PbAGO4依赖的PbNAC71启动子高甲基化调控梨花青素合成

《Journal of Integrative Plant Biology》：PbAGO4-dependent hypermethylation of the PbNAC71 promoter regulates anthocyanin synthesis in pear

　　

多年生果树中的芽变往往涉及表观遗传变异，但其 underlying 机制仍不清楚。研究人员鉴定了一个红皮梨‘奥红一号’的自然绿芽变体，该突变体在光照下不能积累花青素。整合甲基化组和转录组分析揭示，在突变体中，PbNAC71启动子内一个148-bp光响应增强子的高甲基化（由PbAGO4维持）抑制了PbNAC71的表达。在野生型中，该增强子保持低甲基化；而在突变体中，该增强子呈高甲基化；这种差异甲基化在幼果期即可检测到，并在所检测的采后阶段稳定维持，代表一种预设的表观遗传状态。沉默PbNAC71下调了PbMYB10和PbCHI1，并减弱了PbMYB10介导的对PbCHS1和PbDFR3的激活，从而抑制花青素积累。在愈伤组织中敲除PbAGO4以及在果皮中沉默PbAGO4均降低了增强子甲基化，并增加了PbNAC71表达和花青素积累。总之，这些结果揭示了一种机制，即PbAGO4依赖的光响应增强子甲基化建立了一种稳定的预设状态，从而控制环境光信号如何调控花青素合成。

研究背景方面，多年生果树的芽变育种是改良品种的重要途径，相比传统杂交育种可快速改善果实颜色等单一性状而不改变核心基因型。梨作为嫁接繁殖的多年生果树，在长期无性繁殖过程中可能积累DNA甲基化等表观遗传变异，进而改变关键调控基因表达，产生可遗传的表型变异。DNA甲基化是调控基因表达的关键表观遗传机制之一，植物中RNA介导的DNA甲基化（RdDM）通路负责从头建立甲基化：AGO4/6蛋白结合24-nt siRNA，引导DNA甲基转移酶DRM2至靶位点进行甲基化，随后由MET1和CMT3等酶维持。已有研究表明DNA甲基化参与果实成熟过程中多种品质性状的调控，且在果实色泽发育中发挥关键调控作用，如苹果中MdMYB1启动子CHH甲基化水平直接决定果皮着色程度，MdAGO4是建立该甲基化的关键因子；‘早酥’梨红色芽变源于PyMYB10启动子去甲基化激活花青素合成。然而，环境响应性转录因子与表观遗传调控之间的耦合机制尚不清楚，且前期研究多集中于MYB家族启动子甲基化，是否存在MYB家族以外的表观遗传靶点尚不明确。该研究以一个红皮梨‘奥红一号’的自然绿芽变为材料，该突变体在光照下不积累花青素，但其PbMYB10启动子甲基化水平与野生型无差异，提示存在未知的表观遗传调控节点。研究人员通过整合全基因组DNA甲基化测序（WGBS）和转录组测序（RNA-seq）并结合系统分子功能验证，旨在阐明梨果皮花青素合成的表观遗传调控机制。

研究人员开展了以下研究：以‘奥红一号’梨及其绿芽变体为材料，在套袋后0天和10天（即除袋后0天和10天）取样，命名为WT0、WT10、BM0和BM10，同时采集30 DAFB幼果样品；对四个样本组进行WGBS和RNA-seq，鉴定差异甲基化区域（DMRs）和差异表达基因（DEGs）；通过5‘-Aza（5-aza-2’-deoxycytidine，DNA甲基化抑制剂）处理果皮和愈伤组织验证DNA甲基化对花青素积累的抑制作用；利用TRV介导的基因沉默（VIGS）和CRISPR/Cas9技术在果皮和愈伤组织中功能验证PbAGO4；通过亚硫酸氢盐测序PCR（BSP）分析PbNAC71启动子甲基化水平；构建LUC和GUS报告载体验证148-bp光响应增强子功能；通过ChIP-qPCR验证PbAGO4与增强子的物理结合；通过酵母单杂交（Y1H）、凝胶迁移实验（EMSA）、双荧光素酶报告实验验证PbNAC71对下游靶基因的调控；通过酵母双杂交（Y2H）、Pull-down和双分子荧光互补（BiFC）验证PbNAC71与PbMYB10的蛋白互作。研究结论为：PbAGO4依赖的PbNAC71启动子光响应增强子甲基化建立稳定的预设状态，控制环境光信号对花青素合成的调控，将甲基化靶点从MYB家族拓展至NAC家族，揭示了果实着色调控网络的新层面，并为多年生果树的表观遗传育种提供了新策略。该论文发表在《Journal of Integrative Plant Biology》。

