌性组织损伤中发挥作用尚不清楚。传统bulk EV分析掩盖了EV异质性，无法区分不同囊泡亚群的功能。为此，研究人员采用邻近条形码检测（proximity barcoding assay，PBA）在单囊泡水平解析缺血-再灌注损伤诱导的AKI肾脏免疫微环境，通过聚类分析发现损伤后肾脏中ITGAM⁺EV亚群显著增加，并阐明了其髓系细胞来源和免疫调节功能；通过构建遗传报告小鼠模型，在体内可视化ITGAM⁺EVs与CD8⁺T细胞的相互作用；机制上，ITGAM⁺EVs将货物蛋白S100a9递送至CD8⁺T细胞，通过Slc25a12依赖性线粒体氨基酸转运促进线粒体代谢，从而促进T细胞活化。研究结论表明，髓系来源的ITGAM⁺EVs通过S100a9-Slc25a12介导的线粒体代谢途径启动AKI中致病性T细胞的早期活化，为AKI发病机制提供了关键见解，并确立了治疗干预的靶点。该研究发表于《Journal of Extracellular Vesicles》。

研究人员为开展此项研究，主要采用了以下关键技术方法：单囊泡表面蛋白质组学PBA技术（基于DNA条形码邻近连接，使用264种膜相关抗体面板）对小鼠单侧缺血-再灌注损伤（unilateral ischemia-reperfusion injury，uIRI）模型肾脏来源EVs进行单囊泡分辨率分析；构建CD63-PAGFP^ITGAM-KI条件性报告小鼠（通过CRISPR-Cas9技术将CAG-LSL-mCd63-PA-GFP-WPRE-polyA盒定点插入H11位点，与Itgam-iCre小鼠杂交）以追踪和增强ITGAM⁺髓系细胞来源EVs的释放；免疫磁珠分选ITGAM⁺EV亚群；蛋白质组学分析（包括单囊泡表面蛋白质组、ITGAM⁺EV bulk蛋白质组和免疫共沉淀-质谱联用IP-MS）；dSTORM超分辨率成像和活细胞成像；以及活体肾脏切片实时成像。研究使用的小鼠模型包括uIRI模型（肾脏蒂夹闭35 min再灌注）、顺铂诱导AKI模型（单次腹腔注射5 mg/kg）和双侧IRI模型。S100a9全身敲除小鼠（C57BL/6JSmo-S100a9^em1Smoc）及同窝野生型对照用于遗传功能缺失实验。药理学干预采用S100a9抑制剂tasquinimod（1 mg/kg/d，灌胃）。ITGAM体内中和采用抗小鼠/人CD11b抗体（克隆M1/70，500 μg/只，腹腔注射）。公共单细胞RNA测序数据集GSE267242用于验证Itgam转录本表达。

研究结果如下：

3.1 IRI-AKI后EVs相关免疫微环境图谱。通过PBA对单囊泡表面蛋白质组进行 profiling，发现IRI组肾脏EVs的蛋白/EV比值显著升高，EV组成发生重塑，表现为免疫细胞来源EVs比例显著增加，尤其是M1巨噬细胞、树突状细胞和中性粒细胞来源EVs，效应淋巴细胞（CD4⁺T、CD8⁺T和B细胞）来源EVs比例亦升高，而多数肾脏驻留细胞来源EVs比例下降。表明损伤后肾脏EV相关微环境以浸润免疫细胞（尤其是髓系免疫细胞）来源EVs比例显著增加为特征。

3.2 髓系来源ITGAM⁺sEV亚群在IRI肾脏中扩增。利用PBA单EV分辨率矩阵进行无监督聚类，鉴定出8个以1-2个表面标志物定义的EV亚群，其中仅表达髓系标志物ITGAM的EV亚群为最优势亚群之一。Western blot和纳米流式细胞术验证IRI组ITGAM⁺sEV增加。细胞来源解卷积显示ITGAM⁺sEV主要来源于巨噬细胞（F4/80）和树突状细胞（CD11c），中性粒细胞（Ly6G）贡献较少。组织染色证实IRI肾脏中ITGAM与F4/80、CD11c和Ly6G⁺髓系细胞共定位增加。公共单细胞RNA测序数据证实Itgam转录本在损伤肾脏中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞群中高表达。表明IRI-AKI诱导以浸润髓系细胞为主要来源的ITGAM⁺sEV亚群扩增。

