《The Journal of Gene Medicine》：MEF2A Promotes Keratinocyte Proliferation and Migration Under High-Glucose Conditions via Activation of the PI3K/AKT Signaling Pathway: Implications for Diabetic Wound Healing
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糖尿病创面愈合延迟是糖尿病的严重并发症，仍是临床难题。肌细胞增强因子2A（MEF2A）在肌肉特异性和/或生长因子相关转录中发挥作用，并参与细胞生长、存活与凋亡。为评估该转录因子在糖尿病创面愈合过程中对角质形成细胞的作用，研究人员开展了一系列体内与体外实验。研究
糖尿病创面愈合延迟是糖尿病的严重并发症，仍是临床难题。肌细胞增强因子2A（MEF2A）在肌肉特异性和/或生长因子相关转录中发挥作用，并参与细胞生长、存活与凋亡。为评估该转录因子在糖尿病创面愈合过程中对角质形成细胞的作用，研究人员开展了一系列体内与体外实验。研究发现，MEF2A在自发性2型糖尿病db/db小鼠模型的皮肤创面组织中表达上调。同样，MEF2A在高糖（HG）条件下的人角质形成细胞（HaCaT）中高表达。在HaCaT细胞中，过表达MEF2A可增强HG条件下的细胞增殖与迁移，并有效减轻HG诱导的凋亡，表现为抗凋亡蛋白Bcl-2上调、促凋亡蛋白Bax下调及caspase-3活性降低。此外，过表达MEF2A可提高HaCaT细胞中AKT的磷酸化水平。然而，使用PI3K/AKT通路抑制剂LY294002处理可逆转MEF2A对HaCaT增殖与迁移的有利作用。研究提示，过表达MEF2A可通过增强HaCaT细胞中AKT蛋白Ser473位点的磷酸化水平激活PI3K/AKT信号通路，从而调控HG条件下HaCaT细胞的增殖与迁移。这为糖尿病创面愈合提供了潜在的治疗靶点。
研究背景：糖尿病是以胰岛素分泌不足或靶器官对胰岛素敏感性下降为特征的代谢性疾病，全球患病率持续攀升，2019年估计为9.3%（约4.63亿人），预计2030年增至10.2%（5.78亿人），2045年达10.9%（7亿人）。慢性难愈性创面是糖尿病最常见的并发症之一，约影响25%的糖尿病患者，以愈合时间延长、管理困难、费用高昂、反复发作及致残致死率高为特征，严重损害患者生活质量并造成沉重经济负担。糖尿病创面愈合受损的机制尚未完全阐明，现有临床管理多依赖机械清创、血运重建、炎症控制和减压等局部治疗，但疗效常不理想，因此阐明其分子机制对开发促进难愈性创面愈合的新策略至关重要。创面愈合是包含炎症、增殖和组织重塑三个重叠阶段的复杂动态过程，增殖期的再上皮化是皮肤修复成功的关键决定因素，该过程依赖角质形成细胞的功能活动。损伤后角质形成细胞迅速活化，通过增殖、迁移、分化和基质重塑等行为参与组织修复。然而糖尿病状态下该愈合过程显著受损，临床研究显示糖尿病患者皮肤常出现明显表皮变薄，角质形成细胞不仅增殖能力降低，迁移功能也严重受损；高糖环境诱导角质形成细胞生理功能障碍，以氧化应激和炎症信号失调为特征，阻碍再上皮化，被认为是糖尿病创面延迟愈合的关键因素。因此，靶向增强角质形成细胞增殖与迁移是改善糖尿病创面愈合的潜在策略。MEF2A是MADS-box超家族的关键成员，作为重要转录因子，通过形成同源或异源二聚体结合靶基因启动子中的特定响应元件调控转录，参与多种细胞过程。其最初被鉴定为心脏和骨骼肌发育、分化与代谢的核心转录因子，后续研究发现其功能远超肌肉系统，广泛参与细胞增殖、迁移、凋亡、自噬和应激反应等关键生物学过程。