在关键技术方法方面，研究人员主要采用以下手段：对WT0、WT10、BM0、BM10四组梨果皮样品（每组三个生物学重复）进行WGBS和RNA-seq整合分析；使用5‘-Aza处理梨果皮和愈伤组织以抑制DNA甲基化；利用TRV介导的VIGS在梨果皮中瞬时沉默PbAGO4和PbNAC71，利用CRISPR/Cas9在梨愈伤组织中敲除PbAGO4；采用BSP检测PbNAC71启动子324-bp区域（含148-bp增强子）的甲基化水平；构建LUC和GUS报告系统验证增强子活性；通过ChIP-qPCR检测PbAGO4与148-bp增强子的结合；利用Y1H、EMSA和双荧光素酶报告实验验证转录调控关系；通过Y2H、Pull-down和BiFC验证蛋白互作。样本队列来源为山东潍坊临朐县梨实验基地的‘奥红一号’梨及绿芽变株系。

研究结果方面，第一，梨绿芽变的表型特征。研究人员从红皮梨品种中筛选到一个自然绿芽变体，套袋后除袋10天野生型果皮呈现典型红色素积累，而突变体果皮不显示红色素积累；花青素含量测定显示仅野生型样品有显著花青素积累，突变体在两个时间点均无显著变化，提示突变体花青素生物合成通路可能受到抑制。第二，全基因组DNA甲基化谱揭示CHH甲基化的特异性重分布。5‘-Aza处理显著促进梨果皮和愈伤组织花青素积累，并显著上调PbCHI1、PbCHS1、PbDFR3和PbMYB10表达，证实DNA甲基化负调控梨花青素积累。WGBS结果显示突变体与野生型整体DNA甲基化水平无显著差异，但CHH背景甲基化水平在突变体所有染色体区域显著升高；DMR分析显示CHH背景高甲基化DMR最为富集。TE甲基化分布分析表明CG和CHG背景差异甲基化主要富集于TE上下游2-kb区域且受光照显著影响，而CHH背景差异甲基化在突变体与野生型间于TE主体和侧翼区域均表现明显差异且较少受光照影响，表明CHH甲基化差异是区分突变体与野生型的内在特征。第三，转录组分析揭示芽变体中类黄酮通路受抑制。RNA-seq主成分分析显示四组样品组间差异清晰、组内重复性好；BM0 vs WT0、WT10 vs WT0和BM10 vs BM0分别鉴定到2,780、3,584和1,243个DEGs；Cluster 3的表达模式与花青素积累模式对应；KEGG富集分析表明BM0 vs WT0和WT10 vs WT0的DEGs显著富集于类黄酮生物合成和苯丙烷生物合成通路，而BM10 vs BM0的DEGs主要富集于苯丙烷生物合成和光合作用通路，未显著富集于类黄酮生物合成通路，进一步在转录水平证实突变体中花青素生物合成通路的特异性中断。第四，整合甲基化组和转录组鉴定候选甲基化调控的花青素合成调控因子。基因组功能区域甲基化分析显示BM0 vs WT0比较中CHH背景甲基化在CGI shore、启动子区域和重复序列区域升高；DMR与DEG关联分析表明基因表达水平与CHH甲基化密度总体呈负相关。将DEGs分为16个聚类，Cluster 2表达模式与花青素积累高度一致，其DNA甲基化主要富集于转录起始位点（TSS）上游，CHH甲基化富集程度高于CG和CHG；Cluster 2基因在BM0中TSS上游2-kb区域CHH甲基化水平高于WT0，而基因主体和下游2-kb区域无显著差异，CG和CHG甲基化水平无显著差异。值得注意的是，PbMYB10启动子甲基化在WT和BM间无差异，提示其差异表达非由局部DNA甲基化变化引起。Venn图分析鉴定到PbMYB73、PbMYB86、PbWRKY70、PbMYC3和PbNAC71五个转录因子基因在BM0 vs WT0和BM10 vs WT10比较中均同时表现为启动子高甲基化和转录下调，其中PbNAC71的表达模式在四组样品中与花青素积累高度一致。第五，PbAGO4作为花青素生物合成的负调控因子。RNA-seq分析显示PbCMT2在四组样品中表达水平较低，而PbAGO4、PbNRPE1、PbDCL3和PbNRPD2等多个RdDM核心组分在WT和BM中均可检测到；系统发育分析显示PbAGO4与苹果MdAGO4最近缘。TRV介导的PbAGO4瞬时沉默导致注射部位显著花青素积累和花青素生物合成基因上调；CRISPR/Cas9产生的两个独立PbAGO4突变愈伤组织系同样表现显著花青素积累和相关基因上调，证实PbAGO4作为花青素生物合成负调控因子的功能。RT-qPCR分析显示PbAGO4突变体中PbNAC71表达显著上调，提示其可能为PbAGO4的下游靶基因。第六，PbAGO4依赖的甲基化抑制PbNAC71的光诱导表达。