3.3 ITGAM⁺sEV驱动CD8⁺T细胞活化。差异蛋白质组学分析显示IRI组肾脏EVs中14种蛋白上调，功能主要与免疫细胞黏附、内皮黏附和中性粒细胞细胞毒性反应相关，GO生物学过程富集于T细胞介导的细胞毒性、细胞杀伤正调控和內源性抗原的MHC I类途径加工提呈。体外实验表明，IRI肾脏纯化的ITGAM⁺sEV而非ITGAM^?sEV或sham组ITGAM⁺sEV，增强CD8⁺T细胞增殖并促进TNF-α和IFN-γ分泌、抑制IL-10分泌。体内ITGAM中和抗体预处理显著减轻肾损伤、减少CD8⁺T细胞浸润和IFN-γ产生、降低IL-1β和IL-6转录。表明ITGAM⁺sEV是驱动CD8⁺T细胞活化的肾脏免疫微环境独特亚群。

3.4 体内遗传性增强内源性ITGAM⁺EV分泌驱动CD8⁺T细胞活化。成功构建CD63-PAGFP^ITGAM-KI报告小鼠，IRI后肾脏ITGAM和CD63表达上调，荧光NTA和纳米流式细胞术显示PA-GFP⁺颗粒丰度显著增加。CD63-PAGFP^ITGAM-KI小鼠IRI后第1天肾损伤加重（肾小管损伤评分升高、TUNEL⁺凋亡细胞增多），炎症加剧（CD8⁺T细胞浸润增加、IL-1β和IL-6转录上调），流式细胞术证实CD8⁺T细胞比例和IFN-γ产生细胞增加。双侧IRI模型中血清肌酐和血尿素氮显著升高。表明体内ITGAM⁺sEV扩增导致AKI后CD8⁺T细胞活化增强。

3.5 动态可视化揭示ITGAM⁺sEV与CD8⁺T细胞在肾脏淋巴微环境中的活跃相互作用。活体成像显示ITGAM⁺sEV^IRI（PA-GFP⁺）和CD8⁺T细胞在肾脏淋巴管（LYVE-1⁺）周围区域显著增加且频繁共现。活肾脏切片时间序列成像观察到两种CD8⁺T细胞与PAGFP标记sEV相互作用的行为：携带PAGFP⁺sEV的CD8⁺T细胞从淋巴管周围间质迁移进入淋巴管腔，或CD8⁺T细胞从淋巴管退出以寻找并内化PAGFP⁺sEV。sham对照组未检测到PAGFP⁺sEV，淋巴管内CD8⁺T细胞未见跨膜迁移。表明肾脏淋巴管可能是ITGAM⁺髓系细胞来源sEV主动调控CD8⁺T细胞运输和编程的重要生态位。

3.6 表面S100a9作为ITGAM⁺sEV功能性货物负责IRI-AKI中CD8⁺T细胞活化。对磁珠分选的ITGAM⁺sEV进行蛋白质组学分析，发现S100a9是IRI组较sham组最显著上调的蛋白，层次聚类分析亦显示S100a9为排名最高的差异表达蛋白。免疫电镜证实S100a9主要展示于EV表面，dSTORM超分辨率成像可视化单个ITGAM⁺sEV上的S100a9分子。纳米流式细胞术显示完整与透化条件下S100a9⁺CD63⁺颗粒比例相当（4.51% vs. 4.66%，p = ns），表明S100a9主要位于EV表面。酶解表面蛋白显著降低ITGAM⁺sEV^IRI诱导的CD8⁺T细胞IFN-γ产生。tasquinimod药理学抑制S100a9同样减弱ITGAM⁺sEV诱导的IFN-γ和TNF-α上调，同时增加调节性细胞因子IL-10水平。等分子浓度下ITGAM⁺sEV^IRI较可溶性重组S100a9（solS100a9）更强地诱导CD8⁺T细胞IFN-γ产生，表明EV相关背景是S100a9最大促炎活性所必需。S100a9敲除小鼠来源ITGAM⁺sEV^{IRI（S100a9-KO）}较野生型显著减弱CD8⁺T细胞活化。体内CD63-PAGFP^ITGAM-KI小鼠IRI前给予tasquinimod，显著减轻间质炎症、肾小管损伤、凋亡细胞、CD8⁺T细胞浸润及IL-1β和IL-6下调，流式细胞术证实肾脏CD8⁺T细胞和IFN-γ产生减少。IRI后第7天tasquinimod持续减轻CD8⁺T细胞积聚。顺铂诱导肾毒性模型中tasquinimod同样减轻肾脏炎症反应。表明ITGAM⁺sEV^IRI表面表达的S100a9是增强CD8⁺T细胞效应功能的关键组分，且跨不同AKI病因通用。