例如氧化应激下MEF2A可通过激活PI3K/p-AKT/SIRT1通路延缓细胞衰老；过表达MEF2A可增强细胞抗凋亡能力，伴随Bcl-2表达升高和BAD表达降低；值得注意的是，高糖条件下敲低MEF2A可显著抑制心脏成纤维细胞增殖与迁移，提示MEF2A在糖代谢异常背景下具有重要作用。此外，MEF2A mRNA在皮肤组织中高表达，而角质形成细胞占人表皮细胞的90%，但MEF2A是否在糖尿病皮肤创面愈合过程中调控角质形成细胞功能尚待研究。本研究旨在探讨MEF2A对HG条件下角质形成细胞功能的影响及其潜在分子机制，利用自发性2型糖尿病db/db小鼠皮肤创面模型确定MEF2A在创面组织中的表达模式，并通过在高糖条件下建立人永生化角质形成细胞（HaCaT）MEF2A过表达模型，系统评估MEF2A对增殖、凋亡和迁移等关键细胞功能的影响并探索潜在机制。主要目标是研究MEF2A是否能促进角质形成细胞增殖、抑制凋亡并增强其迁移能力，以揭示MEF2A在糖尿病皮肤创面愈合中的潜在作用，为理解其分子机制提供新视角，并为探索治疗策略提供实验依据。
研究人员开展的研究与结论：本研究证实MEF2A在糖尿病小鼠创面组织和HG处理的HaCaT细胞中上调，其过表达通过激活PI3K/AKT信号通路改善HG诱导的角质形成细胞功能障碍，促进角质形成细胞增殖与迁移并抑制凋亡。这是首次揭示MEF2A-PI3K/AKT轴在糖尿病创面愈合中的调控机制，填补了MEF2A在该领域的研究空白，为糖尿病创面的临床治疗提供了新的潜在治疗靶点。
主要关键技术方法（不超过250字）：研究采用10周龄雌性自发性2型糖尿病db/db小鼠（C57BLKS背景，Leprdb纯合自发突变）及同龄雌性C57BL/6J野生型（WT）小鼠（db/db小鼠购自常州卡文斯实验动物有限公司，许可证号SCXK（苏）2021-0013；C57BL/6J小鼠由江苏华创信诺医药科技有限公司提供，许可证号SCXK（苏）2025-0012），建立全层皮肤创面模型，于创面后第0、3、7、11、14天监测随机血糖并拍摄创面、量化创面面积，第14天取材行H&E染色、免疫组化（IHC）、RT-qPCR和Western blot。体外以人HaCaT角质形成细胞在5 mM（正常葡萄糖，NG）或25 mM（HG）葡萄糖条件下培养，用MEF2A过表达质粒或空载体经Lipofectamine 3000转染，并于转染后48 h用20 μM LY294002处理30 min。采用MTT法检测细胞活力，免疫荧光（IF）检测Ki67和p-AKT
Ser473，Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测凋亡，Transwell和划痕实验评估迁移，Western blot检测MEF2A、Bax、Bcl-2、p-AKT
Ser473和AKT蛋白水平。
研究结果：
3.1 糖尿病小鼠皮肤创面组织中MEF2A表达升高：在WT C57BL/6J小鼠和自发性2型糖尿病db/db小鼠中建立全层切除皮肤创面模型，仅纳入空腹血糖≥16.7 mmol/L的db/db小鼠以确保稳定的糖尿病表型。db/db组血糖在创面后第0至14天稳定于约21–23 mmol/L，而WT小鼠维持NG水平约7 mmol/L，各时间点组间差异均有统计学意义（均p<0.0001），证实创面修复过程中持续高血糖。创面形态监测显示db/db小鼠创面闭合明显延迟，创面面积比定量分析显示db/db组创面闭合率自第3天起显著降低且随时间差距逐渐加大。第14天H&E染色进一步证实糖尿病创面再生能力受损：WT组创面区表皮连续、分层良好、细胞排列整齐，真皮胶原纤维致密有序（箭头所示），炎症细胞浸润极少；而db/db组表皮层破坏、细胞排列紊乱，胶原纤维稀疏、分布不规则，并伴大量炎症细胞浸润（星号所示）。RT-qPCR和Western blot分析显示，与WT对照相比，db/db小鼠MEF2A在mRNA和蛋白水平均显著上调。IHC染色进一步证实该发现并明确MEF2A在创面组织中的空间分布：WT创面中MEF2A免疫反应主要局限于表皮层且染色强度弱，真皮中几乎检测不到；而db/db创面切片中强烈的MEF2A阳性信号广泛分布于表皮和真皮层，半定量分析证实db/db组MEF2A总体表达显著增加。综上，糖尿病小鼠皮肤创面愈合显著延迟，伴创面组织中MEF2A表达明显升高，提示MEF2A可能参与糖尿病创面愈合受损的病理生理过程。