IGV可视化分析鉴定到PbNAC71启动子TSS上游324-bp高甲基化区域（相对于TSS坐标?1,328至?1,004 bp），甲基化水平与PbNAC71转录丰度负相关；该区域甲基化水平在WT果皮中无论光照与否均保持低水平，而在BM果皮中在黑暗和光照条件下均持续高水平。BSP分析显示30 DAFB时该324-bp DMR甲基化水平在BM中已显著高于WT，表明差异甲基化至少在幼果期已建立并稳定维持至所检测的采后阶段。BSP结果显示PbAGO4突变体中该324-bp片段甲基化水平总体低于野生型，其中前148-bp区域（?1,328至?1,180 bp）降低最为显著。黑暗培养2周时PbAGO4-KO1、PbAGO4-KO2与野生型愈伤组织中PbNAC71表达无显著差异；72小时光照处理后PbAGO4-KO1和PbAGO4-KO2中PbNAC71表达显著上调，48小时达峰值后下降。PbAGO4-TRV侵染果皮中324-bp DMR甲基化显著降低，PbNAC71转录水平显著上调。第七，PbAGO4结合148-bp光响应增强子并维持其甲基化以抑制PbNAC71。148-bp关键片段顺式作用元件预测鉴定到两个光响应元件：3AF1结合位点和Box 4元件。LUC和GUS报告实验表明光照下长启动子（含148-bp片段）驱动的活性显著高于短启动子（缺失148-bp片段），证实148-bp片段是PbNAC71光诱导表达的关键顺式调控区域。ChIP-qPCR显示PbAGO4-Flag愈伤组织中148-bp片段显著富集，表明PbAGO4与该增强子物理结合。在PbAGO4-KO背景中通过RNAi敲低PbNAC71，与转EV的PbAGO4-KO1和PbAGO4-KO2相比，携带PbNAC71-RNAi的愈伤组织花青素积累显著减少，证实PbNAC71作为PbAGO4控制花青素生物合成的关键下游效应因子。第八，PbNAC71直接激活PbMYB10和PbCHI1促进花青素合成。亚细胞定位显示PbNAC71定位于细胞核。Y1H实验显示PbNAC71-AD与proPbCHI1-pHIS2或proPbMYB10-pHIS2共表达的酵母细胞在含60 mM 3-AT的SD/-Leu/-Trp/-His培养基上正常生长，而与proPbCHS1、proPbDFR3、proPbMYB1或proPbMYB114共表达的无生长。EMSA证实PbNAC71蛋白与PbCHI1和PbMYB10启动子特定片段结合，冷探针竞争可减弱结合，突变探针无结合。双荧光素酶报告实验表明PbNAC71显著激活PbCHI1和PbMYB10启动子驱动的LUC表达。瞬时过表达PbNAC71显著促进果皮花青素积累并上调PbCHS1、PbCHI1、PbDFR3、PbF3H1和PbMYB10表达；瞬时沉默PbNAC71显著抑制花青素积累并下调上述基因表达；稳定过表达PbNAC71的愈伤组织同样显著增强花青素积累和相关基因表达。第九，PbNAC71与PbMYB10互作增强对PbDFR3和PbCHS1的激活。亚细胞定位证实PbMYB10定位于细胞核。Y1H显示PbMYB10反式激活PbCHS1和PbDFR3启动子，但不激活PbCHI1、PbF3H1或PbMYB1启动子。EMSA证实PbMYB10蛋白直接结合PbCHS1和PbDFR3启动子特定探针。EMSA显示PbMYB10单独产生清晰迁移带，PbNAC71单独不产生可检测迁移带，而PbMYB10与PbNAC71共同孵育时迁移带强度较PbMYB10单独显著增强，表明PbNAC71通过蛋白-蛋白互作增强PbMYB10与PbCHS1和PbDFR3启动子的结合。AlphaFold3预测显示PbNAC71的GLU36与PbMYB10的ARG111形成关键氢键。Y2H、Pull-down和BiFC实验均证实PbNAC71与PbMYB10互作且互作发生于细胞核。双荧光素酶报告实验显示PbMYB10显著激活PbCHS1和PbDFR3启动子驱动的LUC表达，加入PbNAC71增强PbMYB10的激活效应。瞬时和稳定过表达PbMYB10均显著促进梨果皮和愈伤组织花青素积累并上调PbCHS1、PbCHI1和PbDFR3表达；沉默PbMYB10显著抑制花青素积累并下调上述基因表达。在过表达PbMYB10的果皮和愈伤组织中沉默PbNAC71显著降低PbMYB10诱导的花青素积累和相关基因表达，表明PbNAC71通过互作PbMYB10并促进其对PbCHS1和PbDFR3的激活来调控花青素生物合成。