3.7 ITGAM⁺EV递送的S100a9与CD8⁺T细胞线粒体Slc25a12相互作用。对ITGAM⁺sEV^IRI处理的CD8⁺T细胞进行蛋白质组学分析，发现上调蛋白主要富集于线粒体代谢过程（ATP合成、三羧酸循环、呼吸链复合物组装），tasquinimod抑制S100a9后此效应消失。IP-MS鉴定Slc25a12（位于线粒体内膜的天冬氨酸/谷氨酸载体）为S100a9相互作用候选蛋白。活细胞成像观察到ITGAM⁺sEV^IRI（PKH67标记）接近、黏附于CD8⁺T细胞表面并被内化，随后定位于线粒体（MitoTracker标记）。dSTORM超分辨率成像显示内化EVs与线粒体外膜标志物TOMM20共定位。共聚焦成像显示ITGAM⁺sEV处理后S100a9与Slc25a12稳健共定位，tasquinimod处理后显著减弱。分子对接预测S100a9-Slc25a12稳定蛋白复合物形成，Co-IP实验验证二者物理相互作用。表明ITGAM⁺sEV递送的S100a9到达CD8⁺T细胞线粒体并与Slc25a12空间关联。

3.8 S100a9通过稳定Slc25a12促进CD8⁺T细胞线粒体氨基酸转运。体外tasquinimod处理降低ITGAM⁺sEV^IRI诱导的CD8⁺T细胞Slc25a12蛋白表达，表明S100a9为维持Slc25a12表达所必需。tasquinimod显著损害CD8⁺T细胞线粒体功能（ATP产生减少、NAD⁺/NADH比值降低）。S100a9抑制降低线粒体谷氨酸同时伴随胞质谷氨酸增加，与Slc25a12介导转运受损一致。siRNA介导Slc25a12敲低显著削弱ITGAM⁺sEV^IRI诱导的代谢增强。体内IRI后第1天口服tasquinimod减弱肾脏组织中S100a9与线粒体Slc25a12共定位，流式细胞术证实肾脏CD8⁺T细胞Slc25a12表达降低。表明S100a9通过稳定Slc25a12蛋白维持线粒体氨基酸转运能力，从而维持效应T细胞功能所需的增强代谢状态。

讨论部分总结：本研究通过单EV表面蛋白质组学描绘IRI诱导AKI中EV相关免疫微环境，鉴定髓系来源ITGAM⁺sEV为驱动CD8⁺T细胞活化的主要亚群。机制上，损伤肾脏ITGAM⁺sEV表面展示的S100a9通过稳定载体Slc25a12促进CD8⁺T细胞线粒体氨基酸转运，增强线粒体代谢，进而增强CD8⁺T细胞促炎功能。研究确立了ITGAM⁺sEV递送的S100a9稳定Slc25a12作为AKI中致病性CD8⁺T细胞活化的关键启动因素，强调其作为通过阻断固有与适应性免疫通讯的治疗靶点的潜力。研究提供了AKI中EV相关免疫景观的单EV分辨率图谱，超越浸润细胞和可溶性介质，为AKI免疫微环境组成提供了新见解。ITGAM⁺sEV与CD8⁺T细胞在淋巴管附近的空间互作代表了一种独特的固有-适应性免疫串扰信号模式，不同于易稀释降解的可溶性因子和需要直接持续物理接触的经典免疫突触。研究提出淋巴管周围ITGAM⁺sEV积聚建立滞留生态位，可能影响CD8⁺T细胞行为。机制上，S100a9作为经典DAMP通过TLR4和RAGE等表面受体驱动炎症，本研究揭示其经EVs递送至CD8⁺T细胞线粒体这一非经典细胞内功能，定义了ITGAM⁺sEV–S100a9–Slc25a12轴连接髓系细胞与CD8⁺T细胞线粒体代谢。Slc25a12作为线粒体天冬氨酸-谷氨酸载体，通过苹果酸-天冬氨酸穿梭支持氧化还原平衡和细胞呼吸，并提供谷氨酸前体支持活化T细胞克隆扩增和分化。药理学抑制S100a9（tasquinimod）在缺血-再灌注和顺铂诱导肾损伤中均减弱CD8⁺T细胞应答，骨髓来源髓系细胞S100a9遗传缺失在IRI模型中产生相当的保护效应，拓展了S100a9抑制剂的治疗原理。鉴于tasquinimod为细胞通透性小分子，研究人员提出其可中和DAMP信号并破坏EV递送S100a9在T细胞内的功能。研究结论翻译：通过整合单囊泡蛋白质组分析与功能验证，本研究确立了髓系来源ITGAM⁺sEV作为通过S100a9-Slc25a12介导的线粒体代谢启动AKI中致病性T细胞早期活化的关键介质，该轴的阐明为AKI发病机制提供了关键见解，并确立了治疗干预的靶点。