3.2 过表达MEF2A促进HG条件下HaCaT细胞增殖：创面愈合早期，创面边缘角质形成细胞的快速增殖对再上皮化和皮肤屏障恢复至关重要。研究人员以人永生化角质形成细胞系（HaCaT）为实验模型。首先检测HG应激对HaCaT细胞MEF2A表达的影响，细胞在NG（5 mM）或HG（25 mM）培养基中培养24 h后行RT-qPCR和Western blot分析，结果显示HG组MEF2A mRNA和蛋白水平均较NG组显著上调，与动物模型观察一致，提示MEF2A上调可能是应对HG诱导损伤、维持细胞稳态的代偿机制。为进一步阐明MEF2A对细胞增殖的直接调控作用，将HaCaT细胞转染MEF2A过表达质粒（MEF2AOE）或空载体对照（VectorOE），未转染HaCaT细胞设为基线对照；转染后48 h RT-qPCR分析证实MEF2AOE组MEF2A mRNA水平较VectorOE组显著升高，验证MEF2A过表达HaCaT细胞模型构建成功。随后在HG条件下进行功能验证，MEF2AOE和VectorOE细胞在HG培养基中培养24 h，RT-qPCR结果证实HG+MEF2AOE组MEF2A表达较HG+VectorOE组升高。MTT实验显示HG+MEF2AOE组细胞活力显著高于HG+VectorOE组，表明过表达MEF2A增强HG条件下HaCaT细胞活力。同时，NG条件下空载体转染未引起细胞活力较未处理HaCaT细胞的显著变化；过表达MEF2A轻度增加细胞活力，但差异无统计学意义。为确定活力增强是否归因于增殖能力改善，检测细胞增殖关键标志物Ki67表达，IF染色显示HG条件下过表达MEF2A细胞Ki67阳性信号较对照显著增加。NG条件下未处理组与空载体组Ki67染色强度无显著差异；过表达MEF2A引起Ki67表达轻度增加，但差异未达统计学意义。综上，上调MEF2A表达可促进HG条件下角质形成细胞增殖并改善细胞活力。
3.3 MEF2A抑制HG条件下HaCaT细胞凋亡：创面愈合依赖各阶段凋亡的精确调控，凋亡失衡（过度或不足）均可阻碍愈合过程；糖尿病创面中高血糖不利于细胞分化并改变凋亡通路，导致愈合受损。为探讨MEF2A在HG应激下对凋亡的调控作用，行Annexin V/PI染色及流式细胞术，结果显示与HG+VectorOE组相比，过表达MEF2A显著降低HG诱导的HaCaT细胞凋亡比例（早期与晚期凋亡细胞总计）（5.55% vs. 19.49%）。相反，NG条件下HaCaT细胞基础凋亡率较低，空载体转染未引起凋亡细胞比例较未处理HaCaT细胞的显著变化；过表达MEF2A轻度降低基础凋亡水平，但差异未达统计学意义，表明MEF2A的抗凋亡作用主要针对HG诱导的细胞损伤。为进一步阐明潜在分子机制，检测凋亡通路关键蛋白，Western blot分析显示HG条件下过表达MEF2A显著增加抗凋亡蛋白Bcl-2表达并降低促凋亡蛋白Bax表达；此外，过表达MEF2A明显降低下游凋亡执行通路关键效应分子caspase-3活性（27.09 U/mg prot）。上述发现表明MEF2A通过调节Bcl-2家族蛋白并抑制caspase-3活性，对HG诱导的HaCaT细胞凋亡发挥显著抑制作用。