讨论部分总结：该研究的独特之处在于从红皮梨‘奥红一号’单枝上鉴定到一个自然绿芽变体，通过WGBS和RNA-seq系统揭示了突变体果皮不能变红的分子机制，发现突变体中CHH甲基化的特异性重分布，并进一步鉴定到一个148-bp光响应增强子，其甲基化状态受PbAGO4调控，决定下游PbNAC71–PbMYB10–花青素生物合成基因级联，最终控制花青素合成。突变体与野生型间CHH背景DMR数量远高于CG和CHG背景，且DMR主要富集于TSS上游并与基因表达负相关，提示CHH甲基化在花青素调控中可能发挥重要作用。研究人员选择PbAGO4进行功能验证基于两点：其苹果同源基因MdAGO4已被报道通过CHH甲基化调控花青素积累，且AGO4是RdDM通路核心组分，为维持靶位点CHH甲基化所必需。该研究将甲基化靶点从MYB家族拓展至NAC家族，揭示了果实着色调控网络的新层面。该研究的核心机制突破在于148-bp增强子的精细定位及其预设甲基化调控：该增强子包含两个光响应元件（3AF1结合位点和Box 4），其甲基化状态在WT果皮中持续低水平、在BM果皮中持续高水平，不受光照影响，证实差异甲基化在所检测的采后阶段稳定维持而非受光动态调控。这种稳定的预设甲基化状态补充了光直接导向转录激活的经典模型：低甲基化允许光诱导转录，而高甲基化阻止之。与苹果中MdAGO4主要靶向MdMYB1启动子本身不同，该研究靶点为增强子区域，可能反映物种间RdDM调控精确性的差异。该预设甲基化调控概念与表观遗传编程的更广泛范式相呼应。该研究证明PbAGO4蛋白物理结合PbNAC71启动子148-bp增强子区域，且该增强子甲基化和PbNAC71转录抑制均依赖PbAGO4，将PbAGO4定位为维持该增强子甲基化状态所需的核心上游因子。精细定位的148-bp增强子为果实色泽改良提供了精确靶标，利用CRISPR/dCas9融合甲基修饰酶可定向改变该增强子甲基化状态，实现不改变核心基因型的果皮色泽精准调控；该增强子甲基化差异还可作为分子标记辅助选择的表观遗传标记。总之，该研究鉴定到光响应增强子的预设甲基化状态是梨花青素合成的关键决定因素，为果实着色的表观遗传调控提供了机制框架，不仅阐明了梨绿芽变形成的分子机制，也为多年生果树的表观遗传育种提供了新策略。研究结论部分翻译：总之，这些结果揭示了一种机制，即PbAGO4依赖的光响应增强子甲基化建立了一种稳定的预设状态，从而控制环境光信号如何调控花青素合成。