3.4 MEF2A促进高糖损伤下HaCaT细胞迁移：角质形成细胞向创面中心的定向迁移是再上皮化和最终创面闭合的关键步骤。为探讨MEF2A对HG条件下HaCaT细胞迁移能力的影响，行细胞划痕愈合实验和Transwell迁移实验。划痕实验显示24 h后过表达MEF2A组创面闭合率显著高于HG+VectorOE组（51.67% vs. 30.38%）；一致的是，该促迁移作用在48 h仍稳定且显著，过表达MEF2A组创面闭合率仍明显高于对照组。NG条件下空载体转染较未处理HaCaT细胞未显著影响创面闭合率；过表达MEF2A在24和48 h均轻度促进细胞迁移，但未观察到统计学显著差异。Transwell实验进一步证实过表达MEF2A显著增加迁移细胞数（220 vs. 125）。综上，上调MEF2A显著增强HG条件下HaCaT细胞的迁移能力。
3.5 MEF2A通过激活PI3K/AKT信号通路促进高糖损伤HaCaT细胞增殖与迁移：尽管本研究已确立MEF2A调控细胞增殖与迁移的关键作用，其下游信号机制仍待阐明。既往研究提示MEF2A与PI3K/AKT信号通路激活之间存在潜在联系。作为经典细胞内信号级联，PI3K/AKT通路在细胞增殖、迁移、存活和代谢中发挥核心调控作用；通路激活以AKT磷酸化为特征，其中丝氨酸473位点磷酸化（p-AKT
Ser473）是AKT完全激活的关键指标和广泛使用的通路活性标志物。基于此，检测过表达MEF2A对AKT磷酸化的影响，Western blot分析及相应定量显示HG条件下过表达MEF2A（HG+MEF2AOE组）显著增加p-AKT
Ser473水平，而总AKT蛋白表达在各组间保持不变。该发现经p-AKT
Ser473免疫荧光染色进一步证实，HG+MEF2AOE组细胞质和细胞核中荧光信号均更强，半定量分析证实差异有统计学意义。上述数据表明MEF2A促进AKT磷酸化，但尚需确定该通路激活对MEF2A观察到的生物学功能是否必需。为此，使用特异性PI3K/AKT通路抑制剂LY294002在过表达MEF2A背景下抑制通路活性。Ki67 IF染色评估增殖状态显示，与HG+MEF2AOE组相比，HG+MEF2AOE+LY294002组Ki67荧光强度显著降低，表明抑制PI3K/AKT通路可逆转MEF2A过表达诱导的促增殖作用。此外，划痕愈合实验分析迁移能力显示，LY294002处理也显著减弱MEF2A过表达介导的迁移增强，HG+MEF2AOE+LY294002组24 h创面闭合率显著低于HG+MEF2AOE组（34.38% vs. 54.55%）。综上，本研究证明MEF2A通过增强AKT Ser473位点磷酸化激活PI3K/AKT信号通路；更重要的是，用LY294002抑制该通路显著逆转了MEF2A过表达介导的促增殖和促迁移作用。这些结果共同表明，MEF2A改善HG条件下角质形成细胞功能的能力依赖其对PI3K/AKT信号通路的调控。
讨论部分总结与结论翻译：创面愈合受损是糖尿病最常见且严重的并发症之一，全球约影响25%的糖尿病患者，导致创面闭合延迟、治疗周期延长、医疗费用增加和生活质量显著下降，构成重大公共卫生挑战。现有临床管理主要包括清创、血运重建、炎症控制和减压治疗，但疗效仍不理想，因此亟需阐明糖尿病创面愈合的分子机制并探索有效治疗新策略。本研究聚焦MEF2A在糖尿病创面愈合中的作用，发现：（a）MEF2A在糖尿病小鼠皮肤创面组织和暴露于HG的人永生化角质形成细胞（HaCaT）中表达显著上调；（b）过表达MEF2A增强HG条件下HaCaT细胞增殖能力，同时通过下调促凋亡Bcl-2家族蛋白表达和降低caspase-3活性显著抑制HG诱导的凋亡；（c）MEF2A通过增加AKT Ser473位点磷酸化水平正向调控PI3K/AKT信号通路，从而有效促进HG环境下HaCaT细胞的迁移能力。总之，研究提示MEF2A可能在糖尿病创面愈合中发挥保护作用，值得作为潜在治疗靶点进一步研究；据研究人员所知，本研究首次揭示MEF2A在糖尿病创面愈合中的关键作用。创面愈合是涉及炎症、增殖和重塑三个重叠阶段的高度协调动态过程，增殖期不仅衔接炎症消退，也是组织重塑不可或缺的前提，其效率直接决定肉芽组织形成和再上皮化的速度。该阶段中，成纤维细胞、血管内皮细胞和角质形成细胞等多种修复细胞被激活，通过定向增殖、迁移和细胞外基质（ECM）合成/沉积等高度有序的生物学活动协同修复组织缺损。角质形成细胞作为表皮主要功能细胞，依赖高效协调的增殖和迁移作为再上皮化的核心驱动力。然而研究显示，持续高血糖及伴随的胰岛素抵抗可导致包括角质形成细胞在内的多种细胞功能障碍（表现为蛋白代谢异常和内皮功能障碍），从而显著损害其增殖、迁移和再上皮化能力。因此，改善角质形成细胞功能对促进糖尿病创面愈合至关重要。本研究发现过表达MEF2A通过促进增殖和迁移并抑制凋亡有效增强HG条件下角质形成细胞的生理功能，为探索改善糖尿病创面愈合的新策略提供了重要实验证据。MEF2A基因位于人类染色体15q26.3，其编码蛋白属于肌细胞增强因子2（MEF2）家族，主要在细胞核内作为转录因子发挥作用。既往研究报道MEF2A在心脏及其他肌肉组织中的关键作用，并证明敲低MEF2A可通过调节Akt和TGF-β1/Smad信号通路抑制HG诱导的心脏成纤维细胞增殖与迁移。值得注意的是，MEF2A mRNA在皮肤组织中高表达，而参与创面愈合的角质形成细胞占人表皮细胞高达90%。然而MEF2A影响角质形成细胞功能和糖尿病创面愈合的具体机制尚不清楚。本研究不仅证实db/db小鼠糖尿病创面和HG诱导的HaCaT细胞中MEF2A表达上调，更重要的是首次揭示过表达MEF2A可有效改善HG诱导的角质形成细胞功能障碍，该作用涉及通过调控PI3K/AKT信号通路促进增殖与迁移以及抑制凋亡。PI3K/AKT信号通路是公认的众多关键细胞功能调控者，包括增殖、迁移、黏附、葡萄糖代谢和血管生成。PI3K作为细胞内磷脂酰肌醇激酶，催化PIP2磷酸化生成第二信使PIP3，进而激活AKT；活化的AKT通过磷酸化众多下游靶点促进细胞存活与增殖，如抑制BAD和Caspase-9等促凋亡蛋白，以及调控细胞周期相关蛋白如cyclins和CKIs。然而MEF2A是否以及如何通过促进AKT磷酸化影响HG条件下角质形成细胞功能此前未见报道，本研究通过阐明MEF2A-PI3K/AKT轴在改善高血糖条件下角质形成细胞功能中的作用填补了这一空白。本研究存在一定局限性：尽管已在体内验证MEF2A在糖尿病小鼠创面组织中的表达模式，但机制实验主要使用HaCaT细胞系，缺乏体内微环境复杂性，包括免疫细胞浸润、血管生成受损和全身代谢紊乱；糖尿病创面愈合涉及多种细胞类型和系统的协同作用，简单细胞模型无法完全重现高血糖和慢性炎症等病理生理条件下MEF2A的体内调控网络，因此MEF2A的作用需在糖尿病小鼠创面模型中进一步验证。其次，作为转录因子，MEF2A的功能活性依赖其下游靶基因；有报道HG诱导MEF2A从细胞核转位至细胞质，这种核质穿梭是调控转录因子活性的快速高效机制，已在FOXO、NFAT和p53等其他蛋白中广泛观察到；然而尽管本研究证实MEF2A通过PI3K/AKT通路调控细胞功能，其潜在分子机制仍待充分阐明，包括角质形成细胞中是否也发生此类转位、其直接靶基因的身份以及其与该通路相互作用的精确性质。最后，本研究聚焦HG环境，未涉及糖尿病创面其他关键病理因素，如晚期糖基化终末产物（AGEs）积累和氧化应激，MEF2A的作用及其与这些因素的潜在相互作用需进一步研究。结论翻译：糖尿病创面愈合是糖尿病的难治性临床并发症，本研究阐明了MEF2A在该过程中调控角质形成细胞功能的关键作用。研究人员证实MEF2A在糖尿病小鼠创面组织和HG处理的HaCaT细胞中上调，其过表达通过激活PI3K/AKT信号通路改善HG诱导的角质形成细胞功能障碍，促进角质形成细胞增殖与迁移并抑制凋亡。本研究首次揭示MEF2A-PI3K/AKT轴在糖尿病创面愈合中的调控机制，填补了MEF2A在该领域的研究空白，为糖尿病创面的临床治疗提供了新的潜在治疗靶点。
